靶向Polo-like kinase 1基因的shRNA对肝癌BEL-7402细胞株生物学行为的影响

目的利用RNA（RNAi）干扰技术,研究表达Polo-like kinase 1（Plk1）的短发夹RNA（shR-NA）载体对肝癌细胞株BEL-7402生物学行为的影响。方法根据靶基因的不同区域构建针对Plk1mRNA的两组干扰质粒shRNA-Plk1：Plk1siRNA-251,Plk1siRNA-1396以及阴性对照质粒Plk1siRNA-hk,利用电穿孔法转染入肝癌细胞株BEL-7402,获得稳定表达的克隆后,RT-PCR检测肝癌细胞株BEL-7402的Plk1mRNA的变化,Western blot检测Plk1蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果利用电穿孔将载体转入肝癌细胞株BEL-7402,利用G418筛选,获得稳定表达的克隆。RT-PCR检测Plk1siRNA-251,Plk1siRNA-1396组Plk1mRNA表达较Plk1siRNA-hk转染组与空白对照组明显下降（P〈0.01）。Western blot检测转染BEL-7402细胞shRNA载体后的Plk1蛋白的表达分别为0.032±0.007、0.040±0.008、0.272±0.041、0.278±0.053。MTT检测发现转染shRNA载体后BEL-7402细胞增殖明显减慢。细胞周期检测证实转染Plk1siRNA可以引起BEL-7402细胞G0/G1期减少,G2/M期增高,而对S期影响不大。结论成功构建出两条能特异而高效抑制Plk1基因表达的shRNA,可以显著抑制Plk1 mRNA的转录及Plk1蛋白的表达,并明显抑制细胞增殖,从而为肝癌的基因治疗提供新的切入点。     

胃癌KATO-Ⅲ细胞CD133基因的siRNA干扰及其效果比较

目的 比较3段化学合成的siRNA对KATO-Ⅲ胃癌细胞中CD133基因的抑制效果,并初步探讨CD133基因表达被抑制后对胃癌细胞增生的影响.方法 实验分为空白对照组、阴性对照组、CD133siRNA-1组,CD133siRNA-2组和CD133siRNA-3组.针对CD133mRNA序列设计并合成3段siRNA,利用荧光标记的siRNA转染KATO-Ⅲ胃癌细胞后,通过共聚焦显微镜荧光计数检测其转染率,用RT-PCR法和Western blot法检测并比较3段siRNA对CD133基因表达的沉默效果,采用CCK-8法检测CD133表达被抑制后对胃癌细胞增生的影响.结果 siRNA在KATO-Ⅲ细胞中的转染效率可达到(85±8)％,所设计的3段siRNA均可显著抑制胃癌KATO-Ⅲ细胞CD133基因的表达,抑制率分别为(11±2)％、(19±2)％和(24±3)％.与空白组比较,CD133siRNA-3转染组细胞的增生活性降低了(42±4)％(P＜0.05).结论 成功转染并抑制了KATO-Ⅲ胃癌细胞中CD133基因的表达,并从中筛选出了干扰效果最佳的CD133siRNA片段,为后续CD133+胃癌细胞的干扰提供初步的实验研究.     

shRNA-CXCR4对人胃癌BGC823细胞增殖迁移的影响

目的 构建针对人CXCR4基因的shRNA干扰表达载体,观察CXCR4基因表达对人胃癌细胞株BGC823细胞增殖和迁移能力的影响.方法 根据人CXCR4序列设计并构建CXCR4基因的shRNA真核表达载体,以脂质体转染的方法将CXCR4干扰质粒转染至人胃癌细胞株BGC823,经G418筛选出稳定转染的阳性细胞,应用流式细胞仪技术检测其细胞周期变化,噻唑蓝(MTT)比色法检测CXCR4干扰对胃癌细胞增殖的影响,采用Trans-well小室法检测细胞体外迁移能力.结果 经测序证明CXCR4的shRNA基因已成功插入Psilencer4.1质粒中,构建的干扰质粒能够显著抑制CXCR4的表达,CXCR4 mRNA被抑制了(2.7±0.2)倍(P＜0.01).CXCR4基因的表达下调将胃癌细胞阻滞在G1期(由84.2％升至94.1％),MTT法检测CXCR4-shRNA干扰细胞增殖(P＜0.05),且穿过Trans -well小室膜的细胞数显著下降(P＜0.05).结论 干扰CXCR4的表达可显著抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力.     

转染TSLC1基因肝癌细胞株BEL-7402生物学特性的研究

目的 将人TSLCl基因转染人肝癌细胞BEL-7402中稳定表达,检测转染后细胞生物学特性的变化.方法 用脂质体法将TSLCl基因的真核质粒表达载体pcDNA3.1(+)/TSLCl导人人肝癌细胞株BEL-7402中,G418筛选克隆,再以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、Western blot的方法检测TSLCI的表达,细胞计数、流式细胞术及裸鼠负荷瘤实验分析转染后细胞的生物学特性变化.结果 TSLCl在BEL-7402细胞中的表达可抑制BEL-7402细胞的生长,BEL-7402-TSLCI与BEL-7402比较s期及G2/M期的细胞减少,G0/G1期的细胞增加.转染后的BEL-7402-TSLCl细胞的凋亡明显增加,转染后荷瘤裸小鼠肿瘤的生长受到抑制.结论 TSLCl基因的转染可以抑制BEL-7402细胞的增殖、诱导肝癌细胞的凋亡,为肝癌的基因治疗提供理论依据.     

干扰多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1促进人胶质母细胞瘤U251细胞株侵袭性的机制

目的 探讨干扰多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)基因表达促进人胶质母细胞瘤U251细胞株侵袭性的机制.方法 用携带U6启动子的LRIG1特异性短发夹RNA (shRNA)序列的质粒载体pGenesil2-LRIG1-shRNA (siRNA)及含非特异shRNA编码序列的对照质粒pGenesil2-negative shRNA(neg)转染U251细胞株,通过G418筛选,鉴定得到稳定转染细胞株.采用侵袭实验验证干扰LRIG1对U251侵袭性的影响,通过明胶酶谱实验检测基质金属蛋白激酶(MMP)-2、MMP-9的活性,Western blot法检测表皮生长因子(EGFR)及其下游丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B( P13K/AKT)信号通路蛋白的表达差异.结果 含U6启动子LRIG1 shRNA序列的质粒转染干扰组LRIG1 mRNA降低至对照组(35.3％～39.2％,P＜0.05).干扰LRIG1表达组U251细胞侵袭数[(159±15)～ (188±9)/视野],较空白对照组细胞侵袭数[(28±9)/视野]明显增多(P＜0.05);干扰LRIG1激活EGFR通路传导;干扰LRIG1后干扰组MMP-2较对照组活性增加(1.66±0.11～1.96±0.12,P＜0.01),MMP-9干扰组较对照组活性增加(4.82±0.27～4.47±0.29).结论 LRIG1表达下调后MMP-2、MMP-9活性增强,从而促进U251细胞的侵袭性,可能通过激活EGFR信号通路引起.     

RNA干扰对肝癌细胞CDC20表达的影响

目的 观察RNA干扰(RNAi)对肝癌细胞株Hepal-6中CDC20表达的抑制作用.方法 设计针对小鼠肝癌细胞Hepal-6 CDC20 mRNA的小干扰RNA(siRNA),以阳离子脂质体包埋后转染鼠肝癌细胞Hepal-6,转染48 h后,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法 检测Hepal-6细胞CDC20 mRNA及蛋白质表达的变化.结果 siRNA各组与正常对照组和阴性对照组比较,CDC20 mRNA的表达均受明显抑制,并呈剂量依赖性(在100、50、25 nmol/L浓度下,Mixed siRNA组与正常对照组mRNA表达比较:0.370±0.058比0.840±0.044,0.480±0.081比0.900±0.068,0.830±0.062比1.010±0.054,各组P＜0.01);CDC20蛋白质的表达亦均受抑制(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3及Mixed组与N-Cont或Blank组蛋白质表达比较:0.482±0.035/0.402±0.003/0.479±0.026/0.446±0.017比0.826±0.03l或0.835±0.024,各组P均＜0.01).结论 CDC20 siRNA可显著抑制小鼠肝癌细胞Hepal-6中CDC20 mRNA和蛋白质的表达.     

转铁蛋白受体介导的Survivin对U251细胞生长的抑制作用

目的 构建Survivin短发夹状RNA(shBNA)序列的表达载体并观察其对神经胶质瘤细胞U251生长的抑制作用.方法 针对Survivin基因编码shRNA的序列,克隆到携带绿色荧光蛋白基因的载体,经酶切电泳和DNA测序鉴定.采用转铁蛋白.多聚乙烯亚胺(Tf-PEI)介导的转染方法 将重组的shRNA质粒转入U251细胞后,通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别检测Survivin inRNA和蛋白表达;采用MTF法测定细胞增殖.结果 编码短发夹状的RNA序列被成功地插入到预期位点.转染Survivin shRNA1、shRNA2载体分别入U251细胞后,其bcl-2蛋白表达水平均显著降低,P＜0.05.U251细胞在48、72和96 h细胞生长明显受到抑制,分别与转染阴性shRNA组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 构建的Survivin shRNA可特异性地抑制U251细胞生长.     

人类白细胞抗原-GRNA干扰载体的构建及效应检测

目的构建表达人类白细胞抗原-G(HLA-G)基因shRNA载体,探讨其对NK细胞杀伤效应的影响。方法构建4个HLA-G-shRNA真核表达质粒,瞬时转染至人肝癌Bel-7402细胞,检测HLA-G mRNA和蛋白水平的表达。将NK-92MI细胞(效应细胞)与转染后的Bel-7402细胞(靶细胞)共同培养,以LDH释放法观察不同效靶比时NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤效应。结果经酶切及测序鉴定证实,插入序列与设计的序列相符。RT-PCR和Western blot结果均表明重组载体抑制了Bel-7402细胞HLA-G基因的表达。NK-92MI细胞对转染HLA-GshRNA的Bel-7402细胞杀伤作用明显增强(P<0.01)。封闭NK-92MI细胞KIR2DL4受体后,杀伤作用减弱(P<0.01)。结论成功构建了HLA-G shRNA载体,下调HLA-G可以增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤效应,HLA-G与NK细胞表面KIR2DL4受体结合后,向NK细胞传递抑制效应。     

维生素E联合顺铂抑制肝癌细胞BEL-7402体外增殖作用及其机制

目的 观察维生素E联合顺铂对肝癌细胞株BEL-7402体外增殖的抑制作用并探讨其作用机制.方法 将不同浓度的顺铂及维生素E作用于BEL-7402细胞,观察细胞增殖抑制率.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法分析信号转导与转录激活因子-3(STAT3)mRNA的表达.应用流式细胞术、免疫组织化学等方法检测细胞的凋亡.结果 单纯化疗对BEL-7402细胞增殖的抑制率分别为(14.3±3.2)%(24 h)、(21.9±3.5)%(48 h),联合组对BEL-7402细胞增殖的抑制率分别为(25.6±4.2)%(24 h)、(43.3±5.1)%(48 h),两者之间差异均有统计学意义(P<0.05).对照组、单纯化疗组、联合组肝细胞STAT3 mRNA表达水平分别为0.875±0.106、0.726±0.083、0.135±0.018,对照组与单纯化疗组比较差异无统计学意义(P>0.05),单纯化疗组与联合组之间差异有统计学意义(P<0.01).单纯化疗组细胞凋亡率(7.62±0.89)%、G_1期细胞比例(39.98±3.65)%,联合组细胞凋亡率(15.98±1.03)%、G_1期细胞比例(56.23±3.32)%,两者之间差异均有统计学意义(P<0.05).单纯组Fas、bcl-2蛋白表达阳性率分别为(16.8±1.3)%、(30.2±3.8)%,联合组Fas、bcl-2蛋白表达阳性率分别为(32.5±3.6)%、(15.5±1.2)%,两者之间差异均有统计学意义(P<0.05).结论 维生素E联合顺铂可显著抑制BEL-7402细胞的生长增殖,其机制可能与下调STAT3 mRNA的表达,阻滞肿瘤细胞信号转导通路有关.     

靶向CTNNB1的shRNA抑制结肠癌SW480细胞增殖的研究

目的探讨靶向CTNNB1的shRNA对人结肠癌SW480细胞的基因下调效应和细胞增殖的抑制作用.方法构建靶向CTNNB1的shRNA载体质粒,然后转染入结肠癌SW480细胞.用RT-PCR和Western blotting方法检测CTNNB1的mRNA和蛋白的表达情况.MTT实验评价转染后各组细胞的增殖情况,并用流式细胞仪检测各组细胞的周期分布和凋亡情况.结果靶向CTNNB1的shRNA能够明显下调CTNNB1 mRNA和蛋白质表达（P＜0.05）,其抑制率分别是43.87%和45.16%.MTT实验提示CTN组细胞在转染后呈现随着时间延长而进行性增殖抑制的现象.在转染后72 h,CTN组的细胞存活率为46.4%,与空白对照组相比有显著性降低（P＜0.05）.而流式细胞仪显示CTN组细胞有明显G0/G1周期阻滞和凋亡率增高（P＜0.05）.结论靶向CTNNB1的特异性shRNA对结肠癌SW480细胞具有下调CTNNB1基因表达,促进细胞凋亡并且显著抑制细胞增殖的效应.     

KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因联合survivin基因干扰抑制肝癌细胞生长的体内研究

目的：探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因系统（Ad-KDRP-CD/TK）联合survivin基因干扰对肝癌细胞在裸鼠体内生长的抑制作用。
　　方法：将20只裸鼠随机分均为模型组（皮下植入BEL-7402肝癌细胞成瘤,不加任何处理）、双自杀基因转染组（皮下植入转染Ad-KDRP-CD/TK的BEL-7402细胞,成瘤后瘤内注射前药更昔洛韦与5-氟胞嘧啶）、survivinsiRNA转染组（皮下注射BEL-7402肝癌细胞,成瘤后瘤内注射survivinsiRNA/Lip-DMEM转染混合物）、联合转染组（双自杀基因转染+survivinsiRNA转染处理）。治疗2周后处死各组小鼠,称取肿瘤质量,计算肿瘤抑制率,检测瘤组织微血管密度（MVD）及survivinmRNA与蛋白表达。结果：各治疗组的肿瘤质量明显小于模型组（均P<0.05）,且联合转染组的抑瘤率最大（均P<0.05）;肿瘤组织MVD、survivinmRNA与蛋白水平均明显降低,且联合转染组的降低程度最为明显（均P<0.05）。
　　结论：双自杀基因联合survivin干扰是抑制鼠肝癌细胞在体内生长的有效途径。     

靶向Bel-7402/ADM细胞MDR1基因高效siRNA的构建与鉴定

目的 构建并鉴定靶向人肝癌多药耐药细胞亚系Bel-7402/ADM细胞MDR1基因的高效siRNA,为逆转肝癌多药耐药提供新的分子靶点.方法 设计并化学合成4条靶向MDR1的siRNAs(mdrlsi-1、mdrlsi-2、mdrlsi-3和mdrlsi-4),通过LipofectamineTM2000介导转染Bel-7402/ADM细胞株,用RT-PCR检测Bel-7402/ADM细胞MDRlmRNA表达、western blot检测P-gp的表达,综合评价这4条siRNAs的沉默效果.结果 经siRNA干扰后,4条siRNAs均能不同程度逆转Bel-7402/ADM细胞MDR1介导的多药耐药,mdrlsi-1组mRNA和蛋白表达与其他组比较有显著性差异(P＜0.05).结论 相比较其他3条siRNAs,mdrl si-1对人肝癌Bel-7402/ADM细胞MDR1介导的耐药逆转效果最好,其靶序列有望成为逆转肝癌多药耐药新的靶点.     

脑源性神经营养因子对肝癌细胞氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

目的：探讨外源性脑源性神经营养因子（BDNF）对人肝癌Bel-7402细胞氟尿嘧啶（5-FU）化疗敏感性的影响。 方法：分别用5-FU（5-FU组）和5-FU+BDNF（5-FU+BDNF组）处理Bel-7402细胞,以无干预的 Bel-7402细胞作为对照组。用MTT法、克隆形成试验和流式细胞仪检测细胞生长与凋亡情况,RT-PCR法检测细胞bcl-2 mRNA的表达。 结果：5-FU组细胞OD值、克隆形成数明显降低,细胞凋亡率明显升高,bcl-2 mRNA表达明显下调（均P<0.05）,与对照组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）;而5-FU+BDNF组以上指标的改变均不明显,与对照组的差异均无统计学意义（均P>0.05）。 结论：BDNF能降低肝癌Bel-7402细胞5-FU化疗敏感性,该作用可能与BDNF上调bcl-2的表达,从而抑制细胞凋亡有关。     

西罗莫司诱导人肝癌细胞株BEL-7402凋亡及其机制

目的探讨西罗莫司（SRL）在体外诱导人肝癌细胞株BEL-7402的凋亡作用及其机制。方法以不同浓度的SRL（5、10、20、30、40和50nmol／L）作用于体外培养的人肝癌细胞株BEL-7402，应用流式细胞仪检测培养24、48和72h时的细胞凋亡情况；Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡时的形态学变化；Western Blot法观察BEL-7402细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bcl-xl和Bax基因的表达变化；采用Caspase-3试剂盒检测Caspase-3酶的活性；JCl染色法检测细胞线粒体膜电位（△ψbm）。结果SRL可诱导BEL-7402细胞凋亡，并与药物浓度和作用时间呈正相关。SRL作用BEL-7402细胞后48h，在Hoechst33258荧光染色图片上可见核浓缩及核碎裂等典型的细胞凋亡特征，凋亡过程中线粒体膜电位下降及Caspase-3酶原蛋白激活，伴有Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达的降低和Bax蛋白上调。结论SRL能使抗凋亡蛋白Bcl-2、gcl-xl表达降低，促凋亡蛋白Bax表达上调，线粒体膜电位下降，激活Caspase-3酶原蛋白，从而诱导细胞凋亡。     

TGF—β1抑制肝癌细胞株BEL—7402的增殖

目的 研究转化生长因子－β１对体外培养肝癌细胞株ＢＥＬ－７４０２增殖的影响。方法 用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入方法检测ＴＧＦ－β１对肝癌细胞株ＢＥＬ－７４０２增殖的抑制率;用逆转录整合酶链方法检测转化生长因子－β１及其Ⅱ型受体在ＢＥＬ－７４０２中的基因表达。