猪卵透明带-3β截短型蛋白在原核系统中的表达研究

目的:制备具有猪卵透明带-3β抗原活性的截短型pZP3β蛋白(tunc-pZP3β),以便对该蛋白的抗原表位区域作深入研究。方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第130个氨基酸到第290个氨基酸的DNA序列。获得的tunc-pZP3β基因片段通过引入其两端的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点被定向插入pET-3c质粒T7强启动子下游的多克隆区,筛选出重组子,经DNA测序验证正确后,转化表达菌株BL21(DE3)pLysS,再用IPTG对重组菌体进行诱导。结果:SDS-PAGE分析表明tunc-pZP3β在大肠杆菌系统中高水平表达,且在WesternBlot免疫印迹中能被特异性抗体识别。结论:对适当的抗原表位序列进行保留而截去两端一定的氨基酸序列,所获得的截短型蛋白能够实现在大肠杆菌中高效表达,这有利于深入研究该蛋白核心区域的功能。     

猪卵透明带—3βcDNA在大肠杆菌中的表达

猪卵透明带（PZP）是包绕在卵母细胞外的由ZPI、ZP3a和ZP35组成的一层丝状体酸性糖蛋白。其中的猪ZP39蛋白（分子量55kD，完全去糖基后为32kD）jfl当于小鼠精子受体ZP3和人ZP3蛋白，PZP35在受精过程中起何作用？特别是其抗体与猪精子受体PZP3a抗体一样也能在体外试验中阻断人精卵受精，所以长期以来PZP印也一直是生殖生物学和免疫避孕科研人员关注的研究对象。过去分离该蛋白组分是通过繁琐的生化提纯技术，随着分子生物学技术的广泛应用，以相对简便价廉的遗传工程方法大量制备无卵巢因子混杂的ZP目的蛋白已是势在必行。本文首次报道了PZP35基因在大肠杆菌中的表达，为以后制备相应的单克隆抗体，鉴别抗原决定簇进而研究ZP耿避孕疫苗打下了基础。一、目的基因的DNA测序为选择表达载体构建符合pZP30CDNA阅读框的融合基因，先用T。引物对pZ57质粒中PZP30基因的5’端重新作了DNA测序分析，结果发现已报道的该基因5’端非编码区漏读了二个碱基（T、G）。二、表达载体PWR450-2／ZP那的构建质粒PWR450-2带有裁短的LacZ’基因（编码6一半乳糖背酶N端461个氨基酸残基），外源基因插入LacZ’基因下游多聚克隆部位形成融合基因，以异丙基一p-Dwt代半乳糖着（IPTG）诱导上游的强启动子比c即产生高水平表达。将酶切     

非融合膜外型猪卵透明带-3β蛋白在原核系统中的表达

目的:通过基因工程的方法在原核表达系统中表达去除了信号肽和跨膜区的膜外型猪卵透明带蛋白pZP3β。方法:设计适宜引物,采用PCR方法,在基因水平对膜外型pZP3β的翻译起始序列进行适当调整,获得的基因克隆入pET-3c载体,并进一步在大肠杆菌E.coli BL21(DE3) pLysS中表达。结果:得到表达率约10%的非融合膜外型pZP3β蛋白的表达,并经Western-blot鉴定为目的蛋白。结论:外源蛋白在不改变氨基酸序列条件下,在基因水平的适当调整可以有效提高其表达率。     

猪卵透明带-3β蛋白核心片断在E.coli中的表达

目的:探讨通过基因工程的方法在大肠杆菌中表达猪卵透明带蛋白pZP3b的核心片断。方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第44-306个氨基酸的pZP3β核心片断的DNA序列,克隆入pET-3c载体进而在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysS中表达。结果:表达的pZP3β核心蛋白占菌体总蛋白的15%,并经Western-blot鉴定为目的蛋白。结论:pZP3β核心片断在大肠杆菌中获得较高的表达,有利于产物的纯化,为后续阐明pZP3β核心区域的性质和相关抗生育研究打下了基础。     

猪卵透明带单克隆抗体特性研究

从猪卵巢中分离卵子提取透明带(ZP)免疫动物,实验研究证明多克隆ZP抗体,对卵巢功能有一定影响。我们制备的三株猪ZP单克隆抗体,它们与人体主要器官无交叉反应。用免疫荧光、ABC免疫组织化学及体外阻断人精卵结合等方法,进行研究。发现有一株单抗(LPD_8)能明显阻断体外人精卵结合。此外有二株单抗(LPD_8,LPC_4)对卵透明带及卵细胞质有交叉反应,而对卵泡颗粒层,卵泡膜,间质细胞等均无交叉反应。这说明卵细胞质内有与上述单抗结合的抗原决定簇,因此透明带与卵细胞质有共同的抗原成分,这一现象支持了ZP由卵细胞产生的理论。本研究结果提示ZP抗体对卵巢功能的影响是由于抗体和卵细胞结合,早期抑制了卵泡的发育而导致卵泡数目减少,内分泌功能下降,而不是直接作用颗粒层和卵泡膜而使激素分泌紊乱。     

猪卵透明带单克隆抗体的研制及其对人精卵结合的影响

由于猪卵透明带（ＰＺＰ）与人ＺＰ有交叉抗原性［１］。因而被用之为人类免疫避孕的研究。当前国内外已用分子生物技术分离获ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、ＺＰ４几个组分［２］,并通过去糖基将ＺＰ３分成ＺＰ３α与ＺＰ３β［３］,在动物实验中可致动物不孕,但对生育的可逆性与卵巢的无损伤性还不理想,鉴于不明原因不孕妇女能检测到ＺＰＡｂ［４］,提示应用杂交瘤技术制备其单克隆抗体（ｍＡｂ）,以期得到既具有精卵识别的特异性,又能不影响卵巢功能的特异抗原决定簇,仍然是一条可行的途径。材料与方法一、动物免疫［５］以热融解猪Ｚ…     

猪卵透明带单克隆抗体的研制

用热溶猪卵透明带抗原免疫BALB/C 小鼠,取其脾细胞和SP2/O 细胞融合产生的杂交瘤。用间接免疫荧光和ELISA 方法筛选,经四次克隆化后,获得三株分泌猪卵透明带单克隆抗体杂交瘤细胞株(LPD_8,LPC_4,LPD_2)。通过间接免疫荧光试验,其中二株单克隆抗体(LPD_8,LPC_4)与人卵透明带有交叉反应。但它们在猪与人卵透明带上呈现的荧光部位有明显的不同,LPD_8位于整个透明带上,而LPC_4只见于透明带外层。LPD_2荧光位于透明带内层且与人卵无交叉反应。我们认为这种差别是由于抗原决定簇的不同所致。     

翻译起始区突变对猪卵透明带-3β蛋白在E.coli表达的影响

目的:探讨翻译起始区(translation initiation region,TIR)突变对两种氨基酸序列长度不同的猪卵透明带蛋白pZP3β161和pZP3β263在大肠杆菌中表达的影响。方法:应用DNASIS软件辅助分析,分别设计5条不同的上游引物对两种pZP3β基因的TIR区的G+C含量和自由能进行合理调整,PCR扩增后将获得的基因片段克隆入pET-3c载体,于大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达。结果:TIR对pZP3β表达有明显的影响,其表达的pZP3β161蛋白和pZP3β263蛋白分别占菌总蛋白的25％和15％。结论:在不改变氨基酸的条件下,通过对目的基因TIR进行适当改造,能够有效提高目的蛋白的表达效率。     

对猪卵透明带抗原杂交瘤制备的初步研究

抗透明带抗体对透明带溶解、精子穿透以及透明带脱落的抑制效应已被证实,本实验应用细胞融合技术制备猪卵透明带(PZ)单克隆抗体,探讨应用抗PZ 单克隆抗体对PZ 抗原结构及特性进行研究的途径。先后进行了六次细胞融合,五次融合获得成功。共接种1728孔,有克隆生长255孔,平均融合率15%。ELISA 检测246孔,初筛抗体阳性9孔,连续多次检测抗体持续阳性2孔。随后采用有限稀释,进行克隆化培养。卵细胞表面沉淀试验表明,阳性杂交瘤培养上清液与无卵丘卵子表面形成明显的沉淀层。分别采用分子量为1000和4000的PEG 作细胞融合,克隆生长孔各为34与29,阳性克隆孔数分别为2和3。对融合后无饲养细胞培养的观察说明,无饲养细胞生长克隆孔数是13,含饲养层生长克隆孔数为34,融合率各为4.5%与11.8%。     

基因重组大肠杆菌表达截短型pZP3β的发酵条件优化

目的:对已构建好的表达pZP3β蛋白(pZP130)工程菌的培养条件进行优化,通过在5L罐中发酵和Ni柱纯化,以期获取较大量目的产物。方法:在摇瓶中改变不同的培养及诱导条件,比较工程菌的生长和目的蛋白的表达,优化发酵条件;并在5L发酵罐中进行发酵,获得菌体,破碎后进行Ni柱纯化。结果:优化的发酵条件是:10%的接种量,加入2%甘油的培养基培养菌体3h后加入0.5mmol/LIPTG,诱导4h后收样。在5L发酵罐中发酵,获得菌体量36g/L,经Ni柱纯化,获得蛋白粗制品33mg/L发酵液。结论:截短型pZP3β蛋白可以在E.coli中获得较高表达,并且可以通过发酵和Ni柱纯化得到较大量的蛋白,这有助于pZP的深入研究和应用。     

翻译起始区突变对猪卯透明带-3β蛋白在E．coli表达的影响

目的：探讨翻译起始区（translation initiation region，TIR）突变对两种氨基酸序列长度不同的猪卵透明带蛋白pZP3β161和pZP3β263在大肠杆菌中表达的影响。方法：应用DNASIS软件辅助分析，分别设计5条不同的上游引物对两种pZP3β基因的TIR区的G＋C含量和自由能进行合理调整，PCR扩增后将获得的基因片段克隆pET-3c载体，于大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中诱导表达。结果：TIR对pZP3β表达有明显的影响，其表达的pZP3β161蛋白和pZP3β263蛋白分别占菌总蛋白的25％和15％。结论：在不改变氨基酸的条件下，通过对目的基因TIR进行适当改造，能够有效提高目的蛋白的表达效率。     

猪卵透明带单克隆抗体靶抗原生化特性的研究

猪卵透明带单克隆抗体靶抗原生化特性的研究孙晓溪，李大金，李超荆（上海医科大学妇产科研究所生殖免疫室，上海，２０００１１）哺乳类卵细胞外的透明带（ＺＰ）在识别同种精子受精、阻止多精子穿入等方面起重要作用，并具有组织专一性，仅影响受精过程，故是有吸引力的...     

卵透明带蛋白质的结构功能及基因表达

哺乳动物卵透明带（Zonapellucida，ZP）是包绕生长如母细胞、排出卵子和分裂胚胎的一层半透明丝状体酸性糖蛋白基质。ZP在精卵识别、结合和穿透的过程中以及阻止多精入卵和保护着床前胚胎方面，都起着至关重要的作用，所以它自然成为生殖生物学者极感兴趣的研究对象和生殖免疫学者倍加关注的热门靶抗原。ZP结构复杂，各组成蛋白分子量大且纯化不易，这些因素都影响了ZP基础和应用研究的深入。但随着近年来分子生物学技术的介入，在ZP领域还是取得了许多个人瞩目的进展。本文将对ZP的组份、结构和功能以及它的表达机制作一简明综述。…     

哺乳动物卵透明带蛋白中C端furin位点存在的意义

根据已克隆的各哺乳动物物种卵透明带(ZP)三种蛋白质的cDNA序列推断,在它们编码的蛋白C端跨膜区上游几乎都存在RXK/RR基序。先前报道存在于许多蛋白C端的这一基序是furin蛋白酶的一个酶切位点。因此,为了阐明各ZP蛋白组份在分泌组装成ZP带时,是否在此furin位点经历了加工处理,以致丢弃它们C端的疏水性跨膜区,几个实验室相继从不同角度用不同方法进行了探讨。从目前的大多数实验结果来看,三个ZP组成蛋白分泌前在它们C端跨膜区上游的furin位点被切割的证据是充分的。当然也有相反的实验证明,即各ZP蛋白不经历此位点切割也能被分泌并进行ZP组装和扩张。对此截然相反的研究结果,一个可能的解释,也许是重组小鼠ZP3中分别选用了不同的表位标签和插入位置以及使用了不同的转染细胞株。     

17D_3pZP单克隆抗体对卵透明带及卵巢等组织的免疫学反应

目的: 观察单克隆抗体17D3pZP对猪卵透明带,人卵透明带及人卵巢等组织的免疫学反应。方法: ABC酶免疫组织化学技术。结果: 17D3pZP单克隆抗体能特异性识别猪卵透明带及人卵透明带抗原,而与人卵巢及其他各重要脏器组织无反应。结论: 17D3pZP单克隆抗体能识别卵透明带抗原,而与机体其他组织抗原无交叉反应。有望通过它进一步提取并纯化相应靶抗原,为制备卵透明带免疫避孕疫苗奠定基础。     

非全长型人卵透明带-3蛋白慢病毒表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中表达的研究

目的:构建含非全长型人卵透明带-3蛋白(hZP3)的慢病毒载体,转染293FT细胞获得重组慢病毒颗粒,感染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)使其表达hZP3。方法:将hZP3基因序列插入到慢病毒系统的入门载体pENTR-11中构建为pENTR-hZP3,采用LR重组酶将pENTR-hZP3和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成新重组载体pLenti6/V5-DEST-hZP3。将该重组载体和其它viruspower 3个质粒载体充分混合,用阳离子脂质体转染293FT细胞,培养和待细胞完全裂解后收集富含hZP3基因的病毒颗粒上清液,取适量上清液感染CHO-K1细胞,采用杀稻瘟Blastcidin筛选,挑单克隆对其扩增培养,进行基因水平和蛋白水平的鉴定。结果:获得的含hZP3基因的病毒颗粒上清液滴度为1×105TU/ml,随机挑取的16株单克隆细胞中,有9株表达hZP3。结论:成功构建含hZP3的慢病毒表达载体,获得表达hZP3的CHO株,为后续研究与开发奠定了基础。     

去透明带地鼠卵穿透试验与人工授精受孕率关系的临床研究

对１１８对不孕夫妇，拟采用ＩＵＩ前用ＨＯＰ系统检测男方精液，并以精子穿卵率为指标进行分组，统计ＩＵＩ的受孕率。结果：１１８例的４１２个治疗周期中，第一组：穿卵率≥１５％的患例，ＩＵＩ受孕率为４２％；第二组：１０％≤穿卵率＜１５％的患例，ＩＵＩ受孕率为１３％；第三组：穿卵率＜１０％者，ＩＵＩ受孕率为２％。第一组与第二、三组间其受孕率有明显差异，经统计学检验有显著意义（Ｐ＜０．００５）。结果表明，采用ＨＯＰ作为ＩＵＩ病例筛选指标，提高ＩＵＩ的成功率，对不孕症病因诊断与治疗具有重要的临床实用价值。     

少量人类精子以空卵透明带为冻贮载体的冷冻保存

目的:探讨空卵透明带作贮存载体冷冻保存少量人类精子。方法:将人或金黄地鼠卵内的细胞成份全部除去,制备成空卵透明带,分别显微注入人睾丸精子、附睾精子和射出精子后冷冻保存,并与正常供精者射出精子作对照。结果:解冻后卵透明带在溶液中容易识别寻找,卵透明带内的精子易于观察。附睾精子组(n=11)与供精者射出精子组(n=7)的冷冻精子活动率和存活率无显著性差异(P>0.05),但睾丸精子组(n=7)这两项参数值均显著低于附睾精子和射出精子组(P<0.01)。含6％、7.5％和9％不同甘油浓度的冷冻保护剂,对冷冻精子活动率无显著性影响(P>0.05);冻贮于人和金黄地鼠空卵透明带内的精子,两者的冷冻精子活动率也无显著性差异(P>0.05〕。结论:空卵透明带是冻贮少量人类精子的合适载体。     

偏振光显微镜分析人卵透明带与胚胎发育潜能的关系

目的:探讨IVF胚胎的发育潜能。方法:共对49个周期的267个卵子在ICSI前用偏振光显微镜下摄像进行透明带厚度(ZPT)和密度(ZPD)分析。结果:①年龄<37岁组与≥37岁组卵子比较,组间各层ZPD、ZPT及全层ZPT均无显著差异;②优质胚胎组卵子全层ZPT(15.96±2.21μm)显著低于劣质胚胎组(16.89±2.34μm),P<0.05;③妊娠组卵子内层ZPD(2.02±0.47nm)和全层ZPT(15.97±2.45μm)均低于未妊娠组(2.24±0.57nm)和未妊娠组(17.09±2.46μm),差异有统计学意义,P<0.05。结论:偏振光显微镜能够检测透明带厚度和密度,卵子透明带结构与胚胎质量及妊娠率有相关性,与年龄无关,偏振光显微镜测定卵子透明带结构可预测卵子及胚胎的发育潜能。     

精子与卵母细胞透明带结合对ICSI治疗结局的影响

目的:探讨使用透明带结合后的精子行ICSI,是否可改善ICSI治疗结局。方法:选择上一周期IVF完全不受精者或男方为少、弱、畸形精子症而接受ICSI治疗的不育患者,共收录106对不孕夫妇,将其随机分成常规ICSI对照组和利用未成熟卵透明带上结合的精子进行ICSI的试验组,每组53例,分析比较ICSI结局。结果:试验组的卵裂率、优质胚胎率、可使用胚胎率均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。虽然临床妊娠率试验组(36%,19/53)与对照组(49%,26/53)组间无统计学差异(P>0.05),但试验组种植率(29%)、多胎率(35.71%,10/26)明显高于对照组(17%、10.53%,2/19)(P<0.01)。结论:通过利用患者自体ZP结合的精子进行ICSI注射,能获取高质量胚胎和高种植率,这种改良的ZP结合ICSI方法或许能为今后ICSI治疗提供一个新的思路。