pEGFP-C3/Tsarg1融合蛋白在GC-1 spg细胞中的表达与定位

目的构建pEGFP-C3/Tsarg1真核表达载体并在GC-1spg细胞中表达,为研究Tsarg1在生精过程中的机制提供实验基础。方法应用RT-PCR从大鼠睾丸中扩增Tsarg1的开放阅读框(ORF),并将PCR产物插入到T载体中测序验证。随后,将Tsarg1cDNA片段亚克隆入载体pEGFP-C3,筛选阳性克隆,构建pEGFP-C3/Tsarg1真核表达载体。脂质体介导重组体pEGFP-C3/Tsarg1转染GC-1spg细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的表达与定位。结果成功构建了pEGFP-C3/Tsarg1真核表达质粒,EGFP-Tsarg1融合蛋白能够在GC-1spg细胞中表达,Tsarg1蛋白定位于细胞胞浆。结论 pEGFP-C3/Tsarg1真核表达载体的成功构建及带GFP标签的Tsarg1融合蛋白在GC-1spg细胞中的成功表达为进一步研究Tsarg1的生物学功能奠定了基础。     

GFP-MOMP融合蛋白在真核细胞中的表达与鉴定

目的 构建GFP-MOMP融合蛋白真核表达重组质粒pEGFP／MOMP，利用脂质体体外转染Heb细胞，观察MOIMP在真核细胞中的表达。方法 PCR法从D型Ct基因组中扩增MOMP全长基因，克隆至pEGFP真核表达载体的相应位点，进行序列分析和酶切鉴定后，脂质体介导重组体pEGFP／MOMP转染Heb细胞，荧光显微镜、Western blot鉴定MOMP基因的表达。结果 PCR扩增得到约1．2kb的特异性MOMID基因片段；成功的构建真核表达重组体pEGFP／MOMP；重组质粒pEGFP／MOMP在HeLa表达出约71kDa大小的融合蛋白。结论 GFP-MOMP能够在体外真核细胞中表达，为进一步研究该蛋白的生物学功能及核酸疫苗的制备提供实验依据。     

通用型10-23脱氧核酶表达载体的构建及其在巨噬细胞中的表达

[目的]构建一种新型10-23脱氧核酶(Deoxyribozyme,DRz)的真核表达载体,并鉴定其在细胞内表达10-23DRz的能力. [方法]设计一条包含莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MLV-RT)引物结合序列、多克隆酶切位点及逆转录终止信号序列的寡脱氧核糖核苷酸ODN-PSL,并将其插入框架质粒pBUDCE4.1中PCMV的下游,获取重组质粒pBUD-PSL.通过二步亚克隆将MLV-RT的编码基因克隆至pBUD-PSL中另一启动子PEF-1α的下游,获取重组质粒pS-DE01.将pSDE01转染入巨噬细胞RAW264.7中,RT-PCR法鉴定MLV-RT的表达及逆转录酶活性.设计一taco基因特异性的10-23DRz-DZ1,并将其表达序列克隆入pSDE01中,获取重组表达载体pSDE01-DZ1.将pSDE01-DZ1转染入巨噬细胞RAW264.7中,分别经PCR和斑点杂交法检测DZ1在细胞内的表达. [结果]限制性内切酶酶切及测序结果显示pSDE01构建成功,将其转染入巨噬细胞RAW264.7后检测到了MLV-RT的表达,而且表达产物具有逆转录酶活性.pSDE01-DZ1转染入RAW264.7细胞后,经PCR和点杂交方法均检测到了DZ1的表达. [结论]成功构建了一种操作简便的通用型10-23DRz表达载体,该载体可在真核细胞内有效表达特异性10-23 DRz.     

巨噬细胞抑制因子在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的:在毕赤酵母表达系统中获得巨噬细胞抑制因子(MIC-1)高效分泌表达,并鉴定其免疫活性。方法:从BeWo细胞系中提取总RNA,通过反转录PCR获得目的片段,然后将基因亚克隆入pPIC9k表达载体,线性化后转化GS115酵母细胞,经G418抗性筛选获多拷贝重组子并诱导表达,PCR鉴定目的基因的整合。表达产物用Westernblot鉴定生物活性。结果:经过G418筛选到34株阳性克隆,MIC-1蛋白最高表达量为6.332mg/L。结论:成功构建了MIC-1表达载体,在酵母中获得多拷贝高效表达,并且形成正确的蛋白结构。     

hDaxx高表达抑制地塞米松诱导的HeLa细胞凋亡

目的利用真核表达载体pEGFP/hDaxx在HeLa细胞中高表达hDaxx,研究hDaxx对HeLa细胞凋亡的影响.方法将pEGFP/hDaxx转染HeLa细胞,Western-blotting鉴定GFP-hDaxx融合蛋白的表达,荧光显微镜观察GFP-hDaxx融合蛋白在细胞内的表达及定位,用地塞米松诱导HeLa细胞凋亡,细胞用Giemsa染色后,观察细胞形态变化并计算HeLa细胞凋亡率.结果GFP-hDaxx融合蛋白在HeLa细胞中成功表达并定位于细胞核.地塞米松对照组与pEGFP对照组凋亡率无显著性差异(P＞0.05),而pEGFP/hDaxx组凋亡率显著降低(P＜0.01),即hDaxx即时高表达降低地塞米松诱导的HeLa细胞凋亡率.结论Daxx为调控蛋白,GFP-hDaxx融合蛋白在HeLa细胞中表达并定位于细胞核,且hDaxx即时高表达抑制地塞米松诱导的HeLa细胞凋亡.     

融合蛋白表达载体MK—EGFP的构建及其在不同肿瘤细胞中的定位

MK（Midkine）是一种肝素结合性生长因子,最初发现与细胞生长、迁移和存活有关,随后的研究发现它在多种人源恶性肿瘤中高表达。新近研究显示MK能促进Wilm’s瘤细胞和成纤维细胞的生长、NIH3T3细胞的转化、用顺铂处理Wilm’s瘤细胞的抗凋亡活性以及诱导兔角膜强烈的血管生成应答。     

细胞因子在矽肺患者肺泡巨噬细胞培养上清液中的表达及其意义

目的探讨肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)分泌的6种与肺纤维化有关的细胞因子与矽肺发生发展的关系。方法以29例矽肺患者和3例异物吸入者及3例接尘时间不超过3个月的接矽尘工人为调查对象,收集其肺灌洗回收液,AM分离纯化后37℃培养24h,收集培养上清液,采用人的ELISA试剂盒检测培养上清液中的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素1β(interlukin,IL-1β)、IL-8、转化生长因子-β1(transforming growth factor beta,TGF-β1)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(macrophage inflammatory protein 1α,MIP-1α)及单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的表达水平,分析其与矽肺的关系。结果矽肺患者AM培养上清液中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、IL-8及MCP-1水平均高于对照组(P<0.05),贰期以上患者TNF-α、MCP-1的表达水平高于壹期,TGF-β1则低于壹期患者(P<0.05);持续接触矽尘者IL-1β、TGF-β1和MIP-1α的表达水平高于脱尘者,TNF-α则呈相反的趋势;发病工龄<15a者IL-1β表达水平低于发病工龄≥15a者,MCP-1的表达水平则呈相反的趋势;IL-1β、TNF-α及MCP-1表达水平均与脱尘年限呈负相关。结论矽尘诱发的纤维化有关的炎性细胞因子的差异表达在矽肺发病及进展中起重要作用。     

人基因XAPC7在肺腺癌细胞及组织中的表达和定位

目的了解XAPC7在肺腺癌细胞和组织中的表达及定位情况,为后续的功能研究提供线索。方法首先采用Western-blot技术检测XAPC7在HBE135-E6E7正常支气管上皮细胞株、A549肺腺癌细胞株、NCI-H446小细胞肺癌细胞株中的表达;再用细胞免疫荧光技术,以HBE135-E6E7和A549细胞为研究对象,用鼠抗人XAPC7单克隆抗体分析该蛋白的细胞定位情况;最后利用免疫组织化学法随机检测34例肺腺癌及相应癌旁组织中XAPC7蛋白的定位及表达。结果 Western-blot显示：与HBE135-E6E7相比,XAPC7在NCI-H446中表达明显降低（P〈0.05）,在A549中表达有所增加,但差异无统计学意义（P〉0.05）。激光共聚焦显微镜观察发现XAPC7在A549中主要定位于细胞浆,胞核中少见,而在HBE135-E6E7中除胞浆外,胞核中也有较多分布。免疫组化显示：XAPC7在肺腺癌和肺鳞癌组织细胞的胞浆和胞核中均有表达。在34例肺腺癌中,癌组织胞浆中XAPC7蛋白的表达明显高于癌旁组织胞浆的表达（Z=-4.341,P=0.000）,而在癌组织与癌旁组织的胞核中XAPC7蛋白的表达差异无统计学意义（Z=-0.167,P=0.867）。另外,XAPC7蛋白的表达与年龄、性别、肿瘤大小、组织分化和有无淋巴结转移无关（P均〉0.05）。结论 XAPC7在肺腺癌细胞株中有表达,主要定位于胞浆。在肺腺癌组织和癌旁组织胞浆中的表达差异有统计学意义,为后续研究打下了基础。     

石棉与巨噬细胞

石棉与巨噬细胞广东药学院微生物教研室（广州市宝岗，５１０２２４）邓志爱巨噬细胞是机体保持稳态、抗感染、抗肿瘤等的重要细胞。近年的研究表明：肺泡巨噬细胞（ＡＭ）在石棉致纤维化方面亦起着重要的作用。一、石棉对巨噬细胞的作用１．石棉可导致ＡＭ的聚集。Ｂｒｏ...     

PTD-Lmp-3融合蛋白的纯化、表达和鉴定

目的构建融合蛋白PTD-Lmp-3的表达质粒,并进行诱导表达、纯化及鉴定。方法利用基因重组技术构建pET43.1a-PTD-Lmp-3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达融合蛋白,经Ni2＋-NTA层析纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白。结果成功构建了表达质粒pET43.1a-PTD-Lmp-3,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,经IPTG诱导表达的总菌体蛋白在融合蛋白的相应位置PTD-LMP-3约为22 kD,可溶性分析发现融合蛋白主要以上清形式存在,纯化后得到了目的蛋白。Western blot鉴定显示表达蛋白具有抗原性。结论成功构建了PTD-Lmp-3的重组表达载体,使融合蛋白在大肠埃希菌BL21（DE3）中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白,为进一步研究奠定了基础。     

风疹病毒E1蛋白与DsbA蛋白原核融合表达及应用

目的 利用DsbA蛋白分子伴侣性质,原核系统内可溶性表达风疹病毒E1蛋白并进行纯化,用于检测风疹病毒特异性抗体IgM. 方法 将PCR扩增的风疹病毒E1核酸序列克隆至融合表达载体pET-DsbA中,依次进行表达和亲和纯化,利用产物建立IgM捕获ELISA方法鉴定DsbA-E1融合蛋白的抗原性及实用性. 结果 表达纯化的E1蛋白经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份抗风疹病毒IgM阳性血清和60份健康人血清,其中阳性血清检出例数为45例,检出率为75％;健康人血清检出1例,检出率为1.7％,特异度为98％;用酶标记E1蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率98.3％ (59/60),阴性检出率100％,初步表明E1蛋白抗原表位有较好的抗原特异性. 结论 融合蛋白DsbA-E1在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在,该重组蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测风疹病毒抗体.     

GFP—ICP0融合蛋白高表达增强活化巨噬细胞分泌TNF—α和IL-1β

目的研究GFP—ICP0融合蛋白瞬时高表达对活化巨噬细胞分泌活性的影响。方法构建GFP—ICP0融合蛋白真核细胞表达载体pEGFP／ICP0。将其转染巨噬细胞，用荧光显微镜观察GFP—ICP0融合蛋白在巨噬细胞内的表达与定位，并利用Western blot检测表达产物。通过GFP—ICP0融合蛋白在巨噬细胞内的瞬时高表达，在LPS诱导激活巨噬细胞后12、24、48h时，测定活化巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β的含量。结果GFP—ICP0融合蛋白在巨噬细胞内瞬时高表达且定位于细胞核。GFPICP0融合蛋白在巨噬细胞内的高表达，使LPS诱导活化的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β量明显增加（在12、24与48h时与对照组差异有显著性，P〈0．01）。结论ICP0即时高表达可上调．活化巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β。     

结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的基因,将目的基因克隆到pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。进行质粒的酶切鉴定和序列分析;对重组的大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析菌体蛋白,凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况,Western-blot鉴定融合蛋白。结果正确构建了pGEX-PPE60融合表达载体,载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的50%。该融合蛋白能与GST抗体产生阳性反应。结论成功构建了GST-PPE60融合蛋白的表达载体,并能在大肠杆菌中高效表达,为PPE60蛋白的功能研究奠定了基础。     

硒结合蛋白1在妇科肿瘤中的表达

通过硒结合蛋白的调控,硒可以抑制癌症的发展和肿瘤的生长,研究发现前列腺、胃、结肠和肺癌硒结合蛋白1表达量减少,关于妇科肿瘤中硒结合蛋白1的作用未见报道。针对硒结合蛋白1在妇科肿瘤中的表达进行深入探讨。     

球囊成形术后氯沙坦对兔血管内膜增殖及巨噬细胞表达的影响

目的　通过观察AT1受体的特异性拮抗剂氯沙坦 (Losartan)对兔腹主动脉球囊成形术后内膜增殖和巨噬细胞表达的影响 ,探讨氯沙坦治疗血管再狭窄的机制。方法　采用内皮剥脱加高脂饮食 (含 1 5 %胆固醇 )喂养 8周制作兔腹主动脉粥样硬化膜型 ,然后对狭窄部位行球囊成形术。术后氯沙坦组给予氯沙坦 10mg·kg-1·day-1口服 ,对照组喂生理盐水。 4周后取腹主动脉行组织形态学观察 ,用免疫组织化学方法分析巨噬细胞。结果　对照组内膜厚度 /中膜厚度比值为 0 65± 0 17,氯沙坦组则减少为0 44± 0 11(P <0 0 1) ,对照组内膜面积 /中膜面积比值为 0 74± 0 16,氯沙坦组则减少为 0 5 4± 0 13(P <0 0 1)。氯沙坦组新生内膜中巨噬细胞数亦较对照组显著减少 (P <0 0 1)。结论　氯沙坦通过抑制AngⅡ的作用进而抑制巨噬细胞的浸润 ,抑制炎症反应 ,从而减轻再狭窄     

巨细胞病毒gp52蛋白原核可溶性表达与应用

目的 生物工程方法在原核系统内可溶性表达巨细胞病毒gp52蛋白并进行纯化,获得可以用于检测巨细胞病毒特异性抗体的重组抗原. 方法 利用PCR扩增获得巨细胞病毒gp52核酸序列,然后克隆至pET-DsbC核融合表达载体中,在原核系统进行诱导表达并纯化,用Western blot和ELISA检测其抗原性及实用性. 结果 表达纯化的Ds-bC-gp52融合蛋白分别经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份抗巨细胞病毒IgM阳性血清和60份阴性血清.其中用酶标记DsbC-gp52蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率达96.6％,阴性检出率100％. 结论 融合蛋白DsbC-gp52在大肠杆菌中主要以可溶性表达形式存在,获得的高纯度融合蛋白抗原性和特异性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于临床检测风疹病毒的早期感染.