抗bcl—2核酶在HL—60细胞中的表达及促进其凋亡的研究

为消除白血病细胞中ｂｃｌ－２基因对细胞凋亡的抑制作用开辟白血病基因治疗的途径。将合成的针对ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ的“锤头型”核酶基因定向克隆于真核表达本ＰＤＯＲ－ｎｅｏ，构ｐＤＯＲ－ＲＺ重组体。通过脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的ＤＮＡ转染法，把ｐＤＯＲ－ＲＺ导入ＨＬ－细胞。     

9—顺式维甲酸诱导HL—60细胞凋亡

目的：检测９－顺式维甲酸（９－ｃｉｓＲＡ）诱导ＨＬ－６０细胞凋亡的能力，并探讨其分子机制。方法：应用形态学观察、ＤＮＡ电泳、流式细胞仪分析检测细胞凋亡，应用流式细胞仪检测ＨＬ－６０细胞ｂｃｌ－２含量。结果：９－ｃｉｓＲＡ可以诱导ＨＬ－６０细胞在分化后发生典型的凋亡。在ＨＬ－６０细胞分化和凋亡的过程中ｂｃｌ－２含量逐渐下降。９－ｃｉｓＲＡ诱导ＨＬ－６０细胞凋亡能力和降低ｂｃｌ－２表达的能力均显著强于全反式维甲酸（Ａ－ＴＲＡ）。结论：９－ｃｉｓＲＡ具有诱导ＨＬ－６０细胞凋亡的作用。ｂｃｌ－２表达水平的降低可能是经诱导分化成熟的白血病细胞走向凋亡的重要条件。     

氧化砷诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡及其分子机制的初步研究

目的：了解氧化砷（Ａｓ２Ｏ３）治疗急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）的细胞和分子机制。方法：以早幼粒细胞白血病细胞株ＮＢ４细胞等为研究对象，利用流式细胞仪，ＤＮＡ电泳，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹，免疫组化等手段，观察Ａｓ２Ｏ３对ＡＰＬ的作用。结果：Ａｓ２Ｏ３能显著诱导ＮＢ４细胞凋亡，而不影响ＨＬ－６０和Ｕ９３７的生长和存活。氧化砷能有效降低ＮＢ４细胞中ｂｃｌ－２基因的表达，而对其它几种凋亡相关基因（包括ｐ５３、ｃ－ｍｙｃ、ｂａｘ和ｂｃｌ－ＸＬ）的ｍＲＮＡ水平无影响。结论：这可能是Ａｓ２Ｏ３诱导ＮＢ４细胞凋亡的分子机制之一。     

逆转录病毒介导的反义bcl-2序列促进足叶乙甙诱导的白血病细胞凋亡

目的：探讨逆转录病毒介导的反义ｂｃｌ２序列对细胞凋亡的诱导作用。方法：ＰＡ３１７细胞包装逆转录病毒，病毒转导Ｊｕｒｋａｔ细胞后用ＲＴＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测ｂｃｌ２ｍＲＮＡ及蛋白表达水平；用流式细胞仪计数及ＤＮＡ电泳检测细胞凋亡。结果：转染反义ｂｃｌ２序列可使内源性ＢＣＬ２蛋白表达下降，提高白血病细胞株对足叶乙甙（Ｖｐ１６）的敏感性，促进细胞凋亡。结论：反义ｂｃｌ２序列能促进Ｖｐ１６诱导的白血病细胞凋亡，为ｂｃｌ２反义技术治疗白血病的临床应用提供了实验依据。     

外源性野生型p53基因在HL60－n细胞表达的意义

为研究外源性野生型ｐ５３基因在白血病细胞表达的意义，采用重组逆转录病毒载体介导的人野生型ｐ５３ｃＤＮＡ转移ＨＬ６０－ｎ细胞。结果发现外源性野生型ｐ５３基因可以诱导ＨＬ６０－ｎ细胞死亡，死亡细胞呈凋亡的形态学特征。流式细胞仪分析显示野生型ｐ５３基因诱导ＨＬ６０－ｎ细胞死亡不伴有细胞周期Ｇ１期的生长阻滞。ＮＢＴ还原试验还提示野生型ｐ５３基因无诱导ＨＬ６０－ｎ细胞分化的作用。这些结果阐明了野生型ｐ５３基因抑制白血病细胞生长的部分机制     

抗凋亡基因bcl－2在急性白血病骨髓与细胞株中的转录水平表达

采用原位杂交方法检测了急性白血病骨髓活检标本及细胞株中ｂｃｌ－２基因表达水平。结果２２例白血病患者骨髓中２１例（包括髓系和淋巴系）存在ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ高表达；６种白血病细胞株中５种ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ阳性（Ｍｏｌｔ－４例外），它们分别为ＣＥＭ、Ｒａｊｉ、ＨＬ－６０、Ｕ９３７及Ｋ５６２。表明造血系统肿瘤中广泛存在ｂｃｌ－２基因转录水平激活，其基因产物可能通过抑制细胞凋亡过程而影响急性白血病细胞的生物学特性。     

外源性野生型p53基因在HL60—n细胞表达的意义

为研究外源性野生型ｐ５３基因在白血病细胞表达意义，采用重组逆转录病毒载体介导的人野生型ｐ５３ｃＤＮＡ转移ＨＬ６０－ｎ细胞。结果发现外源性野生型ｐ５３基因可以诱导ＨＬ６０－ｎ细胞死亡，死亡细胞呈凋亡的形态学特征。     

抗凋亡基因bcl—2在急性白血病骨髓与细胞株中的转录水平表达

采用原位杂交方法检测了急性白血病骨髓活检标本及细胞株中ｂｃｌ－２基因表达水平。结果２２例白血病患骨髓中２１例存在ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ高表达；６种白血病细胞株中５种ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ阳性（Ｍｏｌｔ－４例外），它们分别为ＣＥＭ、Ｒａｊｉ、ＨＬ－６０、Ｕ９３７及Ｋ５６２。表明造血系统肿瘤中广泛存在ｂｃｌ－２基因转录水平激活，其基因产物可能通过抑制细胞凋亡过程而影响急性白血病细胞的生物学特性。     

阿糖胞苷诱导HL—60细胞凋亡中bcl—2,c—myc基因表达水平的变化

阿糖胞苷诱导ＨＬ－６０细胞凋亡中ｂｃｌ－２、ｃ－ｍｙｃ基因表达水平的变化仇志根马伴吟杨毅吴王月现已证明，阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。我们采用Ａｒａ－Ｃ诱导ＨＬ－６０细胞凋亡，并观察了凋亡调控基因ｂｃｌ－２、ｃ－ｍｙｃ表达...     

rhGM—CSF对VP—16诱导的HL—60细胞凋亡的影响

为探讨ｒｈＧＭ－ＣＳＦ对ＶＰ－１６诱导的ＨＬ－６０细胞凋亡的影响,我们观察了预先应用ｒｈＧＭ－ＣＳＦ孵育的ＨＬ－６０细胞由ＶＰ－１６诱导的凋亡的过程及凋亡相关基因ｂｃｌ－２和ｆａｓ的表达变化,应用光学显微镜和电子显微镜观察细胞形 和超微结构变化,凝胶电泳检测ＤＮＡ的碎片,流式细胞术检测细胞凋亡率、ｂｃｌ－２和ｆａｓ的表达,实验结果显示,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ可抑制ＶＰ－１６诱导的ＨＬ－６０细胞的凋亡,它加强了ＶＰ－１６对ｂｃｌ－２表达的下调作用,抑制了ＶＰ－１６对ｆａｓ表达的上调作用,由此推测,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ可能是通过下调ｆａｓ表达降低ＨＬ－６０细胞对ＶＰ－１６的敏感性。     

神经酰胺在诱导HL-60细胞凋亡中的作用研究

目的：观察神经酰胺对ＨＬ６０细胞凋亡产生的影响、凋亡相关基因ｂｃｌ２变化及与蛋白激酶Ｃ（ＣＰＫ）途径的关系,探讨其在细胞凋亡过程中可能的调节作用。方法：采用ＤＮＡ凝胶电泳、细胞荧光染色、流式细胞术、逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）等技术对细胞进行凋亡鉴定及ｂｃｌ２ｍＲＮＡ表达分析。结果：外源性及内源性神经酰胺类药物可诱导ＨＬ６０细胞产生典型的凋亡改变,明显下调ｂｃｌ２ｍＲＮＡ表达,且与刺激药物呈时间、剂量上的依赖性;ＣＰＫ途径激活剂佛波酯（ＰＭＡ）、二酰基甘油单独作用无诱凋作用,但加入内源性ＣＰＫ抑制剂神经鞘氨醇,即可产生凋亡特有的ＤＮＡ梯形降解。结论：神经酰胺类药物诱导的ＨＬ６０细胞凋亡信号,可通过调节抑凋基因ｂｃｌ２表达降低而产生效应,且与ＣＰＫ途径的抑制密切相关     

WT1基因表达对K562、HL-60细胞增殖作用的研究

目的：探讨ＷＴ１基因反义ＲＮＡ对髓系白血病细胞生长增殖和细胞凋亡的影响及作用机制。方法：用ＷＴ１基因反义ＲＮＡ培养Ｋ５６２、ＨＬ６０细胞，用氮蓝四氮唑盐染色、流式细胞仪检测、逆转录聚合酶链反应等方法观察细胞增殖、凋亡、细胞动力学和基因表达情况。结果：ＷＴ１反义ＲＮＡ可以特异性抑制Ｋ５６２细胞增殖，诱导Ｋ５６２、ＨＬ６０细胞凋亡；对ＨＬ６０细胞的增殖无影响，对ＷＴ１、ｂｃｌ２、ｍｄｍ２基因表达无显著影响。结论：ＷＴ１基因与白血病细胞的增殖、凋亡密切相关，对白血病细胞凋亡的影响与ｐ５３、ｂｃｌ２基因无关。     

bcl－2蛋白对T淋巴细胞白血病细胞株CEM程序性死亡的调控作用

为探讨ｂｃｌ－２蛋白对足叶乙甙触发Ｔ淋巴细胞白血病细胞株ＣＥＭ程序性死亡的调控作用，采用脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ法，将ｂｃｌ－２基因逆转录病毒载体转入人Ｔ淋巴细胞白血病细胞株ＣＥＭ中，并使其稳定、高效地表达。结果，经足叶乙甙处理后，高表达ｂｃｌ－２蛋白的ＣＥＭ细胞产生梯状ＤＮＡ的量低于对照（Ｐ＜０．０５）。这表明高水平ｂｃｌ－２蛋白对白血病细胞程序性死亡过程可能具有较强的抑制效应。     

粒—巨噬细胞集落刺激因子对Vp16诱导白血病细胞凋亡的调控作用

目的：探讨粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）对Ｖｐ１６诱导白血病细胞凋亡的调控作用，指导白血病临床治疗中正确使用ＧＭ－ＣＳＦ。方法：在构建高效表达ＧＭ－ＣＳＦ的逆转录载体Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ＧＭ－ＣＳＦ表达系统的基础上，对转ＧＭ－ＣＳＦ基因和未转ＧＭ－ＣＳＦ基因的白血病ＨＬ－６０细胞进行研究。结果：未转ＧＭ－ＣＳＦ基因及转空载体Ｎ２Ａ的ＨＬ－６０细胞经Ｖｐ１６处理后均出现凋亡的特征性表现：ＤＮＡ电泳呈梯状；流式细胞仪ＤＮＡ直方图上呈现特征性的亚二倍体（亚Ｇ１）峰；透射电镜观察细胞形态可见凋亡的特征性改变。结论：Ｖｐ１６具有诱导白血病细胞发生凋亡的作用，而ＧＭ－ＣＳＦ能够抑制Ｖｐ１６诱导的细胞凋亡。以上结果表明，白血病临床治疗中为预防和改善化疗所致骨髓抑制而应用ＧＭ－ＣＳＦ时，应谨慎地选择时机，在化疗前和化疗期间不宜使用，以避免白血病细胞对抗癌药物诱导的凋亡产生抵抗而导致耐药。     

细胞凋亡相关基因与白血病

细胞凋亡是当前生命科学研究的热点之一，凋亡相关基因ｂｃｌ－２，Ｐ５３，ｃ－ｍｙｃ，ＩＣＥ家族，ＡＰＯ＝－１／Ｆａｓ，ｂｃｒ－ａｂｌ，ＰＭＬ－ＲＡＲα等涉及白血病发病机制，治疗和耐药，通过调控凋亡相关基因促进白血病细胞凋亡，可能是治疗白血病的新途径。     

切割bcr/abl核酶的逆转录病毒载体构建及其对K562细胞的影响

目的：研究ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中的作用以及探索ＣＭＬ基因治疗的可能性。方法：合成针对ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因转录本ｂ３ａ２断裂点“锤头状”核酶的ｃＤＮＡ序列，定向克隆于逆转录病毒载体内，通过脂质体介导的ＤＮＡ转染法，将核酶基因导入Ｋ５６２细胞，并通过克隆分析法、流式细胞术（ＦＣＭ）、逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）、ＤＮＡ电泳及电镜观察等方法检测核酶对Ｋ５６２细胞的影响。结果：①核酶转染Ｋ５６２细胞后４８小时克隆形成抑制率达８５％；②细胞内Ｐ２１０蛋白合成受到明显抑制；③ＲＴＰＣＲ半定量检测ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达水平明显下降；④核酶处理组Ｋ５６２细胞发生凋亡，表现为：在ＦＣＭ图谱上可见明显的凋亡峰；ＤＮＡ电泳分析出现典型的梯状ＤＮＡ带；电镜观察呈现凋亡早期形态学改变。结论：核酶基因通过逆转录病毒载体导入Ｋ５６２细胞后可成功表达，使Ｋ５６２细胞ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ及Ｐ２１０蛋白表达水平下降，抑制Ｋ５６２细胞增殖，同时诱导Ｋ５６２细胞发生凋亡。     

bcl-2基因转染阻断Fas介导的Jurkat细胞凋亡

目的：通过ｂｃｌ２阻断Ｆａｓ介导的细胞凋亡了解ｂｃｌ２基因在淋巴瘤癌变过程中逃避机体免疫监控的作用机制。方法：应用基因重组技术重组ｐＬＸＳＮｂｃｌ２，采用电穿孔法将其与空载体分别转染包装细胞系ＰＡ３１７，将阳性克隆病毒上清感染人Ｔ淋巴瘤细胞株Ｊｕｒｋａｔ，用Ｇ４１８筛选，其阳性克隆进行免疫组化检测，应用抗Ｆａｓ抗体诱导细胞凋亡来模拟细胞毒Ｔ细胞的杀伤机制，观察ｂｃｌ２在淋巴瘤逃避免疫机制中的作用。结果：转染人ｂｃｌ２基因的Ｊｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔｂｃｌ２）细胞较对照Ｊｕｒｋａｔ及转染空载体Ｊｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔｎｅｏ）细胞，ｂｃｌ２表达量明显增加，而Ｆａｓ基因表达量无明显变化。其Ｊｕｒｋａｔｂｃｌ２能明显耐受抗Ｆａｓ抗体诱导的细胞凋亡。结论：人ｂｃｌ２基因在淋巴瘤中过量表达，能部分阻断抗Ｆａｓ抗体诱导的细胞凋亡，ｂｃｌ２基因过量表达可能是淋巴瘤癌变过程中逃脱机体免疫监控的机制之一。     

逆转录病毒介导的反义bcl—2序列促进足叶乙甙诱导的白血病？…

探讨逆转录病毒介导的反义ｂｃｌ－２序列对细胞凋亡的诱导作用,方法：ＰＡ３１７细胞包装逆转录病毒,病毒转导Ｊｕｒｋａｔ细胞后用ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ及蛋白表达水平;用流式细胞仪计数及ＤＮＡ电泳检测细胞凋亡。     

hGM-CSF基因在哺乳动物细胞中稳定转染表达质粒的构建和鉴定

目的：获得具有天然糖基化结构的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）。方法：采用含ｓＲα启动子和新霉素抗性基因的真核细胞表达载体ｐＭＥｎｅｏ，接上ＸｈｏＩ接头，与ＸｈｏＩ酶切ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段连接，构建了可在哺乳动物细胞中稳定表达的ｐＭＥｎｅｏ－ｈＧＭ－ＣＳＦ质粒。结果：２２个ｐＭＥｎｅｏ重构载体克隆中，８个含有ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段，酶切鉴定插入方向为５个顺式，１个顺式串珠，２个反式。结论：将上述各式以ＤＥＡＥ法转染ＣＯＳ细胞，瞬时表达鉴定，用ＴＦ１细胞ＭＴＴ法测定培养液上清的ｈＧＭ－ＣＳＦ活性，顺式和顺式串珠培养上清活性为１×（１０３～１０４）Ｕ／ｍｌ，反式插入方向培养上清没有活性     

bcl-X_L在急性髓系白血病细胞的表达及与化疗敏感性的关系

目的：探讨急性髓系白血病（ＡＭＬ）细胞凋亡径路的特征及调控模式。方法：运用流式细胞仪（ＦＡＣＳ）、ＤＮＡ电泳、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析技术，观察了化疗药物足叶乙甙（Ｖｐ１６）作用于原代ＡＭＬ细胞前后，ｂｃｌ－ＸＬ表达与凋亡的敏感性、临床特征、预后的关系。结果：绝大部分ＡＭＬ高表达ｂｃｌ－ＸＬｍＲＮＡ病例经Ｖｐ１６处理后，其ｂｃｌ－ＸＬ虽然下调，但仍维持较高水平，并对凋亡诱导不敏感，与高白细胞数、髓外浸润等不良预后特征相关，化疗后不易缓解，处于长期缓解中的病例经Ｖｐ１６处理后，ｂｃｌ－ＸＬ亦表达下调，但凋亡率远低于ＡＭＬ细胞。结论：ｂｃｌ－ＸＬ高表达与ＡＭＬ的发生、维持和化疗耐药性相关，ｂｃｌ－ＸＬ高表达下调是凋亡启动的基础，但本身不足以引致凋亡。