siRNA靶向干扰GPC3基因慢病毒载体的构建及其对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响

目的构建GPC3基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,观察GPC3基因对人肝癌细胞系Huh-7凋亡的影响,探讨GPC3基因影响肝癌细胞生长的机制,为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法采用RNA干扰技术转染肝癌细胞系Huh-7,荧光定量PCR检测GPC3基因在多种肝癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向GPC3基因的小干扰RNA序列PGC-shRNA-GPC3,以脂质体(lipofectamineTM2000)为载体转染人肝癌细胞系,筛选并建立稳定表达siRNA的细胞株。采用RT-PCR及Western blot检测GPC3 siRNA转染后mRNA表达情况,验证siRNA的干扰效率。流式细胞仪检测阴性对照组、未转染组和转染组细胞凋亡的情况。结果在肝癌细胞株Huh-7中,GPC3基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-GPC3重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入肝癌细胞株Huh-7后能明显抑制GPC3 mRNA表达水平;同时,流式细胞仪检测发现,GPC3表达下调后,诱导Huh7细胞的凋亡。结论靶向GPC3的siRNA能有效抑制GPC3的表达,并能促进肝癌Huh7细胞凋亡。     

ShRNA靶向沉默VEGFR1基因对U937细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的 探讨慢病毒载体介导shRNA(short harpin RNA,siRNA前体)靶向沉默血管内皮生长因子受体1(VEGFR-1)基因对U937细胞增殖、迁移和凋亡的影响.方法 构建针对VEGFR-1基因干扰序列和无关序列的shRNA慢病毒载体,与慢病毒包装质粒通过脂质体转染293T细胞,包装产生的病毒液感染U937细胞(U937-shVEGFR-1 KD组).采用实时荧光定量PCR、Western blot法检测RNA干扰对U937细胞VEGFR-1 mRNA和蛋白表达的影响;ELISA法检测细胞培养上清液VEGF表达水平的变化;CCK-8法检测常规培养条件下和不同浓度阿糖胞苷(Ara-C)作用下细胞增殖率和抑制率变化;流式细胞术检测经Ara-C作用后细胞凋亡率变化;Transwell小室检测不同条件下细胞迁移数量的变化.结果 成功构建VEGFR-1基因shRNA慢病毒载体,转染U937细胞后,U937-shVEGFR-1 KD组细胞VEGFR-1 mRNA和蛋白表达均显著下降;细胞培养上清液VEGF表达水平明显下降,细胞增殖速度减慢;Ara-C作用下,U937-shVEGFR-1 KD组细胞增殖抑制率及凋亡率较U937无关序列shRNA阴性对照(NC)组和U937空白对照(CON)组细胞明显增高.无药物及VEGF作用下,U937-shVEGFR-1 KD组细胞迁移数量均低于U937 NC组和U937 CON组细胞;Bevacizumab作用下,U937 NC组和U937 CON组细胞迁移数量降低,而U937-shVEGFR-1 KD组细胞迁移数量无明显变化.结论 慢病毒载体介导的shRNA干扰VEGFR-1基因可有效抑制U937细胞增殖、迁移,并能够增强U937细胞对Ara-C的敏感性.     

靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

本研究构建并鉴定靶向mdr-1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体。根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BamHI和HindⅢ双酶切线性化的pGCsilencer人U6启动子质粒载体中;为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染的方法将构建好的3个重组载体(pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3)导入慢性髓系白血病耐药细胞株K562/A02,采用实时PCR方法检测转染细胞的mdr-1基因表达,Western-blot检测P-gp表达量的变化。结果表明:应用PCR电泳图谱和测序证实了克隆RNAi打靶序列完全正确,而且该载体又同时表达GFP标记基因,用于测定转染效率。分别转染pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3后K562/A02细胞的mdr-1基因表达和P-gp表达水平下降,证明shRNA可以特异性沉默mdr-1基因。结论:靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体构建成功,为进一步研究mdr-1基因在K562/A02细胞中的作用奠定了实验基础。     

小发夹RNA对白血病K562细胞血管内皮生长因子受体Fit-1基因表达的抑制作用

本研究观察小发夹RNA对白血病细胞血管内皮生长N子受体flt-1基因表达的抑制作用并探讨其对白血病细胞侵袭能力的影响及作用机制。采用脂质体介导的方法将构建的人flt-1基N特异性shRNA真核表达载体转染入K562细胞,用（3418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组DNA,用PCR方法验证shRNA基因对K562细胞的转染;以RT—PCR和免疫印迹反应检测flt-1mRNA和蛋白表达量的变化;用Boyden小室体外侵袭实验检测白血病细胞的侵袭能力;RT～PCR方法检测白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达。结果表明,flt-1基因特异性shRNA真核表达载体转染入白血病细胞株K562,G418筛选2周获得阳性克隆;PCR检测证实shRNA基因整合入白血病细胞基因DNA;携有shRNA的flt-1基因能明显下调白血病细胞内flt-1基因mRNA表达水平;设计的2种不同flt-1shRNA序列能不同程度干扰flt—1基因和蛋白在细胞中的表达,两纽阳性细胞中flt-1基因表达抑制率分别为46．1％和65．4％;flt—1 shRNA转染白血病细胞系K562细胞后,MMP-2和MMP-9mRNA表达水平均较转染前明显下降;阳性细胞穿透人工重组基底膜的能力（4．3±1．2）％较对照组（12．7±1．9）％及（9．6±1．7）％明显降低（P〈0．01）。结论：VEGF受体flt-1特异性shRNA的真核表达载体能够高效转染入白血病细胞株K562,有效抑制flt-1基因的表达,并使白血病细胞体外侵袭能力减弱,MMP-2和MMP-9mRNA表达水平下降。这提示VEGF可能通过与其受体结合调控MMP-2和MMP-9的方式,参与白血病细胞的转移。     

靶向特定细胞PI3K基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建靶向血管平滑肌细胞和内皮细胞磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）基因的短发卡干扰RNA（short hair-pin RNA,shRNA）表达载体,研究其对上述细胞PI3K基因的靶向沉默作用,探索抑制移植血管狭窄的基因防治手段.方法 根据Genbank中大鼠PI3K p110β亚单位编码基因Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-10,经荧光定量PCR方法筛选一条较合适的shRNA转录模板;合成血管平滑肌细胞特异性SMHC增强子/SM22α启动子序列和血管内皮细胞特异性KDR增强子/启动子序列,将该增强子/启动子片段亚克隆至pGenesil-10-Pik3cbshRNA上,构建并鉴定重组质粒载体SMHCe/SM22α p-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA（简称SM22α e/p shRNA）和KDRe/p-pGenesil-10-Pik3 cb-shRNA（简称KDR e/p shRNA）;将重组质粒载体转染血管平滑肌细胞,分别于转染24h、48h、72 h后,采用实时荧光定量PCR检测Pik3cb基因mRNA的相对表达量.结果 荧光定量PCR检测转染Pik3cb-shRNA-1组与转染Pik3cb-shRNA-2组比较,前者细胞Pik3cb mRNA相对表达量降低更为明显,且两组均较对照组mRNA表达明显减少（P＜0.05）;酶切鉴定重组质粒载体SM22α e/p shRNA和KDR e/p shRNA构建成功;质粒转染细胞后,Pik3cb基因mRNA相对表达量SM22α e/p质粒组较阴性对照组均有所降低,且转染24h后,SM22α e/p质粒组与空白对照、CMV质粒组比较Pik3cb基因mRNA相对表达量明显降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 选择Pik3cb-shRNA-1作为转录模板,能够成功构建SM22α e/p shRNA和KDR e/p shRNA质粒载体,且特异性启动子SM22α介导的靶向大鼠Pik3cb基因的shRNA质粒载体可有效沉默靶基因在血管平滑肌细胞中的表达.     

整合稳定靶向高迁移率族蛋白B1基因shRNA载体的人脐静脉内皮细胞株建立

目的 构建针对高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)基因的特异性RNA干扰载体,建立稳定转染该干扰载体的人脐静脉内皮细胞株(HUVEC).方法 根据HMGB1基因的编码序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计并合成针对HMGB1基因的特异性shRNA,将其定向克隆到pRNA-u6.1/Neo载体中,同时设立阴性对照,重组载体经脂质体转染HUVEC;转染细胞经类氨基糖抗生素样物质G418筛选,采用实时荧光逆转录-聚合酶链反应检测HMGB1mRNA表达,蛋白质免疫印迹法检测HMGB1蛋白表达.结果 酶切鉴定和测序证实,重组质粒shRNA序列与设计的片段完全一致.HMGB1基因特异性RNA干扰载体能够显著抑制HMGB1在HUVEC细胞中的表达(mRNA:0.4635±0.0342比1.0340±0.0352,蛋白:0.4510 ± 0.0200比1.0210±0.0110,均P＜0.05).结论 成功构建了靶向HMGB1基因的shRNA真核表达载体pRNA-HMGB1,并获得了稳定表达靶向HMGB1基因的shRNA的HUVEC细胞株,为进一步研究HMGB1在HUVEC细胞株中的生物学功能和作用机制奠定了基础.     

HABP1基因慢病毒干扰和表达载体的构建及表达

摘要：目的：构建慢病毒介导的透明质酸结合蛋白1基因（HABP1）干扰载体及表达载体,建立HABP1降表达及过表达的稳定肾癌细胞系786-0。 方法：合成人HABP1基因短发夹RNA(shRNA)干扰序列,与慢病毒载体pLKO.1-TRC连接产生重组质粒pLKO.1-shHABP1;双酶切质粒pCDNA3.1(-)-HABP1-Flag,将目的基因片段连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上,组成重组表达载体pCDH-HABP1;酶切鉴定及DNA测序后,转染293T细胞,收集慢病毒颗粒感染786-0细胞,嘌呤霉素筛选稳定细胞系,western blot验证HABP1蛋白的表达水平。 结果：构建成干扰载体pLKO.1-shHABP1及表达载体pCDH-HABP1;与随机序列对照组比较pLKO.1-shHABP1转染的786-0细胞HABP1表达水平(0.30±0.01)明显降低(t=25.98,P<0.05),pCDH-HABP1转染786-0细胞后,HABP1的表达水平（3.20±0.40）明显升高(t=10.34,P<0.05)。 结论：成功构建HABP1基因的干扰载体及表达载体,且786-0细胞可稳定降表达及过表达HABP1。     

应用Gateway技术构建pLenti6-Akt shRNA真核表达载体

目的 应用Gateway技术构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,转染肝癌细胞株HepG2,验证该载体能否下调Akt基因的mRNA水平.方法 以Akt基因为靶点设计两条具有短发卡结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6入门表达载体(pENTR/U6-Akt1,pENTR/U6-Akt2);转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;利用Gateway技术进行LR位点特异性重组,将shRNA导入目的 表达载体pLenti6/Block-it DEST Vector,再行测序鉴定(pLenti6-Akt1,pLenti6-Akt2);将重组质粒转染肝癌细胞株HepG2,提取RNA,RT-PCR检测重组质粒对mRNA水平的抑制效果.结果 经菌落PCR和DNA测序鉴定:pENTR/U6-Akts入门载体和pLenti6-Akts目的 表达载体中插入片段的序列正确,RT-PCR结果表明将shRNA分别转染HepG2细胞后,Akt的mRNA表达受到明显抑制,其中1shRNA比2#shRNA抑制效果明显.结论 利用Gateway技术成功构建了靶向人Akt基因的shRNA表达载体,为以Akt基因为靶点的肝癌基因治疗方案奠定了实验基础.     

构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达

背景:survivin 基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关.目的:构建靶向survivin 基因的shRNA 重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin 基因mRNA 水平.方法:以survivin 基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA 序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6 建立重组表达载体pENTR/U6-SUR ;转化E.coli TOP10 菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR 和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3 细胞,RT-PCR 检测重组质粒对细胞survivin 基因mRNA 水平的抑制效果.结果与结论:将设计合成的shRNA 序列经退火后克隆至pENTR/U6 载体中,菌落PCR 可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR 重组质粒转染后PC3 细胞survivin 基因mRNA 表达水平显著下降,且24 h 比48 h 作用更明显.成功构建了靶向survivin 基因的shRNA 质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3 细胞中survivin 基因mRNA 水平.     

短发夹RNA诱导survivin基因缄默对Jurkat细胞凋亡和增殖的影响

目的研究应用载体表达短发夹 RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术抑制人 T 淋巴细胞白血病细胞株 Jurkat 细胞 survivin 基因的表达,探讨 survivin 基因表达缄默对 Jurkat 细胞凋亡和增殖的影响。方法构建针对 survivin 基因的 shRNA 重组质粒并转染至 Jurkat 细胞,分别用多重 PCR和 Western blot 法检测瞬时转染和稳定转染细胞 survivin 基因 mRNA 和蛋白表达水平的变化;流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染细胞凋亡指数的变化,绘制细胞生长曲线,探讨 survivin shRNA 转染对细胞生长和增殖的影响。结果多重 PCR 结果示与无功能(对照组)shRNA 处理组和磷酸盐缓冲液处理组比较,survivin shRNA 瞬时转染和稳定转染细胞 surivivin 基因 mRNA 表达均显著下降,抑制率分别为66.675% 和60.69%(P<0.05);Western blot 结果显示 survivin shRNA 瞬时转染和稳定转染细胞survivin 蛋白表达水平亦显著降低,抑制率分别为63.41% 和60.18%(P<0.05)。流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染细胞的凋亡率显著增加,分别为(22.41±2.83)% 和(20.73±2.56)%(与对照组比较,P均<0.05),细胞倍增时间显著延长。生长曲线显示稳定转染细胞的生长显著减慢。结论shRNA 重组质粒介导的 RNA 干扰能明显抑制 Jurkat 细胞 survivin 基因 mRNA 和蛋白产物的表达,诱导细胞凋亡和生长抑制。     

转化生长因子-βⅡ型受体特异性短发夹状RNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的：针对转化生长因子-β（TGF-β）Ⅱ型受体基因的不同部位，构建不同TG-βⅡ型受体特异性短发夹状RNA（shRNA）表达质粒载体，在转录后水平抑制TGF-βⅡ型受体的表达，对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法：用DNA重组技术将针对人TGF-βⅡ型受体基因不同部位所设计的4对shRNA序列克隆到真核表达质粒pSilencer^TM 3．1-H1 neo vector中，构建TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencer^TM3．1-H1-TGF-β R ⅡshRNA1、2、3、4。脂质体介导转染成人原代成纤维细胞，经G418筛选抑制TGF-βⅡ型受体表达的稳定细胞克隆。结果：3个TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilencer^TM3．1-H1-TGF-βRⅡ shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Westem blotting均证实3种shRNA重组质粒中pSilencer^TM3．1-H1—TGF-βRⅡshRNA2可明显降低细胞内TGF-βⅡ型受体mRNA峰度及TGF-βⅡ型受体蛋白表达。结论：成功构建了TGF-βⅡ型受体shRNA表达载体pSilenceir^M3.1—H1-TGF-βRⅡshRNA1、2、3，并筛选出特异而高效的阻断TGF-βⅡ型受体表达的克隆。此实验结果为进一步研究TGF-βⅡ型受体蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。     

Bmi-1 shRNA慢病毒表达载体的构建及稳转U266细胞株的建立

本研究构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立U266-li稳定细胞株,为下一步Bmi-1的功能研究及应用RNAi技术治疗打下基础。设计、合成1对针对Bmi-1 mRNA的shRNA序列,退火后连接到pLVTHM干扰载体上,与psPAX2、PMD2G共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染U266细胞,建立稳定细胞株;应用实时PCR和Western blot技术分别检测U266稳定细胞中Bmi-1及P14 mRNA和蛋白水平的表达,并与对照组进行比较。结果表明,成功构建了针对Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,病毒滴度为5×107 TU/ml;建立稳定转染的U266细胞株。有效干扰验证显示,shBmi-1能明显降低Bmi-1的mRNA及蛋白水平,而P14的mRNA及蛋白水平则都上调,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定干扰Bmi-1表达的U266细胞株。     

靶向转酮醇酶样基因1 siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建针对转酮醇酶样基因1(TKTL1)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体并检测其沉默效应。方法采用人U6 SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的TKTL1靶序列的反向重复序列,置于pEGFP-C1-U6质粒载体中,构建成TKTL1短发夹环RNA,产生重组质粒pEGFP-C1-U6/TKTL1,分别用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定及测序分析,并将重组质粒转染人结肠癌细胞株LoVo,通过RT-PCR检测TKTL1基因表达水平的变化。结果酶切鉴定与DNA测序分析证明,TKTL1基因的siRNA表达载体构建正确,RT-PCR结果表明转染重组质粒的LoVo细胞TKTL1基因的表达水平明显降低。结论成功构建了针对TKTL1基因的siRNA表达载体,转染LoVo细胞后可显著抑制TKTL1基因表达。     

脊髓源星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白表达抑制最佳短发夹样RNA分子筛选及真核表达载体构建

背景:哺乳动物脊髓损伤后胶质瘢痕形成是神经再生的物理和化学屏障,减轻或延缓胶质瘢痕形成给损伤脊髓再生创造了有利条件。目的:设计筛选并构建大鼠胶质原纤维酸性蛋白短发夹样RNA真核表达载体。设计:观察性动物实验。单位:南方医科大学附属深圳医院脊柱外科。材料:选用Wistar大鼠25只,雌雄不拘,清洁级,体质量20～25g。DMEM/F12、lipofectamine2000、Trizol RNA分离试剂盒;胎牛血清(Hyclone);BamHⅠ、HindⅢ、PstI、SalI、T4连接酶;质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒;第一链cDNA合成试剂盒;兔抗鼠GFAP一抗。方法:实验于2005-10/2006-06在南方医科大学附属深圳医院完成。针对GFAP基因全编码序列设计并合成3对9bp茎环结构19bp干扰序列特异性shRNA模板,体外定向克隆构建特异性重组质粒真核表达载体;通过体外大鼠脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制模型,脂质体介导RNA干扰分子转染,由实时荧光定量RT-PCR及western blot技术,观察RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果,筛选最佳GFAP表达干扰抑制真核表达载体。主要观察指标:①序列特异性干扰shRNA模板合成;②构建特异性重组质粒真核表达载体;③体外大鼠脊髓源星形胶质细胞培养;④实时荧光定量RT-PCR;⑤RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果。结果:序列测定证实GFAP-shRNA重组质粒真核表达载体构建成功,通过实时荧光定量RT-PCR、western blot技术筛选出最佳GFAP-shRNA效应表达载体,在mRNA及蛋白表达水平抑制靶基因表达效率分别为81%、63%、56%。结论:构建并筛选成功的GFAP-shRNA效应真核表达载体,在大鼠原代星形胶质细胞GFAP表达抑制模型中能高效抑制GFAP-基因表达,为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤胶质瘢痕抑制基因治疗研究策略的应用奠定前期基础。     

sox4不同结构域的真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建并鉴定sox4四段不同结构域的重组真核表达质粒。方法：以HL-60细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增出sox4基因cDNA,将产物克隆进真核载体pCMV—Flag质粒内,构建含sox4不同结构域的重组真核表达质粒。将pCMV—Flag—sox4重组质粒转染293T细胞,Westernblot检测sox4蛋白表达。结果：核酸序列分析sox4已成功插入pCMV—Flag载体中,转染pCMV—Flag-sox4的293T细胞中检测到表达的sox4蛋白。结论：成功构建了含sox4基因的重组真核表达质粒。     

人Hiwi miRNA干扰质粒的构建及其鉴定

目的构建人Hiwi基因miRNA干扰质粒,探讨其对肝癌7721细胞株中Hiwi基因和蛋白表达的阻抑作用。方法根据Homo sapiens Hiwi基因序列,设计RNA干扰靶点,构建4对Hiwi的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR miRNA及1对无效对照miRNA干扰质粒并将其转染至肝癌7721细胞中,通过RT-PCR和Western blot检测7721细胞中HiwimRNA和蛋白的表达水平。结果成功构建了4对Hiwi miRNA干扰质粒及无效干扰质粒,测序表明Hiwi干扰序列及读框完全正确。RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组及阴性对照组比较,转染该载体能有效下调7721细胞株中mRNA和蛋白的表达。结论成功构建了Hiwi的干扰表达载体,为进一步探讨Hiwi基因在肝癌中的相关机制提供了实验基础。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达.尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究.目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒.设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成.材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所.方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段.构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1-4)并行酶切鉴定分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率.主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果.转染效率.采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达.结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒.重组质粒经酶切鉴定证实构建成功.质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%.短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%.结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用.短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显.     

应用RNA干扰技术抑制白血病细胞血管内皮生长因子基因表达及功能的研究

目的探讨用RNA干扰技术下调血管内皮生长因子(VEGF)基因表达对白血病细胞生长的影响。方法设计3段分别针对VEGF第3~5外显子的短发夹状RNA(shRNA)并构建其表达载体,分别转染人白血病细胞株NB4,用实时定量PCR及Western blot方法观察3段shRNA对细胞内VEGF基因表达的影响。抗性筛选稳定抑制VEGF表达的永久细胞克隆,应用MTT法、甲基纤维素半固体培养法及细胞周期动力学检测了解VEGF基因缄默对白血病细胞生长的影响。结果成功构建分别携带3段shRNA及对照随机片段的重组质粒pGenesil-VR1,2,3和pGenesil-con,3种shRNA重组质粒中pGenesil-VR3可明显降低细胞内VEGF mRNA的丰度及VEGF蛋白表达,筛选出的NB4-VR3细胞株增殖能力明显下降,细胞集落形成率为(13.3±3.8)%,与NB4-con的(21.3±6.4)%和NB4组的(24.5±5.2)%相比,差异有统计学意义(P<0.05),细胞周期阻滞于G1期,3组细胞G1期比例分别为(53.2±4.6)%、(42.7±5.9)%和(40.5±5.3)%。结论应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断VEGF基因表达及功能的shRNA,VEGF基因表达下调能明显抑制白血病细胞生长。