农杆菌介导鼠源轮状病毒vp4基因转化马铃薯条件优化研究

目的　获得马铃薯再生和农杆菌介导的遗传转化体系。方法　以马铃薯品种“台湾红”为受体材料 ,对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究。结果　诱愈培养基为MS + 0 1mg L 2 ,4-D + 1mg LBA ,出芽培养基为MS + 1mg LZT +5 0mg LGA3 ,卡那霉素浓度为 5 0mg L ,农杆菌液浓度为A6 0 0 =0 5。通过该体系将一鼠源轮状病毒外壳蛋白基因vp4导入马铃薯中 ,获得了具卡那霉素抗性的转化植株。经PCR验证 ,外源基因已导入马铃薯基因组中。结论　获得相对高效的马铃薯遗传转化体系 ,并成功地将外源基因转入马铃薯中。     

鲍曼不动杆菌氨基糖苷类修饰酶基因研究

目的：对临床分离鲍曼不动杆菌耐药性及氨基糖苷类修饰酶基因进行研究,以指导临床合理应用抗生素。方法：K-B琼脂纸片扩散法进行药敏试验,PCR法检测8种氨基糖苷类修饰酶基因,并对PCR产物进行测序。结果：70株ABA对13种药物的耐药率均在65％以上,仅对头孢哌酮／舒巴坦、亚胺培南、美洛培南的敏感率较高。氨基糖苷类修饰酶基因总检出率为64．29％（45／70）,其中aac（6’）-Ⅰ检出率最高为41．40％,其次为基因aae（3）-Ⅱ,aac（3）-Ⅰ和ant（3’）-Ⅰ,检出率分别为34．29％,31．435％和25．71％;未检出aac（6’）-Ⅱ,ant（2’）-Ⅰ,aph（3’）-Ⅰ及aph（3’）-Ⅱ基因。结论：氨基糖苷类修饰酶基因aac（6’）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、aac（3）-Ⅰ及ant（3’）-Ⅰ为本地区鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物耐药的主要原因。     

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅰ.根癌农杆菌介导的转基因菘蓝

目的：将外源半夏凝集素基因（PTA）转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫抗性。方法：构建了以CaMV 35S为启动子，新霉素磷酸转移酶（Npt-Ⅱ）为选择标记，带有半夏凝集素基因PTA的pCAMB I A2200植物双元表达载体，应用根癌农杆菌EHA 105遗传转化四倍体菘蓝。结果：菘 外植体植株再生率达到95％以上，转化率有10％。结论：建立了以6－BA和NAA为主要激素组合的四倍体菘蓝离体分化再生系统和农杆菌介导的转化系统。     

鲍曼不动杆菌氨基糖苷类药物修饰酶基因类型的研究

目的研究常州地区鲍曼不动杆菌氨基糖苷类药物修饰酶基因类型及其耐药特点. 方法用琼脂稀释法检测庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星等4种药物对20株多重耐药性鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度.用PCR法检测氨基糖苷类药物修饰酶基因. 结果庆大霉素、阿米卡星对20株鲍曼不动杆菌MIC50、MIC90均>1024mg/L,耐药率分别为100%、90%.奈替米星、妥布霉素的耐药率分别为85%、80%.鲍曼不动杆菌对庆大霉素等4种抗生素为高浓度耐药.从20株菌中检出两种修饰酶基因,其中16株带有aac(3)-Ⅰ基因,3株带有aac(6＇)-Ⅰ基因;3株菌同时具有上述两种基因,未检出aph(3)-Ⅵ基因. 结论常州地区鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物耐药与aac(3)-Ⅰ、aac(6＇)-Ⅰ基因有关.     

农杆菌介导的GUS基因在枳壳中的转移

用枳壳Ｐｉｎｃｉｒｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ Ｒａｆ．实生苗的上胚轴为材料，探索以根膛杆菌介导的ＧＵＳ基因在枳壳中的转移，结果表明；换菌剂选择头孢霉素较好；卡那霉素作为选择试剂，浓度为５０ｍｇ／Ｌ，外植体与农杆菌共培养时间以２～３ｄ为宜。ＧＵＳ基因瞬时表达检测，８０％的外植体呈阳性反应；ＧＵＳ基因稳定表达检测，抗性植株中，ＧＵＳ反应呈阳性所占比例为７０．０％。     

革兰阴性杆菌9种氨基糖苷类修饰酶基因的检测

目的 调查革兰阴性杆菌氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因的流行状况。方法 建立检测AMEs基因的PCR法，检测临床分离的20株革兰阴性杆菌9种AMEs基因。结果 20株革兰阴性杆菌中6株检出AMEs基因(30％)，同一菌株可产生2种以上AMEs，且不同菌株产生的AMEs有很大差异。3株表型为氨基糖苷类药物敏感，但检出AMEs基因；8株表型为氨基糖苷类药物耐药，但9种AMEs基因检测为阴性。本研究肺炎克雷伯菌的aac(3)-Ⅱ、大肠埃希菌的Bile(6’)-Ⅰ、铜绿假单胞菌的aac(3)-Ⅱ和ant(2”)-Ⅰ基因已成功注册GenBank。结论 产生AMEs是细菌对氨基糖苷类抗生素耐药的机制之一。不同菌株产生的AMEs有很大差异。     

肠球菌产β内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶基因检测

目的 探讨肠球菌耐药机制和耐药基因流行状况。方法 对20株肠球菌的β内酰胺酶TEM基因、氨基糖苷类修饰酶aac(6′／aph(2″)和aph(3′）-Ⅲ基因进行检测。结果 20株肠球菌中有9株表型为青霉素／阿莫西林耐药并均检出TEM基因；12株对高浓度庆大霉素耐药并均检出aac(6′／aph(2″)和／或aph(3′)-Ⅲ基因。结论 国内产β内酰胺酶、产氨基糖苷类修饰酶的肠球菌比率较高。     

鱼腥草离体再生及农杆菌介导的遗传转化

【目的】建立鱼腥草离体再生系统和农杆菌介导的遗传转化方法。【方法】以鱼腥草叶片为外植体置于不同激素配比的MS培养基上,进行愈伤组织诱导和分化再生以根癌农杆菌EHA105／pcAMBIA1305．2进行转化,将外源GUS（β-葡萄糖醛糖苷酶）基因、潮霉素抗性基因转入鱼腥草,以组织化学染色法检测GUS活性,以聚合酶链反应（PCR）法鉴定基因组中的GUS基因。【结果】MS培养基中添加0．1mg／L α-夺乙酸（NAA）、2．0mg／L 6-苄基腺嘌呤（6-BA）、0．5mg/L呋喃氨基嘌呤（KT）适于以鱼腥草叶片为外植体进行离体再生,出芽率达96．7％。潮霉素作为筛选试剂,使用浓度为2．5mg／L;头孢霉素作为抑菌剂,使用浓度为250mg／L。经感染的外植体中GUS反应呈阳性的占75．0％,8周统计抗性芽比率5．5％,PCR分析表明GUS基因已整合到鱼腥草基因组中。【结论】通过鱼腥草离体培养条件的研究及根癌农杆菌介导的遗传转化,获得了较高的离体再生率,实现了鱼腥草的遗传转化。     

鼠源轮状病毒抗原基因的表达载体构建及农杆菌转化研究

目的 构建表达鼠源轮状病毒抗原基因vp4的植物载体及农杆菌转化。方法 抗原基因vp4经PCR扩增后直接克隆到pUC-T载体，双酶切目的片断和植物表达载体，以T4连接酶将目的片断与载体相连接，电转化方式将重组质粒转入农杆菌。结果 成功地将目的基因定向克隆到表达载体，并转入到农杆菌中。结论 pUC-T载体可直接进行PCR扩增产物克隆，便于测序：电转化方式可以有效、快速地将大分子量质粒（＞10kb）转入农杆菌中。     

国内ICU耐药黄杆菌携带β-内酰胺酶基因的研究

目的 探讨ICU临床分离耐药黄杆菌携带β-内酰胺酶基因类型及基因介导方式。方法 以市售试剂盒抽提质粒和染色体；纸片法定性检测细菌产β-内酰胺酶情况；PCR扩增法检测黄杆菌携带bla基因类型。结果 纸片法显示3株菌均产β-内酰胺酶；PCR扩增显示3株黄杆菌的染色体和质粒分别携带3种和6种类型的酶基因。结论 该组ICU耐药黄杆菌携带bla基因具有普遍性和多样性的特点，耐药基因可由质粒、染色体独立介导或两者共同介导。     

泛耐药鲍曼不动杆菌氨基糖苷类修饰酶基因研究

目的 了解临床分离的泛耐药鲍曼不动杆菌中氨基糖苷修饰酶(AME)编码基因存在状况.方法 对临床分离的鲍氏不动杆菌(Ab)用K-B法检测16种常用抗菌药物的敏感性,用聚合酶链反应(PCR)检测OXA-23群、OXA-24群碳青霉烯酶和6种AME(aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰ、aac(6')-Ⅱ、ant(3")-Ⅰ、ant(2')-Ⅰ)编码基因.结果 79株Ab的药敏结果 表明有74.7%菌株属于多重耐药株(MDRA),53.2%菌株属于泛耐药株(PDRA).79株菌株中OXA-23群基因阳性33株(41.8%),从39株Ab中有29株检出AME基因阳性,包括aac(3)-Ⅰ阳性25株(64.1%)、aac(6')-Ⅰ阳性25株(64.1%)、ant(3")-Ⅰ阳性29株(74.4%),并且大多数菌株为多种基因阳性.AME阳性菌全部为OXA-23群基因阳性株,并且全部携带2～3种AME基因.结论 本地临床分离的Ab耐药性非常严重,PDRA主要携带OXA-23群碳青霉烯酶基因,并且普遍携带AME编码基因.     

鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合酶基因及氨基糖苷类修饰酶基因分布研究

目的明确浙江湖州解放军第98医院临床分离的耐β内酰胺类抗生素鲍曼不动杆菌中Ⅰ类整合酶基因(int Ⅰ 1)及氨基糖苷类修饰酶(aminoglycoside-modifying enzymes,AMEs)基因分布状况。方法采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析 int Ⅰ 1及6种 AMEs 基因 aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅲ、aac(6′)-Ⅰ、ant(3″)-Ⅰ、ant(2″)-Ⅰ和 aph(3′)-Ⅵ。结果鲍曼不动杆菌对头孢噻吩完全耐药,亚胺培南、美洛培南及氨基糖苷类耐药率分别为1.7%、1.7%和86.7%。60株菌中,int Ⅰ 1、aac(3)-Ⅰ、aac(6′)-Ⅰ、ant(3″)-Ⅰ、ant(2″)-Ⅰ和 aph(3′)-Ⅵ基因 PCR 扩增阳性株数(%)分别为35(58.3%)、31(51.7%)、33(55.0%)、36(60.0%)、12(20.0%)和2(3.3%),aac(3)-Ⅲ均阴性。结论解放军第98医院临床分离的耐β内酰胺类鲍曼不动杆菌多重耐药严重,int Ⅰ 1及 AMEs 基因携带率均较高。     

产ESBLs大肠杆菌的耐药性及氨基糖苷类修饰酶基因研究

目的了解大肠杆菌的耐药性,尤其要了解产ESBLs大肠杆菌氨基糖苷类的耐药性及其修饰酶基因流行情况。方法2006年1～12月我院分离的大肠杆菌用VITEK-32GNI 鉴定,K-B法检测对氨基糖苷类、β-内酰氨类等18种抗菌药物的耐药性,并对其中17株产ESBLs大肠杆菌用聚合酶连反应(PCR)检测氨基糖苷类修饰酶aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰb、aac(6′)-Ⅱ、ant(3″-Ⅰ、ant(2″)-Ⅰ。结果产ESBLs大肠杆菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢匹肟、头孢他啶、头孢曲松、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、头孢西丁、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明的耐药率分别为100%、100%、41.6%、100%、69.5%、30.5%、98.2%、81.0%、81.0%、79.6%、79.2%、34.4%、12.5%、7.1%、7.9%、5.4%、81.0%、,未见亚安培南耐药株,产ESBLs检出率为46.4%。其中17株产ESBLs大肠杆菌对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素的耐药率分别为52.9%(9/17)、100%(17/17)和100%(17/17)。氨基糖苷类酰基转移酶基因检出率以aac(3)-Ⅱ最高,占94.1%,aac(6′)-Ⅰb次之,占35.3%,ant(3″-Ⅰ、ant(2″)-Ⅰ较低,分别占11.8%和5.9%,其中1株表型耐药,但未检出以上基因。6株aac(6′)-Ⅰb阳性的大肠杆菌,经DNA序列测定,其中4株为经典型,1株为aac(6′)-Ⅰb-Cr型,另外1株为aac(6′)-Ⅰb新亚型。结论大肠杆菌耐药性较为严重,尤其是产ESBLs大肠杆菌多重耐药更为突出。氨基糖苷糖苷类修饰酶基因以aac(3)-Ⅱ最高,aac(6′)-Ⅰb次之,ant(3″)-Ⅰ、ant(2″)-Ⅰ较低,aac(3)-Ⅰ和aac(6′)-Ⅱ未检出。大肠杆菌氨基糖苷类修饰酶基因aac(6′)-Ⅰb至少存在3种型别,以经典型为主,同时存在aac(6′)-Ⅰb-Cr型和aac(6′)-Ⅰb新亚型。     

长春地区部分医院革兰阴性杆菌氨基糖苷类修饰酶基因的检测

目的：分析长春地区部分医院革兰阴性杆菌氨基糖苷类修饰酶基因的分布和类型,为抗生
素的合理应用提供依据。方法：通过琼脂稀释法筛选出阿米卡星与庆大霉素的耐药菌株,采用聚合
酶链式反应及序列分析的方法检测耐药菌株所携带的氨基糖苷类修饰酶基因类型。结果：69株革兰阴性杆菌对阿米卡星与庆大霉素的耐药率分别为44.9%和87.0%,其中63株 (91.3%) 检出氨基糖苷类修饰酶基因,基因类型包括aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ和
ant(2")-Ⅰ,阳性率分别为4.3%、81.2%、43.5%、33.3%和13.0%;而aac (6′)-Ⅱ基因为阴性。结论：本地区革兰阴性杆菌氨基糖苷类修饰酶基因主要以aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ和ant(2")-Ⅰ  5种类型存在,其中以aac(3)-Ⅱ型氨基糖苷类修饰酶基因最为常见。合理应用氨基糖苷类抗生素对于降低细菌的耐药性具有重要意义。
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内毒素诱导外周血单核细胞释放β-葡萄糖苷酸酶的体外研究

目的研究内毒素(LPS)对正常人外周血单核细胞(PBMC)产生β-葡萄糖苷酸酶(β-GD)的影响,探讨胆石症的又一个发病机制。方法以生理盐水(对照组)和0.01、0.10、1.00、10.00和100.00μg/mL内毒素(LPS组)刺激体外培养的外周血单核细胞,并分别于培养的2、4、8、12和24h取上清液,采用酶促动力学方法于pH值4.5条件下检测β-GD活性。结果正常人PBMC在无LPS条件下可以产生具有一定活性的β-GD;在培养的4、8、12和24h,各LPS组β-GD活性显著高于对照组(以1.00μg/mLLPS组为例,与对照组β-GD活性分别为(1633.3±65.0)vs(1106.7±48.6),(1926.0±147.1)vs(1067.7±133.1),(1743.3±66.8)vs(1016.7±147.7),(1553.7±79.6)vs(1193.3±90.2)Fishman单位/106PBMC,t值分别为14.5、9.6、10.0和6.7,P<0.05)。结论LPS可以增加正常人PBMC释放β-GD,此途径可能是LPS参与胆石症发病的又一个机制。     

阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在HepG2及GRC细胞株中的表达

目的：研究阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在不同肿瘤细胞株中的表达。方法：质粒pDCβ-在大肠杆菌DH5a中扩增后用碱裂解法提取，并经Sepharose 2B凝胶过滤柱层析，以Lipofectin分别转染人肝癌细胞株HepG2、人肾癌细胞株GRC，然后用X-gal细胞化学染色法检测β-半乳糖苷酶活性。结果：β-半乳糖苷酶活性在HepG2、GRC中均有表达。结论：阳离子脂质体Lipofectin是有效的细胞基因转染剂。     

鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物的耐药机制研究

目的 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, Ab)是引起院内感染的重要病原菌,近年来,对氨基糖苷类药物耐药逐渐升高.文中分析Ab基因同源性及其对氨基糖苷类抗菌药的耐药机制.方法 2005年10月至2006年11月,收集临床分离的55株Ab,采用肠杆菌科基因间重复一致序列-聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-polymerase chain reaction, ERIC-PCR)方法进行菌株基因组同源性分析.采用PCR方法检测氨基糖苷类修饰酶(Aminoglycosides modifying enzymes, AME)基因及外排泵基因adeB.结果 ERIC-PCR将55株Ab分为2型,其中A型最多为51株,包括2个亚型,A1型39株,A2型12株;B型4株.49株检测出AME基因,aac(3)-Ⅰ、aac(6′)-Ⅰ基因阳性率分别为82%、64%,而aac(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅵ基因均为阴性.所有菌株均检测出adeB基因.结论 55株Ab由2种克隆构成,92.7%为A型.菌株AME基因携带率高,55株均检测出adeB基因,外排泵是否参与耐药有待进一步研究.