慢病毒介导shRNA特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1基因表达抑制舌癌细胞迁移侵袭能力

目的：探讨特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1（phosphatase of regenerating liver cell-1,PRL-1）基因表达对舌癌细胞迁移、侵袭能力的影响。方法：设计、合成5条针对PRL-1基因的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）干扰序列,构建于慢病毒载体质粒中,PCR电泳及基因测序验证。转染293T细胞,Western blot筛选最佳干扰序列,包装产生慢病毒。转染TCA8113细胞,筛选、建立稳定转染细胞株;real-time PCR检测PRL-1基因沉默效率;划痕实验和Transwell实验分别比较慢病毒转染细胞（KD组）、空病毒转染细胞（NC组）及TCA8113细胞（CON组）迁移、侵袭能力变化。结果：PCR电泳及基因测序证实5条shRNA序列定向插入慢病毒载体质粒中。Western blot筛选出PRL-1-shRNA-1基因沉默效率最高,包装获得慢病毒滴度为 7×108 TU/ml。通过转染、筛选,建立了TCA8113细胞稳定转染细胞株;real-time PCR测得PRL-1基因mRNA表达明显下降（F=809.120,P=0.000）;PRL-1基因沉默后细胞迁移能力降低,穿过人工基底膜的细胞数KD组（25.5±0.4）明显少于NC组（81.5±2.0）和CON组（88.5±2.3）（F=1 092.970,P=0.000）。结论：沉默PRL-1基因表达能有效抑制舌癌细胞迁移、侵袭能力。     

Livin 基因沉默对甲状腺乳头状癌 TPC －1细胞增殖和侵袭的影响

目的：探讨RNA干扰技术沉默Livin对甲状腺乳头状癌TPC－1细胞增殖、侵袭的影响。方法通过RNA干扰技术沉默Livin基因表达,实验分为敲减组（ KD组）、阴性对照组（ NC组）和对照组（ CON组）。利用RT－PCR和Western blot检测转染后各组TPC－1细胞中Livin mRNA和蛋白的表达水平,MTT法检测细胞增殖能力, Transwell实验检测细胞侵袭能力。 Western blot方法检测干扰后细胞内蛋白激酶B （ AKT）及磷酸化蛋白激酶B（p－AKT）蛋白的表达。结果 Livin－shRNA转染后TPC－1细胞中Livin mRNA和蛋白表达水平明显下降（P＜0．05）。与NC组和CON组比较,Livin－shRNA转染后TPC－1细胞的增殖能力受到明显抑制（P＜0．05）。KD组穿过Transwell小室膜细胞为（32±1）个,NC组和CON组穿膜细胞数分别为（64±2）和（63±1）个,KD组穿膜细胞数显著少于NC组和CON组（P＜0．05）。 Western blot显示KD组TPC－1细胞中AKT及p－AKT蛋白表达量明显减少（ P＜0．05）。结论 Livin基因可能通过磷脂酰肌醇－3－激酶／蛋白激酶B（ PI3K／Akt）信号通路促进人甲状腺乳头状癌TPC－1细胞增殖和侵袭,提示Livin基因有可能成为甲状腺乳头状癌潜在的治疗靶点。     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖?迁移和凋亡的影响?【方法】 构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株?实验分5组:CLU-RNAi-LV1(KD1)?CLU-RNAi-LV2(KD2)?CLU-RNAi-LV3(KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组)?应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化?用细胞划痕实验?MST-1?流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖?迁移?凋亡等生物学行为的改变?【结果】 成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒?Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1?KD2?KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4%~96.5%和0?Western blot结果显示KD1?KD2?KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24%?46.26%和58.91%,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达?划痕实验显示24 h时 KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43 ± 25.92)小于NC组(101.35 ± 6.05)和CON组(68.13 ± 6.64,P < 0.05)?WST-1法检测转染后72 h KD3(si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P < 0.05),各组间差异(P < 0.05),均有统计学意义?流式细胞仪检测KD3(si-CLU)组与NC组?CON组细胞凋亡率分别为(6.23 ± 2.51)%?(1.05 ± 0.30)%和(1.17 ± 0.29)%,KD3(si-CLU)组与NC组?CON组相比凋亡率增加(P < 0.05),差异有统计学意义?肾癌786-O细胞的增殖?迁移受到抑制,而凋亡率增加?【结论】 筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株?CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖?迁移并促进细胞凋亡?     

KRAS促进肺癌细胞糖酵解

目的 探讨KRAS对肺癌细胞糖酵解的影响及其初步机制.方法 采用Real-time PCR 和Western blot检测KRAS、HK2、PKM2在肺癌细胞系H1299、A549、SPC-A1中的表达水平,应用干化学方法检测肺癌细胞培养48 h后培养基上清中乳酸的浓度.采用RNA干扰技术,将KRAS-shRNA感染H1299细胞,实验分为3组:空白对照组(CON组)、阴性对照组(NC组)、慢病毒干扰组(KD组).采用Real-time PCR和Western blot检测KRAS敲低效率及敲低KRAS基因前后H1299细胞中HK2、PKM2的表达变化.将TNF-α作用于NC组和KD组细胞,检测KRAS、HK2、PKM2的表达水平及乳酸浓度的变化.结果 在3株肺癌细胞系中,H1299细胞中KRAS和HK2、PKM2的表达水平最高,乳酸水平也高于A549、SPC-A1细胞.与空白对照组相比,KRAS-shRNA感染H1299细胞后,KRAS基因拷贝以及蛋白表达水平被显著抑制(P＜0.05),HK2、PKM2基因拷贝及蛋白表达水平显著下降,培养基中乳酸浓度明显降低(P＜0.05).以TNF-α作用NC组、KD组细胞后,KRAS、HK2、PKM2基因和蛋白表达均升高(P＜0.05).KRAS-shRNA可部分抑制TNF-α升高的乳酸浓度(P＜0.05).结论 KRAS能通过调节HK2和PKM2促进肺癌细胞的糖酵解.     

PTP4A1在舌鳞癌组织及TCA8113细胞中的表达及意义

目的：检测PTP4A1基因在舌鳞癌组织及舌鳞癌细胞系TCA8113中的表达,并探讨其表达水平与舌鳞癌临床病理参数的关系。方法：应用免疫组化SP法检测30例舌鳞癌和15例正常舌组织石蜡包埋组织中PTP4A1的表达;对15例新鲜舌鳞癌组织进行real-time PCR,检测PTP4A1在舌鳞癌组织、癌旁组织、正常舌组织的表达,此外对TCA8113细胞中PTP4A1的表达水平也进行了检测。结果：免疫组化结果显示,PTP4A1表达于舌鳞癌组织的细胞质和细胞核,在舌鳞癌组织中呈阳性和强阳性表达,而在正常舌组织中呈阴性和弱阳性表达;PTP4A1在舌鳞癌的阳性表达率为83%,显著高于其在正常舌组织中的表达率33.3%;PTP4A1在舌鳞癌组织和正常舌组织的表达差异有统计学意义（P=0.001<0.05）;而且PTP4A1的表达水平与肿瘤的淋巴转移相关（P=0.014<0.05）,而与病人的性别、年龄、肿瘤的大小、肿瘤的分期分级无明显相关。Real-time PCR实验结果显示舌鳞癌组织及舌鳞癌细胞系TCA8113细胞中的PTP4A1的mRNA表达水平高于其在癌旁和正常舌组织的表达,癌旁组织的表达高于正常舌组织的表达（P=0.000<0.05）。结论：PTP4A1基因mRNA水平和蛋白水平表达在舌鳞癌组织中表达均较癌旁和正常舌组织高,可能在舌鳞癌的发生发展过程中起着一定作用。     

异土木香内酯对人舌鳞癌Tca8113细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

目的 研究异土木香内酯对舌鳞癌细胞Tca8113的增殖、迁移和侵袭能力的影响.方法 用CCK-8法检测异土木香内酯作用于舌鳞癌Tca8113细胞的半数抑制浓度(IC50),EDU实验方法检测异土木香内酯抑制Tca8113细胞增值能力.检测土木香内酯对Tca8113细胞凋亡影响实验.Western Blot检测异土木香内酯对Tca8113细胞凋亡蛋白表达的影响.结果 实验结果表明,异土木香内酯作用于舌鳞癌Tca8113细胞的半数抑制浓度(IC50)为20μM,20μM异土木香内酯可以抑制舌鳞癌Tca8113细胞活性(P<0.01),细胞增值能力(P<0.01);进一步结果表明,异土木香内酯还可以抑制对Tca8113 P迁移,同时降低Tca8113细胞侵袭能力(P<0.01);促进Tca8113细胞凋亡的影响(P<0.01).Western Blot实验结果表明,异土木香内酯可以下调舌癌Tca8113细胞的Bcl-2蛋白,上调caspase3蛋白的表达.结论 实验结果表明异土木香内酯对舌癌Tca8113细胞有抑制作用.     

沉默整合素连接激酶基因抑制TCA8113舌癌细胞生长和侵袭

目的 研究沉默整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)基因表达,对人舌鳞癌细胞生长、侵袭和转移能力的影响.方法 通过用ILK mRNA的特异性siRNA表达载体和无同源性的对照载体,在脂质体介导下稳定转染人舌鳞癌TCA8113细胞,分为TCA8113组、TCA8113 vector组和TCA8113 siILK组,通过筛选鉴定后,用MTT法、划痕试验和Transwell法分别检测细胞生长、迁移和侵袭能力,用Western blot分析细胞中ILK、p-Akt、p-GSK3β及Snail等的表达.结果 沉默ILK基因表达显著抑制了细胞的生长、迁移和侵袭能力,接种的第48、72、96、120小时,TCA8113 siILK组的抑制率分别为17％、29％、25％、42％,迁移能力较TCA8113组和TCA8113 vector组分别下降67％和66％,侵袭能力则较两个对照组下降了67％和68％,p-Akt、p-GSK3β及Snail的表达较TCA8113组和TCA8113 vector组分别降低了45％和53％,57％和61％,74％和73％.结论 抑制ILK基因的表达可通过Akt/GSK3β/Snail途径,显著抑制人舌鳞癌TCA8113细胞的生长、迁移和侵袭潜能,可作为治疗人舌鳞癌的靶蛋白.     

下调乙酰辅酶A合成酶2通过诱导自噬抑制非小细胞肺癌细胞增殖

目的：探讨乙酰辅酶A合成酶2（ACSS2）在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中的表达及其对细胞增殖、侵袭的调控机制。方法：采用蛋白质印迹（Western blot）实验检测并分析NSCLC细胞系A549和H1299与人成纤维细胞HFF-1中ACSS2表达的差异。利用慢病毒在NSCLC细胞系中构建ACSS2敲低（ACSS2 KD组）和对照细胞系（NC组）。采用MTT实验及细胞克隆形成实验分析ACSS2 对NSCLC细胞增殖的影响。采用划痕实验和Transwell实验分析ACSS2对NSCLC细胞的迁移和侵袭能力的影响。Western blot及免疫荧光实验分析敲低ACSS2 对细胞自噬的影响。结果：与人成纤维细胞HFF-1相比,NSCLC细胞中ACSS2 的蛋白表达水平明显升高（P ＜0.05）。与NC组相比,ACSS2 KD组细胞增殖能力和细胞活力显著降低,ACSS2 KD组细胞的迁移和侵袭能力均明显降低（均P ＜0.01）。Western blot和免疫荧光实验显示,敲低ACSS2 细胞自噬活性明显增加,自噬小体增多（P ＜0.01）。但是,敲低ACSS2几乎不影响caspase3和caspase8的蛋白表达水平（P ＞0.05）。ACSS2 shRNA+Beclin1/Atg7-shRNA共转染A549细胞（ACSS2+Beclin1/Atg7 KD组）,结果显示与ACSS2KD组比,ACSS2 KD+Beclin1/Atg7 KD组细胞增殖能力有所增强,克隆形成数目明显增多（P ＜0.05）。结论：ACSS2在NSCLC细胞中高表达,促进细胞的增殖、侵袭。下调ACSS2可诱导NSCLC细胞发生自噬性细胞死亡,抑制细胞增殖。     

miR-200c对舌癌Tca8113细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨 miR-200c 对人舌鳞状细胞癌 Tca8113细胞增殖和凋亡的影响。方法将 miR-200c 的模拟物通过脂质体转染到人舌鳞状细胞癌 Tca8113细胞内,通过四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率、Western blot 检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和 Bcl-2蛋白的表达。结果与对照组相比,miR-200c 模拟物20、40、80 nmol／L 组的 Tca8113细胞生长受到明显抑制,差异有统计学意义（P ＜0．05）,miR-200c 模拟物的浓度越大,作用时间越长,抑制效果越明显（P ＜0．05）;转染 miR-200c 模拟物48 h 后,Tca8113细胞停滞于 G0／G1期,细胞凋亡率显著增加,差异有统计学意义（P ＜0．05）;Western blot 证明20、40、80 nmol／L 组 Bcl-2蛋白表达量明显低于对照组,而 Caspase-3蛋白表达量明显高于对照组（P ＜0．05）。结论miR-200c 过表达可抑制舌癌 Tca8113细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

RNAi沉默FAK基因表达对人舌鳞癌细胞CAL-27凋亡和侵袭的影响

目的 应用RNA干扰技术将FAK基因表达沉默后,观察人舌鳞癌细胞株CAL-27凋亡和侵袭能力的变化.方法 使用RNAi技术构建3对FAK siRNA后,瞬时转染细胞.运用实时定量聚合酶链反应(qPCR)法检测FAK mRNA的表达情况,筛选出沉默效率最佳的siRNA用于后续实验.运用蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测细胞FAK蛋白的表达情况,流式细胞仪观察细胞的凋亡情况,Transwell侵袭实验观察细胞体外侵袭能力的变化.结果 qPCR实验结果显示转染siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组FAK mR-NA表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01),其中以siRNA-3沉默效率最高;Western blot结果显示转染组细胞FAK蛋白表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05);流式细胞仪检测结果显示转染组细胞凋亡率明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01);Transwell法实验结果显示转染组细胞穿膜的数量明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05).结论 沉默FAK基因表达可诱导舌鳞癌细胞CAL-27的凋亡,有效抑制其侵袭能力.     

2007～2009年铜陵市人民医院产科抗生素应用分析

目的了解产科抗生素的应用情况并评价其合理性以加强临床使用的管理。方法随机抽查铜陵市人民医院2007～2009年产科出院患者病历中的抗生素使用情况,进行回顾性的调查统计分析。结果抗生素使用率达67%,头孢类药物是主要种类,以单独用药情况最多;多数品种DUI接近1。结论该院产科抗生素使用基本合理,但尚须建立有效的监管制度,控制过度使用。     

2005年汕头市登革热定点监测结果分析

目的 通过定点监测为汕头市登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。方法收集监测点的登革热疫情、人群抗体水平和媒介伊蚊等监测资料，用EPI2002软件统计分析。结果2005年汕头市无登革热疫情，抗登革热病毒IgG、IgM阳性率低，伊蚊幼虫孳生密度高峰在6、8、9、10月份，低谷在4、7、11月份，孳生情况随着月平均降水量、平均气温变化而变化；孳生场所以农村、暂时性容器为主。结论汕头市有登革热流行的自然、社会环境条件，人群普遍对登革热易感，8～10月是发动爱国卫生运动，清除伊蚊孳生地，预防、控制登革热流行的适当时机。     

广东高州市2005年医疗机构消毒质量监测分析

目的评价辖区内医疗机构消毒灭菌质量，督促各医疗单位提高消毒灭菌效果，防止医源性感染的发生。方法对辖区内的医疗单位已消毒或灭菌的用品进行抽样检测，将检测结果进行统计学分析。结果这次采集使用中消毒液、无菌器械、物体表面、手术室空气和医务人员手共3556份，检测达卫生标准2955份，符合率为83、10％，不同样品检测达卫生标准百分率依次为97．37％、95．56％、86．25％、75．41％和62、49％。结论高州市医疗机构消毒灭菌质量用卫生指标评价，卫生站的符合卫生标准率低于医院，手术室空气和医务人员手的监测合格率低于使用中消毒液和无菌器械。     

湛江市2007年登革热监测结果

目的分析湛江市2007年登革热监测结果,为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策提供科学依据。方法收集监测点的登革热疫情、布雷图指数、人群抗体水平和媒介伊蚊等监测资料,用EPI2002软件统计分析。结果2007年湛江市暴发2起登革热疫情,发病205例,男97例,女108例;抗登革热病毒IgG阳性率低,伊蚊幼虫孳生密度高峰在9月份,低谷在6-8月份,阳性容器以永久性容器为主。结论湛江市有登革热流行的自然、社会环境条件,人群普遍对登革热易感,8-9月是发动爱国卫生运动,清除伊蚊孳生地,预防、控制登革热流行的适当时机。     

2005年广西流动人口疟疾监测结果分析

目的了解广西流动人员疟疾流行现状,进而提出针对性防治措施。方法收集全区网络直报疫情资料和各级疾病预防控制机构疟疾监测数据进行分析。结果2005年广西流动人口发热病人平均疟原虫阳性率为0·33%。80·62%的病人为本地居民外出到疟疾流行区务工感染所致。以从事护林/砍伐比例最高,占44·19%。结论加强返乡流动人口疟疾监测是巩固广西疟疾防治的关键所在。     

惠州市车间空气中有毒物检测结果分析

目的 了解惠州市电子、五金、电镀等企业生产车间中有毒物污染情况，以便提出有效的预防措施。方法根据中华人民共和国国家标准中气相色谱法、原子吸收分光光度法、分光光度法对车间空气中有毒物质进行检测。结果2003～2004年共检测车间空气样品3625份，舍格3511份，总合格率为96．8％。其中锰尘舍格率最低，为82．2％；其次是三氯乙烯91．0％，氰化氢93．4％，甲苯97．1％，硫酸97．2％，铅烟98．2％，正己烷99．2％。苯99．3％，二甲苯99．6％，其他合格率为100％。结论惠州市部分电子、五金、电镀企业车间空气中有毒物的浓度较高，应改善生产车间的通风设施，做好工人的个人防护。     

食品中氯霉素测定方法的应用研究

目的探讨ELISA检测法检测食品中氯霉素的可行性。方法采用国际上先进的ELISA检测法和酶标读数仪定量检测，并与高效液相色谱-电喷雾串联质谱法（HPLC—MS／MS）比较。结果氯霉素含量为0．05～0．20ug／kg之间，CV％为2．5％～5％，回收率为85．0％～110．0％，标准曲线r=-0．992～-0．999。结论ELISA法具有灵敏度高，干扰少，测定步骤简便、快速。操作安全，设备投资少，测定结果准确可靠。     

广东省2007年部分地区儿童麻疹免疫水平监测结果分析

目的了解广东地区儿童麻疹免疫水平,客观评价人群麻疹免疫状况,为调整策略并改进工作提供依据。方法采取分层整群抽样法抽取南海、盐田、饶平、乳源、德庆、遂溪6个县4个年龄组1376名儿童,对其麻疹抗体水平进行检测。结果6个地区麻疹IgG抗体总阳性率为96．9％,麻疹IgG抗体总保护率为80．2％,总抗体几何平均浓度（GMC）为1515mIU／ml;不同地区儿童麻疹抗体阳性率、保护率和抗体几何平均浓度（GMC）均有显著性差异;年龄别儿童麻疹抗体阳性率差异无显著性,但麻疹保护率和抗体几何平均浓度（GMC）存在显著性差异;外地与本地儿童麻疹抗体阳性率、保护率和抗体几何平均浓度（GMC）均显示无显著性差异。结论结果显示调查地区抗体总阳性率维持高水平,但珠江三角洲经济发达地区常规免疫工作质量要好于非珠江三角洲经济欠发达地区;麻疹复种工作可有效减少免疫空白儿童,维持人群麻疹高免疫水平;居住时间较长的流动儿童可以获得高的麻疹免疫水平,结合麻疹发病情况,需重点关注居住时间较短的流动儿童免疫状况。     

湖南侗族嘴部活体观测

目的　探讨湖南侗族成年人嘴部的形态特征 ,为体质人类学研究积累资料。方法　用活体观测方法对 2 64例成年侗族人嘴部进行活体研究。结果　得出了湖南侗族嘴部 3项观察值和 6项测量值 ,以及口裂高、宽指数及其分型。结论　湖南侗族嘴部有其独特的特征。     

显色培养基在检测食品中沙门菌的应用研究

目的考核显色培养基对沙门菌的检测效果，以新型快速检测方法。方法按国标（GB4789．4—2003）程序比较几种培养基检测食品中沙门菌的效果。结果以CHROMagar沙门菌显色培养基、HKM沙门菌显色培养基与传统平板DHL对测试菌株和实际样品检测可以达到相近的检测限和灵敏度。HKM沙门菌显色培养基对某些沙门菌的检出灵敏度比CHROMagar沙门菌显色培养基更高。结论用显色培养基检测沙门菌是一种新快速途径，可大大提高检测效率。