新生隐球菌随机扩增DNA指纹分型研究

目的　用随机引物扩增新生隐球菌临床和环境分离株的DNA ,观察DNA指纹与血清型的关系 ,探索新生隐球菌基因分型标准。方法　采用 3种不同寡核苷酸重复序列 [CN1(GTG) 5、CN2(GACA) 4和CN3(GATA) 4]为引物 ,对从临床和鸽粪中分离到的 2 4株血清A型和 8株四种血清型的新生隐球菌标准株的DNA进行扩增 ,根据扩增产物的电泳带型来对比DNA指纹和血清型之间的关系。结果　 2 4株临床和鸽粪分离的血清A型株中 ,2 0株产生和标准株完全相似的DNA带型 ,1株与标准D型DNA带型相似。 3株的PCR指纹与血清A、B、C、D型均不相同。 2株B型和 2株C型产生几乎完全一致的DNA指纹带型。结论　①大多数血清A型新生隐球菌菌株具有相似DNA指纹带型。②血清B型和C型 (gattii变种 )的DNA带型不易区别。③相同血清型不同的株可能有不同的DNA指纹带型。④PCR法用于新生隐球菌菌株鉴定是一种快速、方便、可行的方法。     

PCR-RFLP和PCR指纹法在新生隐球菌基因分型中的应用与比较

目的 探讨针对结构基因g6341的PCR－RFLP方法在新生隐球菌基因分型中的应用价值, 并与PCR指纹分型法进行比较。方法 以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物，对受试的新生隐球菌进行PCR指纹分型。选择结构基因g6341进行PCR－RFLP分析，在序列保守区设计通用引物，筛选合适的限制性内切酶进行RFLP分析，并与PCR指纹法进行比较。g6341基因扩增片段测序，进行系统发育分析，研究各主要基因型间的亲缘关系。结果 多位点基因序列分析表明，结构基因g6341可作为RFLP分析的合适靶点。对76株新生隐球菌的基因分型结果显示，针对g6341的PCR-RFLP方法与PCR指纹法结果一致。分析g6341基因部分序列得出，8种主要基因型菌株相互间的同源性在84％ ～ 97％之间，同一主要基因型菌株的同源性在99％ ～ 100％之间。分子发育树中，VNⅠ－VNⅣ基因型、VGⅠ－VGⅣ基因型分别聚在一类。结论 针对结构基因g6341的PCR-RFLP方法可作为新生隐球菌分子分型的有效工具，对g6341基因的序列分析可揭示不同菌株间的遗传进化关系。     

新生隐球菌的PCR指纹分析

传统的新生隐球菌的分型主要采用依据荚膜抗原决定簇的血清分型方法。但仅能分成数种血清型,用于菌株间的变异分析显得无能为力。有资料表明相同血清型的新生隐球菌菌株可呈现明显不同的病理、生理反应^[1,2].我们采用PCR指纹技术对新生隐球菌不同分离株进行了DNA多态性分析,现将结果报道如下。一、材料与方法(一)菌株:新生隐球菌参考菌株D48、ATCC64538、ATCC64528为A血清型,RV45981、RV59939、RV60047、RV43185为D血清型,RV52643、RV54135为B血清型,RV52646、RV45978为C血清型,除D48株为WHO赠送外,其余均为比利时热带病研究所赠送。     

用改进的PCR方案测定PCR指纹条带序列后设计的特异引物对新生隐球菌新生变种作基因分型

新生隐球菌新生变种通过用 (ＧＡＣＡ) 4 引物采用ＰＣＲ指纹法可产生 4条主要条带 (42 0、4 75、5 4 0和80 0ｂｐ) ,根据它们不同的组合可以被再分为 6种基因型 (ＶＮ1～ＶＮ6 )。该研究的目的是确定能扩增这4条主要条带的特异性引物。首先须测定这 4条主要条带的核苷酸序列 ,为此作者建立了一种无需克隆载体的改进的ＰＣＲ测序方案以克服用 (ＧＡＣＡ) 4作单循环测序引物的缺陷 ;而后以获得的序列设计新引物 ,通过对新生隐球菌和其他酵母株的扩增 ,以证实新引物具有种的特异性 ,可用作新生隐球菌的分子分型。材料和方法 :①抽提 12株新生…     

几种隐球菌酶扩增核糖体DNA图谱及快速基因鉴定

DNA的聚合酶链式反应(PCR)和核糖体DNA(rDNA)位点内限制酶切片段长度的多态性分析(RFLP)是遗传学分析的新方法,作者将这两种方法用于隐球菌rDNA的分析.受试菌种含新生隐球菌(19株)、浅白隐球菌(5株)、指甲隐球菌(2株)、罗伦隐球菌(4株)、黑隐球菌(1株)、白念珠菌(2株).将经土豆浸汁培养基中     

CAP64荚膜相关基因在新生隐球菌分型中的意义

新生隐球菌的多聚糖荚膜成分是新生隐球菌血清型分型的物质基础^[1],而CAP64荚膜相关基因是新生隐球菌荚膜合成的必需基因之一^[2],我们根据新生隐球菌血清型DCAP64荚膜基因的序列设计引物,将设计的引物扩增5个标准血清型新生隐球菌,已分型和未分型新生隐球菌临床分离株,以及其他的致病真菌,以寻找引物的型特异性。     

新生隐球菌对鼠小胶质细胞细胞骨架蛋白质组的影响

目的:探讨新生隐球菌对鼠小胶质细胞(N9)蛋白质组的影响.方法:分别提取正常N9细胞以及与新生隐球菌(ATCC32609)作用后的N9细胞的蛋白质样品,采用双向电泳技术分离,对部分差异的蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析,测定其肽质量指纹图谱,在网上蛋白质数据库检索鉴定差异蛋白.结果:获得较好的双向电泳图像,图像分析显示:在与新生隐球菌作用前、后检测到N9细胞的蛋白质点分别是(701±29)个、(980±20)个,对表达差异的18个蛋白质点进行肽质量指纹图谱分析,经数据库检索后,鉴定出3个涉及小胶质细胞细胞骨架的蛋白质:anillin、pencentnn 2、核苷二磷酸激酶A[nucleoside diphosphate kinase A(NDP kinase A,NDPKA)].结论:新生隐球菌对小胶质细胞的细胞骨架蛋白质造成影响,这有助于在分子水平理解隐球菌性脑膜炎的发病机制.     

新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定

目的 建立一种基于核糖体基因内间隔区（IGS）的多重聚合酶链反应（PCR）,用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌。方法 选取新生隐球菌和格特隐球菌IGS中变异度最高的Ⅰ区（IGS1）为靶点,经ClustalW2多重比对,并结合Oligo6软件在不同序列位点设计针对新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌的引物用于多重PCR分析。通过51株新生隐球菌（VNⅠ-VNⅣ和VNB基因型）和41株格特隐球菌（VGⅠ-VGⅣ基因型）对该方法进行验证,并将该方法与已报道的CGB显色培养和采用特异性引物GPA1A、CLA4D和SOD1gattii扩增格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的单一引物PCR方法进行比较。结果 基于IGS的多重PCR分析成功鉴定所有92株新生隐球菌和格特隐球菌,对其他常见致病酵母的扩增均阴性,显示所设计引物较高的特异性;已报道的基于GPA1A和CLA4D引物PCR分别在鉴定2株和1株格特隐球菌时出现假阳性结果;CGB培养基在鉴定1株格鲁比变种和1株新生变种时出现假阳性结果。上述方法在鉴定时均未出现假阴性结果。结论 建立的多重PCR可快速准确地鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种、AD杂合子和格特隐球菌,且优于已报道的单一引物PCR 或CGB显色培养法。     

真菌病

20 0 10 0 86　 PCR方法快速检测一些常见医学真菌 /洪少林 (北京医大三院皮肤科 )…∥中国皮肤性病学杂志 .- 2 0 0 0 ,14 ( 4 ) .- 2 2 7～ 2 2 9选取真菌 18Sr DNA基因序列中一对引物 ,对 12种真菌株进行 PCR扩增 ,均扩增出长约 310 bp产物。对一些临床常见细菌扩增均无反应。对酵母样菌、白念珠菌和新生隐球菌计数 ,其最小检出量均为菌体数达每个反应体系 10 3 ( CFU)。本实验过程总需时 36 h以内 ,而血培养需 2～ 5d,且仅 15%～ 50 %播散性念珠菌病 ( DC)患者能检出致病菌 ,因此 ,本法可快速特异性检测一些常见医学真菌。由于 50…     

脑脊液对新生隐球菌和念珠菌的抗真菌活性研究

隐球菌性脑膜炎是隐球菌病中最严重的一型 ,尽管从隐球菌性脑膜炎患者脑脊液 (ＣＳＦ)中可分离出新生隐球菌 ,但对ＣＳＦ影响病原真菌生长的因素知之甚少。作者参照血清抑制新生隐球菌生长因素的研究方法 ,探讨了ＣＳＦ对新生隐球菌和念珠菌的体外抗真菌活性。材料与方法 :新生隐球菌 8株、白念珠菌 2株、光滑念珠菌 1株、克柔念珠菌 1株、乳酒念珠菌 1株。ＣＳＦ过滤除菌后用乳酒念珠菌作生物测试以排除其中的抗真菌药物活性。用ＲＰＭＩ-1 64 0培养液将ＣＳＦ倍比稀释后加入微测量平板中 ,同时用ＲＰＭＩ-1 64 0作对照 ,然后在上述培养基…     

新生隐球菌ISC10基因的cDNA克隆及序列分析

目的克隆新生隐球菌ISC10基因(Meiosis-specific protein required for spore formation)的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析。方法从新生隐球菌B3501菌株中分离提取总RNA,逆转录成cDNA,运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得新生隐球菌ISC10基因,构建pGM-T/ISC10重组载体,测序后与GenBank中ISC10基因(DQ332212)进行同源性比较和序列分析。结果所克隆的基因共编码267个氨基酸,分子量为31.65KD,与GenBank中ISC10基因(DQ332212)序列同源性达99.10%,编码的蛋白质在67位氨基酸由Ala(丙氨酸)突变为Pro(脯氨酸),233位氨基酸由Thr(苏氨酸)突变为Ser(丝氨酸)。结论所克隆的基因为新生隐球菌的一个新基因,其相关生物学信息的明确,为应用分子生物学技术进一步深入研究新生隐球菌的感染和致病机制奠定了基础。     

真菌病

20 0 3 3 1 0 2　氟康唑与 5-氟胞嘧啶体外联合抗新生隐球菌临床分离株的实验研究 /郭秀军 (二军大长征医院皮肤科 )…∥中国中西医结合皮肤性病学杂志 .-2 0 0 3 ,2 (2 ) .-91～ 93实验结果显示 ,联合用药时显著减少了每一药物 MIC值的几何均数 ,3 5%受试菌表现为协同作用方式 ,55%表现为相加作用 ,1 0 %表现为无关作用方式 ,未观察到拮抗作用方式 ;测定不同浓度下药物单独和组合作用的一株菌的菌落形成单位 ,每一联合用药组合都较 5-氟胞嘧啶单独用药有明显减少。说明氟康唑与 5-氟胞嘧啶联合比单一用药抗新生隐球菌的活性高。表 2参 8…     

新生隐球菌28S rDNA的基因型特征与序列分析

目的 探讨新生隐球菌各变种、血清型与基因型的关系。方法 新生隐球菌标准株10株、新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10以及临床分离株19株,采用变性梯度胶电泳(DGGE)结合DNA序列分析,对以上菌株的28S rDNA片段进行研究。结果 经过DGGE和DNA序列分析,所有新生隐球菌新生变种(A、D型)具有一致的基因带型和序列,格特变种(B、C型)具有不同于新生变种的独特一致的带型和序列;AD型的基因型和序列与格特变种完全相同,新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10(D型)的基因型类同于新生变种;19株临床分离菌在DGGE上可分为2型,17株与A、D型完全相同,2株与B、C型相同。结论 DGGE结合DNA序列分析,对于探讨新生隐球菌各变种、血清型的基因型特征、关系具有重要价值;我国非艾滋病隐球菌病感染以新生变种为主,AD型在系统发育上更类同于格特变种,而不是新生变种;本研究不支持A血清型为新生变种以外的新变种即grubii变种的观点。     

新生隐球菌AD血清型是新生变种?

新生隐球菌根据传统的分类方法和以往的观点,血清型AD型新生隐球菌一直被视为新生隐球菌新生变种\,但事实上,AD型新生隐球菌无论在地区分布、致病特征等方面,均与新生隐球菌新生变种中的A型和D型有明显不同^[2,3].本文采用变性梯度胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术和核酸序列分析,首次发现新生隐球菌AD型28S rDNA基因型与新生隐球菌新生变种的A、D型不同,而与新生隐球菌格特变种B、C型完全一致,现报道如下.     

几种快速提取新生隐球菌DNA的方法

目的　探讨几种快速提取新生隐球菌DNA方法的效果。方法　分别用玻璃珠机械破裂法、酶消化法、高渗剂破裂法及三法联合法提取有荚膜的新生隐球菌B 3 50 1野生株DNA ,用联合法提取 5种血清型新生隐球菌标准株的DNA ,用紫外分光光度计检测提取DNA的浓度和纯度。结果　 4种方法抽提 2ml新生隐球菌培养液 (菌体数约为 1×10 8个 /ml) ,可获得DNA的量约是 64～ 2 0 3 μg。酶消化法、高渗剂破裂法及三法联合法抽提的DNA ,其OD2 60 /OD2 80比值均小于 1.8。结论　除玻璃珠机械破裂法外 ,酶消化法、高渗剂破裂法 ,以及三法联合法均可用于快速抽提新生隐球菌的DNA。以三法联合法效果最好     

新生隐球菌生态学研究

目的:研究中国环境中新生隐球菌变种的生态学特点.方法:采集10个城市(3组)鸽粪标本620份和江西贵溪地区澳洲赤桉标本819份;采用咖啡酯玉米山梨醇琼脂(cAcA)培养基分离新生隐球菌,并对菌株进行CGB培养,酚氧化酶、尿素酶、血清型、交配型试验和形态学观察.结果:①不同纬度地区鸽群的新生隐球菌标本阳性率为G1[40°～50°北纬(N)]13%,G2(30°～40°N)50%,G3(20°～30°N)29%,G2显著高于G1(P＜0.01);3组鸽群阳性率基本相同(P＞0.05),平均为81%.②环境分离358株全部37℃生长、酚氧化酶阳性、CGB培养阴性;1株尿素酶阴性;其中101株均为α交配型和A血清型,提示全部为grubii变种;发现环境分离菌株荚膜变异并与其他真菌的自然黏附现象.③从江西贵溪生长的澳洲赤桉未分离到新生隐球菌格特变种.结论:中国环境中以grubii变种为主的新生隐球菌的生态学特点与其所在的地区纬度明显相关:由澳洲赤桉分离新生隐球菌格特变种的研究仍然需要继续进行.     

氟康唑和特比萘芬对新生隐球菌及念珠菌体外联合药敏试验分析

目的 :　研究氟康唑和特比萘芬对新生隐球菌及念珠菌体外联合药敏试验中的相互作用 ,为临床用药提供实验室依据。方法 :　参照美国国家临床试验室标准化委员会 (NCCLS)提出的标准 (M2 7-A方案 ) ,采用棋盘微量稀释法对 18株新生隐球菌和 10株念珠菌进行了氟康唑和特比萘芬的体外联合药敏试验。结果 :　联合用药时各药物的MIC几何均值比单用有显著降低 ,具有统计学差异 (P <0 .0 5 ) ;联合抑菌指数 (FICI)的平均值为 0 .6 2 9。氟康唑和特比萘芬的协同相加作用较为明显 ,未发现有拮抗作用。结论 :　氟康唑和特比萘芬对致病酵母菌主要表现为协同相加作用     

真菌病

20061284抑肽酶对新生隐球菌毒力的影响/徐赤宇(二军大附属长征医院皮肤科),温海,王溪涛…∥临床皮肤科杂志.-2006,35(3).-137~139在30℃下,用蛋白琼脂培养基培养并检测菌株产生廓清晕环(CH)大小,用CH值比较胞外蛋白水解酶活性的变化,建立小鼠感染模型,用菌落形成单位(CFU)和阿新蓝染色比较菌株毒力的变化。体外实验中,抑肽酶1·2mU和1·6mU浓度组与对照组的CH值比较,差异有显著性(P<0·01),体内实验中,实验组脑组织匀浆培养产生的CFU多于对照组;实验组脑组织内观察到新生隐球菌。抑肽酶有抑制隐球菌分泌胞外蛋白水解酶和丝氨酸蛋白酶…     

新生隐球菌生物膜体外抗真菌药物敏感性研究

目的了解新生隐球菌生物膜对氟康唑、两性霉素B、伊曲康唑和卡泊芬净的体外敏感性。方法采用标准微量稀释法测定上述4种抗真菌药物对20株新生隐球菌悬浮状态与生物膜状态的最低抑菌浓度(MIC),MIC结果判定采用四甲基偶氮唑盐[XTT,2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt]-降解法。结果悬浮新生隐球菌20株均对两性霉素B敏感(<1μg/mL),3株对氟康唑耐药(>64μg/mL);1株对伊曲康唑耐药;20株均对卡泊芬净耐药。而生物膜新生隐球菌显示:在20株中,除4株对两性霉素B敏感外,其余各株均对两性霉素B耐药。20株菌均对氟康唑和伊曲康唑耐药,远远高于耐药浓度。对卡泊芬净,均高于其耐药浓度。结论标准微量稀释法结合四甲基偶氮唑盐(XTT)-降解法测定新生隐球菌生物膜对抗真菌药物的敏感性其结果具有可重复性和一致性的特点;新生隐球菌生物膜的明显降低抗真菌药物的敏感性。     

艾滋病合并新生隐球菌性脑膜炎41例临床分析

目的:探讨艾滋病合并新生隐球菌性脑膜炎患者的临床特征及疗效。方法:回顾性分析2011年4月——2018年6月该院收治的41例艾滋病合并新生隐球菌性脑膜炎患者的临床特点、实验室和辅助检查及疗效等。结果:所有患者中临床表现为发热者25例(61.0%),头痛者23例(56.1%),恶心呕吐者8例(19.5%)及颈项强直者29例(70.7%)。CD4~+T淋巴细胞计数100×10~6个/L者40例(97.6%);脑脊液压力180 mmH_2O者34例(82.9%),脑脊液墨汁染色阳性者34例(82.9%),脑脊液培养示新生隐球菌阳性者28例(68.3%),6例脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原检查均阳性(100%),合并新生隐球菌败血症者23例(56.1%);头颅影像学检查异常者12例(29.3%)。经规范化抗隐球菌治疗,有效率为70.7%(29例),病死率为29.3%(12例),其中复发率为2.4%(1例)。结论:对疑似艾滋病合并新生隐球菌性脑膜炎感染患者应及时行腰椎穿刺术、脑脊液病原学检测及隐球菌荚膜多糖抗原检查,对疑似患者的早期诊断和治疗是降低新生隐球菌性脑膜炎病死率的关键。