转Wee1基因靶细胞抗CTL介导的细胞毒效应

目的 :研究Wee1转基因细胞抗CTL介导的细胞毒效应及抗穿孔素抗体对抗细胞毒效应的影响。方法 :体外混合NIT及淋巴细胞培养获得CTL ,并测定淋巴细胞增殖指数 (MTT法 ) ;采用脂质体将重组体Wee1Hu GFP导入哺乳动物细胞NIT ;以转染重组体前后的NIT为靶细胞 ,检测CTL介导的胞毒效应 (LDH法 ) ,同时测定抗穿孔素抗体对此效应的影响。结果 :混合细胞培养可诱导CTL的增殖 ;转染Wee1基因及加入抗穿孔素抗体NIT组发生的细胞溶解的数量最少。结论 :转Wee1基因靶细胞在一定程度上可抵抗CTL介导的细胞毒作用 ,穿孔素抗体可协同增强此抗胞毒作用。     

Weel基因修饰细胞抗CTL诱导的凋亡效应

目的 研究Weel转基因细胞抗CTL介导的凋亡效应及抗穿孔素抗体的对此抗凋亡效应的影响。方法 采用DNA转染技术将重组体Weel Hu／GFP导入哺乳动物细胞NIT(鼠胰岛细胞瘤细胞)；以转染重组体前、后的NIT为靶细胞，采用ELISA凋亡试剂盒检测CTL介导的凋亡效应。结果 转染Weel及加入抗穿孔素抗体的NIT组发生凋亡的细胞数最少。结论 Weel基因转染靶细胞在一定程度上可抵抗CTL介导的细胞凋亡，而穿孔素抗体可协同增强此抗凋亡效应。     

Wee1基因修饰细胞抗CTL诱导的凋亡效应

目的　研究Wee1转基因细胞抗CTL介导的凋亡效应及抗穿孔素抗体的对此抗凋亡效应的影响。方法　采用DNA转染技术将重组体Wee1Hu GFP导入哺乳动物细胞NIT(鼠胰岛细胞瘤细胞 ) ;以转染重组体前、后的NIT为靶细胞 ,采用ELISA凋亡试剂盒检测CTL介导的凋亡效应。结果　转染Wee1及加入抗穿孔素抗体的NIT组发生凋亡的细胞数最少。结论　Wee1基因转染靶细胞在一定程度上可抵抗CTL介导的细胞凋亡 ,而穿孔素抗体可协同增强此抗凋亡效应。     

Wee1-GFP在CTL介导的细胞毒效应中的作用研究

目的: 研究Wee1-GFP融合蛋白对胞毒T细胞介导的胞毒效应的影响.方法: 采用脂质体将融合基因Wee1-GFP导入鼠胰岛瘤细胞(NIT-1)并检测其表达.以转染pWee1-GFP和空载体的NIT-1为靶细胞, 采用ELISA凋亡试剂盒和乳酸脱氢酶法检测胞毒T细胞介导的细胞毒效应.结果: Western blot检出Wee1-GFP融合蛋白的表达.转染Wee1-GFP的靶细胞发生凋亡及损伤的细胞数比转染空载体的靶细胞少.结论: Wee1-GFP基因转染靶细胞具有一定的抵抗CTL介导的胞毒效应的能力.     

FADDdel-GFP真核表达载体的构建及其抗细胞毒效应初步观察

目的构建融合蛋白FADDdel-GFP真核表达载体pFADDdel-GFP，用该融合基因转染小鼠胰岛瘤细胞(NIT)，从而抑制死亡受体介导的细胞内凋亡信号传导，以探讨IDDM的发病机制及防治措施。方法采用基因重组技术将FADDdel定向连接于真核表达载体pEGFP-N1，用脂质体将重组子pFADDdel-GFP导入哺乳动物细胞NIT并检测其表达，采用FACS和MTT法检测特异性T细胞对转染重组子NIT引起的细胞毒效应。结果转染重组子pFADDdel-GFP的NIT可见绿色荧光蛋白表达；pFADDdel-GFP转染的NIT对特异性T细胞介导的细胞毒有明显抵抗。结论成功构建pFADDdel-GFP融合基因并获稳定表达；pFADDdel-GFP转染NIT可有效抑制死亡受体介导的细胞内凋亡信号传导。     

HBV S基因修饰树突状细胞疫苗诱导特异性CTL反应的探讨

目的分析腺病毒载体介导HBVS基因修饰树突状细胞（DCs）能否诱导抗HBV特异性CTL反应。方法制备携带HBVS基因的重组腺病毒，分别转染外周血诱导培养的DCs，观察腺病毒转染DCs效率和DCs中HBV抗原的表达；混合淋巴细胞反应测定HBV抗原基因修饰DCs刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力；乳酸脱氢酶释放法检测特异性CTL细胞对HepG2 22．1．5靶细胞的杀伤能力。结果腺病毒载体能够高效介导HBVS基因在DCs中表达，且DC细胞形态完整；HBVS基因修饰DCs具有刺激同种异体T细胞增殖能力，同时能诱导抗HBV特异性CTL反应。结论HBVS基因修饰DCs疫苗具有增强抗HBV特异性CTL效应的能力，可能发展为一种新型抗病毒疫苗。     

穿孔素介导的细胞凋亡机制在抗流感病毒感染免疫防御中作用的研究

目的：穿孔素介导的细胞凋亡机制在流感病毒初次感染中作用的研究。方法：用流感病毒A／PR／8／34经鼻感染穿孔素基因敲除鼠和同源对照C57BL／6小鼠，采用PFU方法测定肺内流感病毒增殖状况；免疫组织化学染色方法观察小鼠病毒感染后感染细胞的凋亡情况；利用乳酸脱氢酶释放法检测感染鼠脾淋巴细胞NK活性及CTL杀伤活性。结果：穿孔素基因缺乏导致流感病毒在小鼠肺内大量增殖；小鼠清除感染病毒所需时间延长；病毒感染细胞发生凋亡的时间亦因穿孔素的缺乏而延迟；感染小鼠脾淋巴细胞NK活性及CTL杀伤活性均显著降低。结论：穿孔素依赖的细胞介导的细胞毒效应在控制流感病毒初次感染，快速清除感染病毒方面起重要作用。     

融合蛋白FADDdel-GFP对死亡受体介导的胰岛细胞凋亡的影响

目的研究融合蛋白FADDdel-GFP对死亡受体介导的细胞凋亡信号的生物学效应,以探讨通过基因修饰靶细胞对1型糖尿病的影响。方法用脂质体将融合基因pFADDdel-GFP导入胰岛细胞株NIT,通过细胞RT-PCR和荧光显微镜检测其表达,采用FACS检测抗-Fas抗体诱导的胰岛细胞株的细胞毒效应。结果转染重组子pFADDdel-GFP的NITf-g细胞可见绿色荧光蛋白表达;NITf-g细胞对抗-Fas诱导的细胞损伤率为10.16%,细胞内的Caspase-3的活性为12.33%,均明显低于对照组（P〈0.05）。结论成功建立了稳定表达FADDdel-GFP的胰岛细胞株;FADDdel-GFP可有效抑制死亡受体介导的细胞内凋亡信号传导。     

单链双特异性抗体(BHL-I)介导的细胞毒作用及其可能机制研究

目的：观察单链双特异性抗体（BHL-I）介导的PBL对靶细胞SKOV3的杀伤作用，并研究其细胞毒作用的可能机制。方法：MTT法检测在不同效靶比、不同作用时间、不同靶细胞（SKOV3、BEL-7402）、不同BHL-I浓度等条件下，BHL-I介导PBL对靶细胞的杀伤作用；RT-PCR检测杀伤过程中PBL的穿孔素（Perforin）、颗粒酶（GranzymeB）mRNA的表达及细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ含量变化。结果：BHL-I介导的PBL对SKOV3细胞毒作用明显高于对BEL-7402的，并且在效靶比10∶1、作用36小时、BHL-I浓度为25μg/ml时，PBL对靶细胞SKOV3的细胞毒作用最为显著；在IL-2存在下，BHL-I可引起Perforin、GranzymeB mRNA较高表达及细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ含量升高，当作用时间为72小时时，这些细胞因子的表达有所下降。结论：BHL-I能介导PBL对表达有相应靶抗原的SKOV3细胞具有高效杀伤作用，其细胞毒作用可能与效应细胞表达Perforin、GranzymeB、TNF-α、IFN-γ等有关。     

特异性CTL胞毒作用与HLA型别关系探讨

目的：探讨特异性CTL胞毒作用与靶细胞的HLA型别关系。方法：本实验以特定HLA型别，EB病毒转化的B淋巴母细胞（EBV－LCL）与同种异体单个核细胞（PBMC）混合培养，激活同种抗原特异性细胞性T细胞（CTL），观察其对携带不同HLA型别的EBV－LCL靶细胞的杀伤活性。结果：用EBV－LCL1致敏的效应细胞1对EBV－LCL2的杀伤效应比对EBV－LCL3强，用EBV－LCL2致敏的效应细胞2对EBV－LCL1的杀伤效应比对EBV－LCL3强，用EBV－LCL3致敏的效应细胞3对EBV－LCL1，2几乎无杀伤效应。结论：特异性CTL对不同HLA型别的靶细胞的胞毒作用存在差异，这不仅仅与HLA型别关联，而可能取决于抗原肽与MHC所组成的抗原综合信息。     

融合基因FADDdel-GFP修饰在胰岛细胞自杀效应中的作用

目的 研究FADDdel-GFP在Fas/FasL介导的胰岛细胞自杀效应中的作用.方法 采用DNA转染技术将重组体pFADDdel-GFP导入哺乳动物细胞NIT(鼠胰岛细胞瘤细胞);采用FACS检测细胞因子诱导后NIT细胞的Fas和FasL表达情况及细胞自杀效应;采用active caspase3检测试剂盒检测细胞因子作用前后NIT细胞的caspase-3活性变化.结果 NIT细胞表面无Fas和FasL表达,细胞因子可促其表达增加;细胞因子作用后,FADDdel-GFP修饰的NIT细胞的细胞损伤百分率和细胞内caspase3活性明显低于对照组.结论 FADDdel-GFP修饰的NIT细胞具有一定的抵抗Fas/FasL途径介导细胞自杀效应的能力.     

抗Cyclin D1胞内抗体AD5N基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

目的：构建细胞核定位的抗CydinD1胞内抗体基因的真核表达载体并分析其对乳腺癌细胞增殖的抑制效应。方法：利用PCR技术和分子克隆技术，构建编码细胞核定位的抗CydinD1胞内抗体基因（AD5N）的真核表达载体pcDNA3．1-ADSN，利用脂质体介导法转染MCF-7细胞，RT-PCR、间接免疫荧光、Westernblot和流式细胞术分析该胞内抗体基因ADSN在MCF-7细胞中的表达、定位及抑瘤效应。结果：经限制性内切酶分析及序列分析发现，成功构建编码细胞核定位的抗CyclinD1胞内抗体（AD5N）基因的真核表达载体pcDNA3．1-ADSN，基因片段为855bp，编码285个氨基酸，分子量约为30kD。RT-PCR、免疫荧光及Westernblot实验结果显示，仅在转染胞内抗体基因的MCF-7细胞中存在该胞内抗体的表达，并且主要分布在细胞核区域。与野生型MCF-7细胞和转染空质粒的细胞相比，在MCF-7／pcDNA3．1-ADSN细胞中ADSN的表达可明显抑制MCF-7细胞增殖，显著诱导细胞凋亡（P〈0．01），使G0-G1期细胞周期指数增高12．64％，S期指数下降15．22％，凋亡细胞指数上升9．15％。结论：细胞核定位的抗CyclinD1胞内抗体ADSN基因的表达，可有效抑制乳腺癌细胞的增殖，阻滞细胞周期进展，并诱导细胞凋亡。     

脾细胞在CTL克隆增殖中的作用

本文证明二次MLC上清或重组IL2均不足以维持细胞毒 T细胞(CTL)克隆的正常增殖,而同种异体、同种第三者、甚至同基因的脾细胞均可增强rIL2诱导的CTL克隆增殖应答,亦可增强 CTL由 CD3∈链抗体(145-2C11)刺激的 IL-2非依赖性增殖。脾细胞的这种辅佐效应似与可溶性因子或脾粘附细胞无关。用 rIL2 预处理的脾细胞可诱导 CTL克隆的显著增殖,这种增殖可被抗IL2 受体抗体所抑制,提示脾细胞可能将其“膜结合”rIL2递给CTL而更有效地诱导增殖反应。FD18.5(抗 LFA-1),KH1.4(抗 Ly-6)及 HK2.1(抗 Thy-1)可显著抑制脾细胞对 145-2C11 激活 CTL增殖的辅佐效应,提示脾细胞对 CTL克隆 IL2非依赖性增殖的辅佐效应与一些细胞表面分子有关。     

Superfect 高效介导PDX-1基因在骨髓间质干细胞表达

目的：构建含有胰腺十二指肠同源框1(PDX-1)基因的真核表达载体，并提高重组载体在骨髓间质干细胞(MSCs)的表达效率，为骨髓MSCs作为糖尿病基因治疗的靶细胞奠定基础。 方法：RT-PCR体外扩增PDX-1 基因，双酶切后整合入相同双酶切的真核表达载体构建重组载体，对重组载体进行酶切分析和序列测定进行鉴定；利用Percoll 细胞分离液体外培养大鼠骨髓MSCs，流式细胞仪检测细胞周期后，Superfect 介导正确重组的载体转染骨髓 MSCs，检测转染效率和细胞存活率从而对转染条件进行优化；G418筛选阳性细胞后，RT-PCR 和Western blotting 检测PDX-1 基因在骨髓 MSCs 中的表达。 结果：重组载体双酶切分析和序列测定证实重组载体构建成功。流式细胞仪显示 85.9%的MSCs处于G₀/G₁期，提示骨髓MSCs具有强大的分化潜能；荧光显微镜下成功转染的细胞呈现全细胞绿色荧光，Superfect 介导的转染效率和细胞存活率与其绝对用量和孵育细胞的时间有关；RT-PCR显示转染后PDX-1基因在骨髓 MSCs表达，随转染时间延长，表达逐渐增强，与Western blotting结果一致。结论：成功构建了含有PDX-1 基因的真核表达载体；Superfect 能高效介导外源性基因在骨髓MSCs 中表达；转染外源性基因的MSCs可望成为一种理想的基因治疗的载体细胞。     

CTL定向释放的RANTES在肿瘤靶细胞的重新分布

目的研究受肿瘤靶细胞激活的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）释放趋化因子RANTES（reduced upon activation，normal T cell expressed and secreted）的特征。方法以酪氨酸酶特异性CTL为效应细胞，以特异性表达HIL—A2-酪氨酸酶的黑色素瘤细胞为靶细胞，应用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪技术，分析RANTES在效、靶细胞之间的动态分布；利用三重免疫荧光染色，观察受靶细胞激活的CTL定向释放的RANTES与穿孔素的共定位。结果CTL识别肿瘤靶细胞时，RANTES从活化的CTL内释放，且重新分布于和CTL接触的靶细胞表面，而非靶细胞表面没有RAN—TES的分布。RANTES和穿孔素共同参与形成免疫突触（immune synapse）。结论CTL受肿瘤靶细胞激活时，定向释放的RANTES重新分布于肿瘤靶细胞表面。     

EBV-LMP2A重组腺病毒体外转染树突状细胞激发特异性CTL的研究

目的：用EBV潜伏膜蛋白2A(EBV-LMP2A)重组腺病毒转染树突状细胞(DC)激发特异性细胞毒性T细胞(CTL)，分析CTL的特性。方法：用AdS-LaMP2A重组腺病毒转染EBV健康携带者及鼻咽癌患者的DC，与自体来源的外周血单个核细胞(PBMC)混合培养，激发LMP2A特异性CIL。用LDH释放法检测CIL杀伤活性；流式细胞术(FACS)检测培养细胞群体中CD3^ 、CD4^ 、CD8^ 、CD56^ 细胞的组成；生物活性法检测细胞培养上清中IFN-γ含量；RT-PCR分析CTL的FasL mRNA表达。结果：EBV健康携带者及鼻咽癌患者的PBMC，经AdS-LMP2A转染的自体DC两次刺激后，都能诱导出显著的EBV-LMP2A特异的CIL。EBV健康携带者CTL的杀伤活性，随DC刺激次数的增加而逐渐增强，诱导的CTL细胞群体以CD^4 和CD8^ 细胞组成为主，且CD4^ 细胞比例高于CD8^ 细胞，另含少量CD56^ 细胞；在不同时段所诱导的CTL上清中，均含一定量的IFN-γ并随刺激次数和诱导时间的延长呈上升趋势；RT-PCR研究表明，所诱导的CTL有FasL mRNA的表达。结论：以腺病毒载体介导EBV-LMP2A基因转染的成熟DC，在体外能激发较强的LMP2A特异的功能性CTL，可用于EBV相关NPC的免疫治疗。     

胞毒性T细胞的死亡之吻

由于CD_4~+和CD_8~+细胞毒T细胞与艾滋病,自身免疫以及机体对病毒,肿瘤和移植的免疫反应都有关。因此,阐明细胞毒T细胞破坏靶细胞的精确机制是非常重要的。细胞毒T细胞至少可通过2个不同的途径产生有效和特异的溶解活性。在粒酶分泌和穿孔素介导的途径中,微孔形成剂穿孔素可能与粒酶联合,也从细胞毒T细胞分泌出来对靶细胞     

兔抗重组穿孔素抗体的制备及特性鉴定

目的:制备兔抗重组穿孔素的抗体,检测其免疫反应性,并用于穿孔素的体外功能定位分析。方法:以纯化的全长穿孔素融合蛋白DsbAfulllength免疫新西兰大白兔制备抗血清,用免疫双扩法检测抗血清的效价,Westernblot检测抗血清与5个穿孔素侯选活性区域重组融合蛋白的免疫反应性。将活性重组穿孔素体外作用HIV1SF33感染的MT4细胞后,用免疫组化染色法显示穿孔素作用的部位。结果:用免疫双扩法检测表明,兔抗穿孔素融合蛋白抗血清的效价为1∶32;Westernblot显示,抗血清可与穿孔素各重组融合蛋白发生特异性结合;免疫组化显示,穿孔素作用的部位位于靶细胞的胞质和胞膜。结论:制备的兔抗重组穿孔素融合蛋白的抗体具有较好的免疫反应性和特异性,为穿孔素的深入研究提供了有力的工具。     

PRRSV M 蛋白细胞系的培育及其在细胞毒性T淋巴细胞检测方法中的应用

目的 探讨PRRSV M基因在哺乳动物细胞NIH/3T3细胞中的表达,建立一种非放射性、简便易行的检测特异性细胞毒T淋巴细胞的方法.方法 应用RT-PCR扩增得到M基因并克隆入真核表达载体pcDNA3,构建成重组表达载体pcDNA3-M;将重组质粒转染至NIH/3T3细胞,G418筛选克隆;IFA检测M蛋白在转基因NIH/3T3细胞中的表达.用表达M蛋白的重组腺病毒rAd-M免疫小鼠,用表达M蛋白的NIH/3T3细胞和乳酸脱氢酶法检测PRRSV特异性细胞毒T淋巴细胞的杀伤效应. 结果 获得有G418抗性的NIH/3T3/M细胞克隆;IFA检测到有PRRSV M蛋白表达.重组腺病毒rAd-M免疫组可以诱发CTL应答,并明显高于wtAd和PBS对照组. 结论 培育成功一株能表达PRRSV M蛋白的细胞株NIH/3T3/M,可作为PRRSV CTL检测方法中的靶细胞,证明PRRSV M基因能够诱发特异性的细胞免疫.     

慢性乙型肝炎病人HBcAg特异性CTL的体外诱导及活性

目的 从慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞（PBMC）中诱导和扩增乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。方法 含乙型肝炎病毒重组逆转录病毒载体转染病人自身永生化B细胞作为抗原递呈细胞，联合重组HBcAg和IL-2，从病人PBMC中诱导和扩增HBcAg特异性CTL，^51Cr释放法检测其细胞毒活性。结果 此方法诱导的TCL可以有针对性的杀伤靶细胞，而不能够杀伤空载体转染及未经转染的B细胞。结论 所建立的方法可以在慢性乙型肝炎病人的PBMC中诱导出HBcAg特异性CTL活性。