DAPT对小鼠造血干细胞生物活性的影响

本研究探讨DAPT(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L:-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester)对小鼠骨髓造血干细胞(HSC)细胞周期、凋亡、分化及扩增的影响及其可能的相关机制。运用实时定量PCR检测DAPT1μmol/L作用前后细胞周期相关基因p18、p21、p27、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA表达水平及凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-xl、mcl-1、Bax、Bim、p53、Puma mRNA表达量的水平;用流式细胞术检测DAPT作用前后小鼠骨髓细胞Lin-c-kit+Sca-1+及CD34-Lin-c-kit+Sca-1+表型细胞的细胞周期及凋亡的变化;用单细胞培养检测DAPT作用前后单个HSC分化的变化;用长周期培养实验检测DAPT作用前后HSC扩增能力的变化。结果显示,Lin-c-kit+Sca-1+表型细胞经DAPT处理5 d后,小鼠骨髓细胞中细胞周期相关基因CDK1、CDK2、CDK4、CDK6及p27的mRNA表达量较对照组明显升高(P<0.01-P<0.001),p18和p21表达量明显降低(P<0.01-P<0.001);凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-xl、Bax、p53、Puma表达量较对照组明显升高(P<0.01-P<0.001),Bim表达量明显降低(P<0.001),Mcl-1的表达量无差异。加DAPT处理5 d后,小鼠骨髓细胞Lin-c-kit+Sca-1+表型细胞的细胞周期的变化无统计学意义(P>0.05),小鼠骨髓细胞CD34-Lin-c-kit+Sca-1+表型细胞的G0期的细胞减少,G1期的细胞明显增多(P<0.05),处于S、G2、M期的细胞数量的变化无统计学意义(P>0.05);小鼠骨髓细胞Lin-c-kit+Sca-1+表型细胞和CD34-Lin-c-kit+Sca-1+表型细胞的细胞凋亡增多(P<0.05)。单细胞培养10 d实验显示,每板形成的克隆数、每孔平均细胞数的变化及DAPT对单个造血干细胞分化影响的差异均无统计学意义(P>0.05)。DAPT处理3 d后,小鼠骨髓细胞中HSC的扩增能力下降。结论:DAPT可加速小鼠骨髓细胞CD34-Lin-c-kit+Sca-1+表型细胞的耗竭,促进小鼠骨髓细胞Lin-c-kit+Sca-1+及CD34-Lin-c-kit+Sca-1+表型细胞的凋亡,降低小鼠骨髓细胞中HSC的扩增能力,但对单个CD34-Lin-c-kit+Sca-1+表型细胞的增殖及分化无明显影响。     

不同氧浓度培养对小鼠骨髓造血干细胞生物活性的影响

本研究模拟人外周血造血干细胞(HSC)移植中HSC所经历的氧环境,研究不同氧浓度对小鼠骨髓HSC生物功能的影响及可能机制。采用体外扩增实验、定向分化实验、细胞周期分析、活性氧测定及亚致死量射线照射小鼠骨髓原始Lin-c-kit+Sca-1+HSC移植等方法,分别检测了Lin-c-kit+Sca-1+HSC的扩增能力,细胞周期,活性氧水平及造血重建能力。结果表明:低于常氧浓度,特别是乏氧的氧环境能降低活性氧的产生,增强原始骨髓HSC体外扩增能力,增加红系集落(BFU-E)、粒单集落(CFU-GM)、红系粒单系巨核系集落(CFU-GEMM)的数量,维持较多的HSC处于G0/G1期,进而明显促进移植后小鼠的脾集落(CFU-S)生长及提高移植小鼠存活数量。而暴露于常氧、不恒定且氧浓度变化剧烈的氧环境中的骨髓HSC能产生较高水平的活性氧,上述功能指标都较低。结论:骨髓HSC的活性氧水平与周围氧环境中氧浓度水平及稳定性密切相关,高水平的活性氧损害骨髓HSC的功能。在恒定的较低浓度的氧环境下培养及应用抗氧化剂对于骨髓HSC移植可能更有益。     

小鼠骨髓间充质干细胞对胚胎干细胞造血分化的影响

骨髓间充质干细胞作为骨髓基质细胞的前体细胞 ,在体外具有一定的造血支持作用 ,与造血干细胞共移植可促进其植入。本研究旨在初步探讨应用小鼠骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养作为一种新的分化体系的可行性。首先分离、培养并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞 ,然后利用扩增培养的骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养 ,通过造血集落培养和RT PCR观察造血分化的特点。结果表明 ,分离、扩增培养至第四代之后的骨髓间充质干细胞形态均一 ,高表达Sca 1,CD2 9,CD4 4和CD10 5 ,而CD34和CD4 5等造血与内皮细胞特异性表面标志呈阴性 ;特异性诱导体系内传代后 (>4代 )的骨髓间充质干细胞可向脂肪细胞和成骨细胞分化。与悬浮分化体系相比 ,骨髓间充质干细胞共培养体系中初始分化的胚胎干细胞含有显著增加的拟胚体形成细胞而没有造血集落形成细胞。此外 ,RT PCR检测发现 :共培养细胞表达胚胎干细胞特异性转录因子Oct 4 ,而造血标记Flk 1,GATA 1和 β H1为阴性。结论 :间充质干细胞在一定程度上抑制了胚胎干细胞的初始分化 ,但是共培养体系来源的拟胚体产生造血集落的能力显著高于悬浮体系     

细胞因子对小鼠造血干细胞基因转移效率影响的实验研究

细胞因子对小鼠造血干细胞基因转移效率影响的实验研究王存邦达万明钱其军冀孟菊魏亚明我们观察了造血干细胞因子（ＳＣＦ）、白细胞介素（ＩＬ）３、ＩＬ６不同组合方式对小鼠造血干细胞基因转移效率的影响，以期发现能有效地提高基因转移效率的细胞因子或其组合。材...     

影响造血干细胞归巢机制的研究

造血干细胞移植（HSCT）已成为血液学基础研究和临床研究中一个活跃领域,是目前治疗一些难治性血液病及急重度放射病的有效措施。造血干细胞（HSC）植入率是影响HSCT成功的关键之一,干细胞归巢的能力反映其植入效率,归巢受HSC性能和受体造血微环境影响,其中主要涉及细胞粘附分子（CAMs）表达、细胞周期状态、基质细胞与细胞因子作用和龛位腾空等。本文就这方面的研究进展进行综述。     

造血干细胞的研究进展

造血干细胞具有自我更新和多向性分化潜能,尤其神经干细胞移植后能产生各种血细胞类型以及CD34^-Lin^-细胞群体,经HESS－5基质细胞滋养并补充生长因子,转移得到CD34^ ,SRC检测人－鼠造血干细胞异体移植重建造血,为进一步认识和研究干细胞创建新开端。     

按造血发育程序诱导小鼠胚胎干细胞为造血干细胞重建体内造血的实验研究

为研究小鼠胚胎干细胞(ESC)定向诱导分化为造血干细胞(HSC)在体内重建造血的功能,将小鼠E14ESC诱导为拟胚体(EB),EB细胞利用Transwell非接触共培养体系在人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞饲养层上依次诱导,收获各阶段EB细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,并接种于NOD-SCID小鼠以检测体内致瘤性。再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植到经致死量60Coγ射线照射的BALB/c雌鼠,将受鼠随机分为5组:①AGM组,②AGM+FL组,③AGM+FL+BM组,④照射对照组,⑤正常对照组。观察各组生存率、造血重建和植入状况。结果显示:EB细胞经人AGM区和FL基质细胞共培养后Sca-1+c-Kit+细胞达到峰值(21.96±2.54)%;NOD-SCID小鼠在接种经人AGM区基质细胞诱导的EB细胞后可出现畸胎瘤,而接种经人AGM区+FL基质细胞诱导EB细胞后未见肿瘤形成;AGM组及照射对照组动物全部死亡,而AGM+FL组及AGM+FL+BM组生存率分别为77.8%、66.7%,移植后21天外周血象基本恢复,在存活受鼠检测到供体来源Sry基因。结论:按胚胎造血发育程序,体外经人AGM区、FL及BM基质细胞连续诱导小鼠ESC分化的HSC可安全、有效地重建体内造血。     

GATA-2过表达对小鼠胎肝造血干细胞功能的影响

本研究探讨GATA-2过表达对小鼠胎肝造血干细胞功能的影响。应用带GFP绿荧光的逆转录病毒载体介导的病毒感染实验将GATA-2基因引入小鼠胎肝细胞,通过流式免疫荧光术、细胞周期检测及集落形成实验等技术手段研究这些GATA-2过表达胎肝造血干细胞的生物学功能变化。研究结果表明:过表达GATA-2的胎肝细胞中Lin-Sca1+C-Kit+(LSK)细胞比例显著增加,LSK细胞周期未受太大影响,但其定向克隆形成能力受抑。结论:过表达GATA-2引起小鼠胎肝造血干细胞LSK比例增加,并抑制其定向分化能力,其机制可能与HES-1表达上调导致细胞在干/祖细胞阶段受阻滞有关。     

单倍体相合造血干细胞移植联合间充质干细胞输注对患者造血微环境的影响

本研究探讨骨髓源间充质干细胞对单倍体相合异基因造血干细胞移植后患者造血微环境的影响。选择间充质干细胞联合造血干细胞移植的15名患者为研究组,单纯造血干细胞移植的20名患者为对照组,抽取35名患者移植后不同时期骨髓标本47份,进行MSC培养,观察MSC能达到原代融合的例数及其融合时间;从移植前开始抽取患者外周血以检测中性粒细胞和血小板的水平;每隔4天留取患者外周血浆标本,用ELISA检测SDF-1α、TPO及IL-11的浓度,观察两组之间浓度动态变化的差异。结果表明,研究组MSC体外原代融合率(60%)明显高于对照组(27.3%)(p0.01),且两组原代融合时间分别为27.13±4.41天与36.09±11.84天(p0.05)。回输组SDF-1α浓度在移植第8天达最高峰(2975.19±681.56pg/ml),较移植前(2403.70±522.39pg/ml)升高(p0.05),对照组SDF-1α浓度在移植后第16天达最大值(2280.60±701.25pg/ml),较移植前(2701.46±483.21pg/ml)减少(p0.05)。从移植后第16天至第28天,研究组TPO和IL-11的浓度均高于对照组(p0.05)。结论:联合间充质干细胞移植能明显改善单倍体相合异基因造血干细胞移植患者骨髓微环境的损伤状态。     

丹参素对小鼠外周血造血干细胞动员作用的研究

目的:探讨丹参素对小鼠外周血造血干细胞的动员作用及其对小鼠外周血细胞和骨髓基质细胞黏附分子的影响。方法:30只BALB/c小鼠随机分为三组:丹参素组、G-CSF组、生理盐水组,腹腔注射d1～d7,每日1次,第2～8天,采用外周血WBC和MNC计数、流式细胞术、造血祖细胞体外培养、免疫细胞化学等检测各组给药后对外周血WBC、MNC、CD34+细胞、CD49d阳性细胞、CFU-GM、CFU-MK、CFU-E的产率及小鼠骨髓基质细胞VCAM-1阳性细胞百分率的影响。结果:丹参素组给药第7天外周血WBC、MNC数量达到高峰,分别为给药前的3倍和3.5倍;丹参素组外周血CD34+、CD49d阳性细胞及骨髓基质细胞VCAM-1阳性细胞百分率分别为(1.03±0.24)%、(12.59±2.64)%和(50.86±8.77)%,均明显高于生理盐水组(P<0.05);其CFU-GM、CFU-MK和CFU-E产率分别为(14.90±2.88)%、(12.50±4.06)%和(16.10±6.36)%,均明显高于生理盐水组(P<0.01)。结论:丹参素对小鼠外周血造血干细胞有一定的动员作用,且这一作用可能与其上调小鼠外周血细胞和骨髓基质细胞黏附分子的表达有关。     

抗氧化剂在保护造血干细胞生物学功能方面的作用简

在外周血造血干细胞移植中,骨髓造血干细胞（bone marrow hematopoietic stem cells,BMHSC）的动员及其在外周血液高氧环境中的循环都增加了活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生,这对BMHSC的生物学功能起到了抑制性的作用.本研究在BMHSC的培养中,应用维生素C的衍生物——抗坏血酸磷酸酯盐（ascorbic acid 2-phosphate,AA2P）来抑制ROS产生,并模仿其在外周血造血干细胞移植中的氧环境,通过体外增殖实验、流式分选技术、活性氧测定、CD34＋造血干细胞移植等实验来评价上述培养方法对BMHSC生物学功能的保护作用.结果表明：体外培养的BMHSC的ROS水平明显高于新鲜分离的BMHSC;同时,扩增的AC133＋ CD34＋早期红系细胞集落形成单位（BFU-E）、粒-单核细胞集落形成单位（CFU-GM）、粒-单核细胞混合集落形成单位（CFU-GEMM）的数量、细胞迁移率、人重症联合免疫缺陷鼠（SCID）移植重建细胞的数量都要明显高于在不含AA2P的环境中培养的造血干细胞.结论：抗氧化剂的干预是在外周血造血干细胞移植过程中保护HSC生物学功能的一种有效手段,并能够提高外周血造血干细胞移植的治疗效果.     

间充质干细胞在造血调控中的作用

间充质干细胞（MSC）作为造血微环境主要细胞成分的来源，具有自我更新和多向分化的潜能，通过与造血细胞直接接触、分泌细胞外基质及多种细胞因子维持造血微环境结构和功能的完整性，进而实现对造血的精细调控。本文结合近几年来国内外MSC的研究进展，就MSC在造血调控中的作用，诸如MSC分泌多种支持造血的细胞因子，MSC表达与造血细胞相互作用的黏附分子，联合移植MSC对造血重建的支持作用及其临床应用前景作一综述。     

造血干细胞与基因治疗

国际上临床基因治疗从1991年开始,至今有关的基础研究已取得很大进展,但一些重大难题尚未解决。例如:基因转染的载体、目的基因体内转染的靶向性、目的基因在体内表达的水平和时间的调控以及有治疗效果基因的选择和寻找等。美国几例ADA基因治疗病例,其带有目的基因的细胞在病人体内维持时间太短。为了使目的基因能在病人体内长期或永久地表达,必须选一种能在体内自我更新和自我维持的永不消亡的细胞,作为目的基因的宿主细胞。于是,造血干细胞便成为最理想的目的基     

氧浓度对人骨髓造血干／祖细胞生物功能的影响

骨髓乏氧环境对完整保持骨髓造血千／祖细胞（bone marrow hematopoietic stem cells。BMHSC）是适宜的。外周血干细胞移植（peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT）中,外周HSC常氧下体外扩增及移植前后,HSC暴露于浓度差别显著的氧环境下,HSC的生物学功能是否受到影响值得研究。本研究模仿人外周血造血干细胞移植（peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation,PBHSCT）中BMHSC所经历的氧环境,通过体外扩增及凋亡实验、细胞周期分析及定向分化实验、细胞迁徙实验等来研究氧浓度变化对人BMHSC生物功能的影响。结果表明：浓度低于常氧,特别是乏氧的氧环境能使BMHSC扩增更多的较原始的AC133^＋CD34^＋HSC和有活性的CD34^＋HSC,维持较多的干细胞处于G0／G,期,促进各系集落（BFU—E、CFU—GM、CFU—GEMM）的生长,更好地维持HSC的迁徙能力。而暴露于常氧、不恒定且氧浓度变化剧烈的氧环境中的BMHSC,上述功能指标都较低。结论：PBSCT中BMHSC的生物功能与细胞周围氧环境中氧浓度高低及稳定性密切相关,在浓度较低的氧环境下培养BMHsc可能对PBSCT更有益。     

体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干 / 祖细胞的研究简

本研究探讨体外诱导人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）分化为造血干/祖细胞的能力.在体外用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类iPSC共培养的方法,将iPSC诱导分化为造血干/祖细胞;用流式细胞术检测造血干/祖细胞表面标志物的表达水平;用实时定量PCR检测分化过程中iPSC及造血干/祖细胞的相关基因mRNA表达水平的变化;用免疫磁珠法分离CD34＋造血干/祖细胞并进行半固体集落形成实验检测细胞的集落形成能力.结果表明,iPSC与OP9细胞共培养诱导造血分化的第4天即可观察到iPSC形态变化;流式细胞术检测显示,分化得到的细胞表达已知的造血干/祖细胞相关表面标志物CD34和CD43分子.在体外分化过程中多能性的标志基因Oct4的表达逐渐下降,造血相关转录因子Gata-2的表达逐渐升高,而Runx-1的表达量则呈波浪式变化,CD34表达量逐渐升高.集落培养14 d能够得到红系集落（CFU-E）,粒系集落（CFU-G）,巨核系集落（CFU-M）,粒-巨核系集落（CFU-GM）和混合系集落（CFU-GEMM）.结论：iPSC细胞能够在体外通过与OP9细胞共培养分化为造血干/祖细胞.     

我国造血干细胞基础研究的新进展兼论干细胞可塑性

1995年以来我国造血干细胞工程与相关的生物学领域的研究发展迅速。有关造血干 祖细胞基因表达的研究 ,上海国家人类基因组研究中心陈竺、陈赛娟等为正常和急性白血病人骨髓造血干祖细胞cDNA文库的基因表达建立了一套先进的工作体系。他们在许多白血病细胞系的干 祖细胞中发现了 30 0个新的相关基因。中山大学医学院李树浓、黄绍良等从人的桑葚期胚胎干细胞成功地诱导出造血细胞等。北京输血研究所裴雪涛等从成人和胎儿的骨髓分离出成年源干细胞 ,又进一步诱导分化为骨、软骨、脂肪和神经原细胞等。他们成功地构建了胎儿和成人间充质干细胞cDNA扣除文库 ,获得了胎儿和成人间充质干细胞的差异表达基因及在胎儿特异表达基因。中国医学科学院天津血液学研究所、国家血液学重点实验室赵春华等证实从胚胎胰腺、骨髓和肝脏中都可以分离出人间充质干细胞 ,又证明G CSF可以使输注的间充质干细胞在体内促造血重建。北京基础医学研究所毛宁等的实验不支持间充质干细胞可以“横向分化”。最近他们发现小鼠胚胎干细胞的体外分化重现了胚胎早期造血发生的生物学程序以及Smad5基因调控在胚胎造血发生中的必要性和多样性 ,又表明其上游配体TGF beta家族分子在胚胎发生中的作用和特点。本文针对干细胞可塑性研究作了评     

CXCR4基因修饰骨髓间充质干细胞对照射损伤小鼠造血重建的影响

本研究旨在探讨过表达CXCR4基因的骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）移植对照射损伤小鼠造血重建的影响.采用293FT细胞包装共表达EGFP和Cxcr4慢病毒载体,转导MSC建立稳定共表达EGFP和CXCR4基因MSC（CXCR4-MSC）,同时建立稳定表达EGFP的MSC（EGFP-MSC）作为对照,经尾静脉输注接受亚致死剂量（总剂量3.5Gy）照射的BALB/c小鼠.MSC的输注量5×105,设立单纯照射组为单纯对照组.观察小鼠的一般生存状态,统计小鼠生存率.分别于第3、7、14、21、28 d外周血计数白细胞（WBC）和红细胞（RBC）,流式细胞术（FCM）检测网织红细胞与网织血小板比例及血小板（Plt）数量.病理观察移植后各组骨髓、脾脏恢复情况.PCR检测MSC在受鼠体内植入情况.结果表明,各组小鼠移植后血象呈先下降、继而上升的一般趋势,其中WBC在1周后开始恢复,且CXCR4-MSC组恢复速度明显快于其他两组,差异具有统计学意义（P＜0.05）.病理结果显示,CXCR4-MSC组造血器官照射损伤后修复较快.PCR检测发现,移植后7、14、21、28 d均可在受亚致死剂量照射的受鼠体内检测到供体MSC.结论：输注过表达CXCR4基因的MSC可增加MSC植入,并促进照射损伤小鼠造血功能的恢复.