采用定点突变PCR构建c-kit D816V突变的重组质粒标准品

目的构建含野生型c-kit基因第17号外显子片段以及含D816V突变型的重组质粒,用作检测c-kit基因D816V突变的阳性对照和阴性对照标准品。方法通过设计定点突变的克隆引物和野生型克隆引物,以健康人外周血基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增获得突变和野生型c-kit基因17号外显子片段,将其插入pEGFP-C1载体质粒中获得重组质粒,并通过酶切和测序鉴定重组质粒,通过紫外分光光度计检测标本的浓度和纯度。结果从健康外周血细胞基因组DNA中成功扩增得到野生型和定点突变的c-kit DNA片段,并将其插入到质粒载体pEGFP-C1中,构建的阳性和阴性对照质粒经酶切和测序鉴定与目的片段完全一致。阴性和阳性质粒标准品的浓度分别为140.1μg/ml和189.9μg/ml,其OD260/OD280值分别为1.821和1.802。结论成功构建了含野生型和D816V突变的c-kit重组质粒,为检测c-kit基因D816V突变提供阴性和阳性对照以及质控品。     

三种常见CD36基因突变体标准质粒的构建

目的构建3种常见的CD36基因突变质粒,为建立高分辨率熔解曲线方法提供突变标准品。方法选取广州人群常见的CD36基因突变位点A1237C、C268T及329-330delAC作为研究位点,采用重叠延伸PCR方法及TA克隆技术构建含有上述突变位点的野生型和突变型质粒,并且对其进行测序验证。结果 DNA测序结果证实构建的3种重组质粒分别含有CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突变。结论成功构建CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突变体标准质粒,为后续建立高分辨率熔解曲线方法筛查CD36基因多态性奠定物质基础。     

突变体富集法检测表皮生长因子受体基因19外显子的缺失突变

目的:建立突变体富集法检测非小细胞肺癌中表皮生长因子受体(EGFR)基因19外显子的缺失突变,并比较突变体富集法与直接法的检出率.方法:构建EGFR野生型和突变型的载体,按不同的比例配成混合液.分别用突变体富集法和直接测序法检测混合液中EGFRl9外显子的缺失突变,确定两种方法的灵敏度.收集198例非小细胞肺癌住院患者的手术切除组织,分别采用两种方法对EGFR基因19外显子进行基因分析.结果:直接测序法可检测出1:10突变质粒和野生型质粒混合液中的突变型,突变体富集法可迭1:100.198例标本中,直接测序法检出杂合性缺失23例,突变率为11.6%,突变体富集法检测出杂舍性缺失4l例,突变率为20.7%.EGFR19缺失突变多见于女性,病理类型多为肺腺癌和腺鳞癌.结论:突变体富集法检测EGFR19外显子缺失突变敏感性高,可提高样本EGFRl9缺失突变的检出率.     

PCR阻断联合荧光探针检测HBV基因前C区G1896A突变株

目的 研究和评估PCR扩增阻断联合荧光探针检测乙型肝炎病毒（HBV）基因前C区1896位点突变的新方法.方法 根据HBV DNA前C区1896位点的突变设计一系列引物,引物3′末端位于1896位,并与突变模板1896位碱基互补.在引物的倒数第2及第3位碱基设计为错配碱基,以增加反应的特异性.结果 以2个错配碱基的突变型引物对野生型质粒进行PCR扩增,具有显著的阻断作用,对1896位突变型质粒无阻断作用,而且对其检测的最低拷贝数可达5×10^3拷贝/ml.选用该引物对95例随机采集的HBv阳性标本进行HBV前C区G1896A位碱基突变的检测,8例为阳性,其突变率为8.4%.结论 本法在临床标本检测中是一种有效的和简便的方法.     

一种KRAS基因突变检测方法的建立及初步应用

目的建立一种KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法,并初步探讨其临床应用价值。方法以KRAS基因热点突变区域12、13密码子为研究位点设计特异性扩增、测序引物,利用已知野生型、突变型样品以TA克隆技术构建相应质粒作为标准品,建立KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法,并进行方法学和应用评估。结果成功构建了KRAS基因12、13密码子野生型、突变型质粒。建立了KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法,该方法灵敏度高（9．39×10^1copies／uL）,重复性好（实时荧光定量PCR部分批内、批间变异系数分别为1．60％、2．54％）。该法与传统Sanger测序法同时检测40例临床样品,结果符合率为100％。结论本研究成功建立了可用于临床样品检测的KRAS基因实时荧光定量PCR—Sanger测序突变检测方法。     

MTS1基因ARF启动子基础转录调控区转录活性研究

目的　研究MTS1基因ARF启动子基础转录调控区的转录激活及其与E2 F1转录因子之间的关系。方法　以含ARF启动子基础转录调控区E2 F1结合位点野生型序列的W6重组质粒为模板 ,设计该片段中E2 F1A、B、C结合位点序列突变或缺失的引物 ,用聚合酶链反应构建该区域中E2 F1A、B、C结合位点序列突变或缺失的ZE、ZF、ZG重组质粒。再将W6、ZE、ZF、ZG重组质粒转染进Jurkat细胞 ,检测其荧光素酶报告基因的表达。结果　构建的ZE、ZF、ZG重组质粒经SacⅠ或NaeⅠ酶切鉴定和DNA序列分析得到证实。与E2 F1位点野生型重组质粒W6比较 ,突变型重组质粒ZE、ZF、ZG在Jurkat细胞中荧光素酶报告基因的表达量减少 ,以E2 F1A位点突变的重组质粒减少明显。结论　构建ARF启动子E2 F1A、B、C结合位点序列突变的重组质粒成功 ;MTS1基因ARF启动子基础转录调控区的转录激活可能与E2 F1转录因子的作用有关。     

TaqMan-ARMS法快速检测人MTHFR基因多态性

目的利用PCR引物的错配扩增和荧光定量PCR技术,建立一种针对人亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因多态性的快速荧光扩增检测方法。方法收集已经测序验证的MTHFR基因C677T,A1 298C位点的野生型、杂合型和突变型样本,并据此构建野生型和突变型质粒;根据野生型MTHFR基因序列设计ARMS(扩增阻碍突变系统)引物和Taq Man探针并筛选出最合适的突变检测体系,与已知突变信息的214例样本进行比较,以验证该检测体系的可行性。结果建立的Taq Man-ARMS法性能评估优异,样本的最低检测限为10 copies/μL,样本间交叉检测无核酸扩增,体系检测阴性对照无核酸扩增;重复性及实验室内精密度结果良好,MTHFR-667位点和1 298位点重复性检测的标准差介于0.11~0.44,纯合和杂合样本的变异系数(CV)均4.52%。214例临床样本用该法检测结果与测序法的一致性为100%。结论基于Taq Man-ARMS法检测MTHFR的基因多态性方法简单,快捷,精确,适合用于临床样本快速诊断。     

原发性骨髓增生异常综合征患者NPM1基因突变的研究

目的 探讨原发性骨髓增生异常综合征(MDS)患者NPM1基因突变情况及其与MDS患者临床特征的关系.方法 对232例原发性MDS患者采用基因组DNA聚合酶链反应(PCR)扩增NPM1基因第12外显子,直接测序检测突变状态,克隆后测序鉴定突变类型.比较NPM1突变患者与野生型患者的临床及实验室特征.结果 232例患者中NPM1突变9例(3.9%),均为A型突变.NPM1突变患者中性粒细胞绝对值(ANC)较低[突变型和野生型患者分别为0.60(0.12～2.91)×109/L和1.02(0～10.23)×109/L,P=0.046],骨髓原始细胞比例较高[突变型和野生型患者分别为0.050(0～0.090)和0.025(0～0.190),P=0.035],干/祖细胞培养后红系爆式集落(BFU-E)数量减低[突变型和野生型患者105个骨髓单个核细胞中集落数分别为0(0～0)和6(0～40),P=0.038],血清维生素(Vit)B12水平较高[突变型和野生型患者分别为936.40(373.80～2400.00)pmol/L和557.85(17.00～3032.10)pmol/L,P=0.045].NPM1突变患者以正常核型为主.结论 NPM1基因突变的MDS患者具有一些独特的临床和实验室特征,此为进一步研究NPM1基因突变与原发性MDS发生及转变为白血病的关系提供了重要线索.     

突变敏感性分子开关检测线粒体DNA A1555G位点的条件优化

目的对高保真酶介导的突变敏感性分子开关技术检测线粒体DNA(mt DNA)A1555G位点条件进行优化。方法利用3'硫代磷酸化修饰的突变型引物和野生型引物作为下游引物,在其上游设计一条公共引物分别构成突变引物对和野生引物对,以构建好的包含mt DNA A1555G位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,对PCR体系中的退火温度、引物浓度、模板浓度等条件优化,通过凝胶成像系统对其PCR结果进行分析确定最佳反应条件。结果分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳PCR条件:退火温度为61.0℃,引物浓度为0.6μmol/L,检测模板浓度为103~106copies/μL。结论确定了分子开关技术检测mt DNA A1555G位点的最佳反应条件,为该技术在线粒体DNA的突变筛查中的应用提供依据。     

双重PCR检测急性髓系白血病FLT3-ITD和NPM1基因突变

本研究旨在建立一种同时筛查FLT3-ITD突变和NPM1突变的检测方法.设计2对引物,分别扩增NPM1基因的外显子12和FLT33基因的外显子14、内含子14、外显子15,以覆盖几乎所有已知突变位点.对双重PCR体系的反应程序和引物浓度比例进行优化,将双重PCR产物通过毛细管电泳分离,根据野生型产物和突变型产物的大小差...     

连接酶反应检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药突变的初步研究

目的建立一种基于连接酶检测反应（LDR）技术的方法,检测慢性乙型肝炎患者阿德福韦（ADV）耐药突变rtA181V／T和rtN236T。方法设计特异性引物和针对不同突变类型的探针,聚合酶链反应（PCR）扩增后进行LDR,最后在测序仪上分析结果。以直接测序法作为对照分析55例临床标本,对结果不一致的标本进行亚克隆测序确认。结果LDR能够在野生型质粒背景下检测到1％的rtA181V／T或rtN236T突变质粒,不与野生型质粒及血清常见病毒产生交叉扩增。55例临床标本中检测到8例（14．5％）rtA181V／T和rtN236T双突变,6例（10．9％）rtA181V／T单突变,7例（12．7％）rtN236T单突变,与直接测序法结果一致的标本有52例（94．15％）。对3例结果不一致的标本进行亚克隆测序分析,结果与LDR一致。结论LDR是一种特异、敏感的方法,可以用于监测慢性乙型肝炎患者ADV耐药突变。     

Denaturing high-performance liquid chromatography: a valid approach for identifying NPM1 mutations in acute myeloid leukemia

NPM1 gene mutations are the most frequent genetic lesion in the 60% of adult acute myeloid leukemias (AMLs) with normal karyotype and no evidence of typical fusion genes (BCR/ABL1, PML/RARA, AML1/ETO, CBFB/MYH11, DEK/CAN). Using direct sequencing we previously identified six different heterozygous mutants within exon 12 encoding the nucleophosmin C-terminus. Because of these mutations the shuttling protein nucleophosmin is aberrantly delocalized in the cytoplasm of leukemic cells (NPMc+). Here, we designed and tested a denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) assay to detect NPM1 mutated variants. To assess specificity, sensitivity, reliability, and reproducibility, we analyzed DNA from 120 primary adult AMLs and compared DHPLC results with immunohistochemistry and sequencing. All electropherogram profiles in the 26 NPMc+ leukemias were different from the wild type, indicating 100% sensitivity. Sequencing categorized mutations A, B, and D, and all mutation A cases gave identical elution profiles. The other mutations showed typical chromatograms, with mutations B and D differing for one nucleotide. Elution profiles and sequencing also identified four new variants. Our results suggest that DHPLC detects NPM1mutations as well as direct sequencing and immunohistochemistry, providing a helpful approach in the diagnosis of NPMc+ AML.     

Rapid detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using TaqMan-minor groove binder probes

BACKGROUND: TaqMan-minor groove binder (MGB) probes were used in a real-time PCR-based assay for the rapid and accurate detection of hepatitis B virus (HBV) YMDD mutants. METHODS: TaqMan-MGB probes were designed to distinguish between wild-type (YMDD) and mutant (YVDD and YIDD) strains of HBV. The detection limit and sensitivity of the assay were determined using a dilution series of a mixture of wild-type and mutant plasmids. Serum samples collected from four patients with chronic mutant HBV infections during lamivudine therapy were analyzed using this method. RESULTS: The detection limit for YVDD and YIDD was 10 and 50 copies, respectively, whereas the sensitivity was 10% within a mixed virus population. In the clinical samples, mutant strains of HBV could be detected at levels <2.6 log copies/ml of HBV DNA. While 15 of the 21 samples tested by this method were positive for the YMDD mutant, direct sequencing and a reverse hybridization line probe assay (INNO-LiPA HBV DR v2) detected the mutant strain in only 11 and 9 samples, respectively. Moreover, the data for 6 samples analyzed by TA cloning were fully consistent with our TaqMan PCR results. CONCLUSIONS: We successfully established a sensitive and accurate assay for the YMDD mutant of HBV. This method may be useful for monitoring patients treated with lamivudine.     

白血病NPM1基因突变快速检测与分型方法的研究

目的:建立一种通过荧光探针熔解曲线分析技术对急性髓系白血病(AML)中NPM1突变基因快速检测和分型的方法.方法:设计Nucleoplasmin(NPM1)第12号外显子突变基因mutA、mutB、mutD和野生型的一对共用引物和一条荧光单链探针(分子信标),依据PCR产物与探针的熔解曲线峰值对A、B、D型基因突变进行...     

急性髓系白血病NPM1基因突变的研究

本研究旨在探讨急性髓系白血病（AML）患者NPM1基因突变情况及临床特征。采用PCR扩增产物直接测序法检测33例AML患者NPM1基因第12外显子的突变情况,了解NPM1基因突变阳性患者的临床特征。结果显示：33例AML患者中共检出8例（24．2％）具有NPM1基因突变,其中M1 1例、M2 3例、M4 1例、M3 3例。19例正常核型AML患者中7例（36．8％）发生NPM1基因突变,明显高于异常核型组（14例中1例,7．1％）（P〈0．05）。NPM1基因突变型患者骨髓原始细胞比例及外周血白细胞计数均高于野生型组（P值均〈0．05）。结论：NPM1基因第12外显子的突变多见于正常核型AML患者,突变患者骨髓原始细胞比例及外周血白细胞数量增多。     

应用PCR-RFLP技术检测阿德福韦耐药相关性HBV变异

目的建立一种简便、快速、实用的检测阿德福韦(ADV)耐药相关性HBV变异(rtA181V/T/S和rtN236T变异)的方法。方法根据GenBank收录的HBV基因全序设计套式-PCR引物,使野毒株的PCR产物上游末端引入BglI的酶切位点,使rt236变异株的PCR产物下游末端引入BseDI(SecI)的酶切位点,建立PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)方法。用此方法分别检测含rt181变异株、rt236变异株及野毒株质粒和3例ADV耐药慢性乙型肝炎患者血清标本。将变异株和野毒株配成不同比例,再用此方法检测,以了解该方法的敏感性。结果本研究建立的PCR—RFLP方法可同时检测rt181变异和rt236变异;用此方法检测血清标本,结果与测序及克隆分析一致;此方法可检测出标本中10%的变异株。结论应用PCR- RFLP方法可同时检测rtA181V/T/S和rtN236T变异,具有较高的敏感性,可用于ADV耐药变异的早期诊断。     

DNA微阵列芯片法检测慢性乙型肝炎拉米夫定和阿德福韦酯耐药突变

目的 评价一种新研制的DNA微阵列芯片HBV基因型耐药检测试剂盒的临床应用性能.方法 收集2008年12月至2010年6月224份CHB患者血清标本,提取HBV DNA,应用DNA微阵列芯片法和直接测序法平行检测HBV逆转录酶区(rt区)位点rtL180、rtA181、rtM204和rtN236的耐药突变.对结果不一致的标本进行克隆测序,以验证检测的准确性.结果 芯片法和直接测序法均成功检测224份标本全部896个位点的耐药基因型,214份标本结果完全一致,其中82份检测到突变,132份为野生型HBV.2种方法检测HBV耐药突变结果的完全符合率为95.5%(214/224).其余10份标本只用芯片法检测到突变:2份rtL180M突变、2份rtA181V突变、3份rtM204I突变、2份rtM204V突变、1份rtN236T突变,但是直接测序未检测到相应突变.包含突变序列的克隆所占比例为5.0%～15.0%.经克隆测序验证结果与芯片法完全一致.结论 DNA微阵列芯片法检测HBV耐药突变与直接测序法相比符合率高,并可检出低比例耐药突变毒株,有助于早期提示耐药的发生.