白藜芦醇对人上皮性卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究白藜芦醇抑制人上皮性卵巢癌细胞增殖并促进其凋亡的作用及机制。方法:将人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3细胞随机分为5组,即正常对照组、白藜芦醇高剂量组(40 mg·L~(-1))、白藜芦醇中剂量组(20 mg·L~(-1))、白藜芦醇低剂量组(10 mg·L~(-1))和顺铂组(40 mg·L~(-1))。干预48 h后,通过光学显微镜观察各组细胞形态,MTT比色法检测各组细胞增值抑制率。通过流式细胞仪分析细胞周期的改变、流式细胞术检测细胞凋亡并计算细胞凋亡率,采用RT-PCR法检测细胞Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达并计算Bax/Bcl-2比值,Western blot法检测细胞caspase-3蛋白表达。结果:与正常对照组比较,白藜芦醇高、中剂量组细胞出现变圆、脱壁、细胞间接触松散等状态,细胞抑制作用明显、增殖抑制率显著升高(P0.01);白藜芦醇各剂量组细胞周期被阻滞于G2/M期,白藜芦醇高、中剂量组细胞凋亡率显著升高(P0.01),同时可明显下调Bcl-2 mRNA而上调Bax mRNA表达,显著提高Bax/Bcl-2值(P0.05,P0.01),上调caspase-3蛋白表达(P0.01)。结论:白藜芦醇能够通过抑制增殖并促进凋亡对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞生长起到一定的抑制作用,其机制可能与白藜芦醇调节凋亡相关基因蛋白表达有关。     

PTEN基因转染对卵巢癌SKOV3细胞生长抑制和诱导凋亡的研究

目的研究外源性PTEN基因转染对人卵巢癌SKOV3细胞生长增殖抑制和凋亡诱导作用,探索卵巢癌的新治疗方法。方法将携带PTEN基因的真核表达载体pBP-PTEN和不含该基因的空载体pBP转染卵巢癌SKOV3细胞,实验分组为pBP-PTEN、pBP和SKOV3组,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察对SKOV3细胞的生长抑制作用,Annexin V/PI双标记流式细胞术检测转染后对SKOV3细胞的凋亡诱导作用,Annexin V/PI双染荧光显微镜观察细胞凋亡形态。结果MTT检测,0.1、0.2和0.3μg/孔PTEN质粒DNA转染SKOV3细胞48 h,生长抑制率分别为13.31%、27.67%、42.25%,不同时间点(24、48和72 h)检测,细胞生长抑制率存在剂量-时间依赖关系。光镜观察,转染24 h后即可见明显的形态学改变。流式细胞术检测,4μg/孔PTEN质粒DNA转染SKOV3细胞24和48 h后,细胞凋亡率分别达38.08%和65.60%(P<0.01)。Annexin V/PI双染荧光显微镜观察,细胞凋亡率存在时间-剂量以来关系。结论PTEN基因转染抑制人卵巢癌细胞增殖并显著诱导细胞凋亡。     

干扰ATF5功能对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性影响

目的探讨干扰转录激活因子5(ATF5)功能对卵巢癌细胞SKOV3紫杉醇(PTX)敏感性的影响。方法应用RT-PCR、Western blot方法检测SKOV3细胞中ATF5的表达;WST-8法检测不同浓度PTX(0、10、20、40、80、100nmol/L)与SKOV3细胞作用不同时间(24、48、72h)后细胞增殖情况;将SKOV3细胞分为空质粒组(vector组)、干扰质粒组(dnATF5组)、药物组(PTX组)、联合治疗组(dnATF5+PTX组),对vector组、dnATF5组、dnATF5+PTX组进行质粒转染,转染后24hPTX组和dnATF5+PTX组给予PTX(70nmol/L)作用48h,WST-8法和流式细胞术检测各组细胞的增殖抑制率或细胞凋亡率;Western blot检测干扰质粒转染SKOV3不同时间(0、24、48h)后Bcl-2蛋白的表达。以急性视网膜色素上皮-19(ARPE-19)二倍体细胞作为正常对照。结果卵巢癌SKOV3细胞中高表达ATF5;PTX对SKOV3细胞生长具有明显的抑制作用,呈剂量和时间依赖性(F=497.68～11 286.93,P<0.05);干扰ATF5功能后明显促进PTX诱导的SKOV3细胞增殖抑制或细胞凋亡(t=11.40、13.86,P<0.05);与ARPE-19细胞相比,干扰ATF5功能联合PTX作用对SKOV3细胞增殖和凋亡的影响更明显(t=11.50、13.86,P<0.05);干扰ATF5功能后SKOV3细胞Bcl-2蛋白的表达明显下调(F=158.38,P<0.05)。结论 ATF5在卵巢癌SKOV3细胞中高表达,干扰ATF5能明显增强卵巢癌SKOV3细胞对PTX的敏感性,其机制可能与Bcl-2的下调有关;干扰ATF5功能联合PTX作用对肿瘤细胞的疗效强于二倍体细胞。     

β-CM-7对MCF-7、SKOV3和SK-N-SH肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨β-酪啡肽-7(β-CM-7)在体外对人乳腺癌细胞(MCF-7)、人卵巢癌细胞(SKOV3)和人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)增殖和凋亡的影响。方法用MTT测定法观察β-CM-7在体外对MCF-7、SKOV3、SK-N-SH细胞增殖的影响。用流式细胞仪测定β-CM-7在体外对MCF-7和SKOV3细胞凋亡的影响。结果β-CM-7作用于MCF-7细胞24和48h,对其增殖影响不明显(P>0.05)。2.5×10-6~2.5×10-2g/L的β-CM-7作用72h,能抑制MCF-7细胞增殖(P<0.05或P<0.01),抑制率为17.50%~32.08%。β-CM-7作用MCF-7细胞72h,在2.5×10-7~2.5×10-2g/L剂量下,诱导肿瘤细胞的凋亡(P<0.05或P<0.01),凋亡率为9.23%~29.41%,而在作用48h后,仅在2.5×10-3g/L的高浓度下具有诱导肿瘤细胞的凋亡作用,凋亡率为10.12%。β-CM-7作用于SKOV3细胞24~72h,只有在高剂量(2.5×10-2g/L和/或2.5×10-3g/L)时,抑制肿瘤细胞增殖(P<0.05),抑制率为10.50%~19.44%。β-CM-7作用SKOV3细胞48h和72h,在2.5×10-3~2.5×10-2g/L高剂量下能诱导肿瘤细胞的凋亡(P<0.05或P<0.01),凋亡率为8.72%~17.83%。β-CM-7对SK-N-SH肿瘤细胞增殖影响无显著性(P>0.05)。结论β-CM-7能够抑制MCF-7和SKOV3细胞增殖,诱导细胞凋亡,作用结果与其剂量和作用时间有关。β-CM-7对SK-N-SH细胞的增殖无明显影响。     

雷公藤内酯醇通过p38MAPK信号通路诱导Hut102细胞凋亡

目的 探讨雷公藤内酯醇(triptolide,TP)诱导皮肤T细胞淋巴瘤蕈样肉芽肿细胞株Hut102的凋亡及其机制.方法 体外培养的Hut102细胞与12.5、25、50、100 nmol/L雷公藤内酯醇共同孵育,分别在24、48、72 h用MTT法检测Hut102细胞的增殖抑制率,Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术分析细胞凋亡,Western blot检测Hut102细胞中磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38)、caspase-3蛋白的表达水平.结果 不同浓度雷公藤内酯醇(12.5、25、50、100 nmol/L)作用Hut102细胞24 h后的增殖抑制率分别为8.67%、30.02%、52.54%、59.62%.Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测经25、50、100 nmol/L雷公藤内酯醇处理24 h后Hut102细胞凋亡率分别为9.19%、21.49%、26.34%,当50 nmol/L雷公藤内酯醇组预先用p38MAPK特异性抑制剂SB203580干预后,Hut102细胞凋亡率下降为14.35%.不同浓度雷公藤内酯醇(50、100 nmol/L)处理Hut102细胞后p38、caspase-3蛋白的表达被激活,同样50 nmol/L雷公藤内酯醇组也预先用p38MAPK特异性抑制剂SB203580干预,结果p-p38的表达降低,caspase-3激活被抑制.结论 雷公藤内酯醇可以抑制Hut102细胞的增殖,其作用机制可能是通过激活p38MAPK信号通路使部分Hut102细胞产生凋亡.     

古抑菌素A对人肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的 探讨去乙酰化转移酶抑制剂古抑菌素A(TSA)对人肝癌细胞株HepG2增殖及凋亡的影响.方法 体外培养人肝癌细胞株HepG2,以不同浓度的TSA(5、50、250、500、1 000、2 000 nmol/L)处理24 h后在倒置显微镜和透射电镜下观察HepG2形态的变化,用CCK-8法检测细胞增殖活性.用TUNEL法检测对照组(加等量DMSO)和500 nmol/L TSA组的细胞凋亡率,用免疫细胞化学法检测两组增殖凋亡调控相关基因caspase-3、bax和bcl-2的蛋白表达.结果 倒置显微镜下,经TSA处理的细胞增殖速度显著减慢;透射电镜下,HepG2出现凋亡早期改变.CCK-8法测定结果显示,对照组和不同浓度TSA(5、50、250、500、1 000、2 000 nmol/L)组HepG2的增殖活性分别为(0.637±0.032)、(0.552±0.016)、(0.499±0.031)、(0.393±0.007)、(0.321±0.026)、(0.277±0.010)和(0.275±0.015),组间比较差异有统计学意义(P＜0.01);且不同浓度的TSA对HepG2的增殖抑制作用有明显的剂量依赖关系.500 nmol/L TSA组细胞凋亡率显著高于对照组,且其凋亡相关蛋白caspase-3和bax的表达较对照组显著增强,差异有统计学意义(P＜0.05);而两组bcl-2的蛋白表达间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TSA可通过增加caspase-3、bax的蛋白表达,诱导细胞凋亡而对人肝癌细胞株HepG2具有增殖抑制作用.     

ARHI基因诱导人卵巢癌SKOV3细胞株S期阻滞、凋亡及自体吞噬的研究

目的:研究母源性肿瘤抑制印迹基因ARHI对人卵巢癌SKOV3细胞株的作用?方法: 将pIRES2-EGFP-ARHI质粒转染至ARHI基因低表达的人卵巢癌SKOV3细胞内实现ARHI基因表达,CCK-8法检测pIRES2-EGFP-ARHI-SKOV3细胞组(实验组)?pIRES2-EGFP-SKOV3细胞组(质粒对照组)及SKOV3细胞组(阴性对照组)的吸光度值,计算细胞生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期分布并检测细胞凋亡率,并用Western blot检测微管相关蛋白轻链Ⅱ(LC3-Ⅱ)的表达水平变化?结果:实验组细胞培养24?48?72?96及120 h的生长抑制率分别为64.69%?70.17%?67.01%?66.87%?67.70%,均明显高于质粒对照组(P﹤0.01)?培养48 h时实验组?质粒对照组?阴性对照组S期细胞的比例分别为64.18%?38.43%及15.15%,凋亡率分别为47.97%?26.53%及9.33%;培养72 h时S期细胞的比例分别为43.29%?10.37%及10.89%,凋亡率分别为51.34%?24.70%及4.39%;实验组细胞培养48 h时LC3-Ⅱ表达水平增加,与对照组间有明显差异?结论:ARHI基因抑制SKOV3细胞生长,使SKOV3细胞阻滞于S期,并诱导凋亡及自体吞噬?     

Smac小分子compound3调节顺铂诱导卵巢癌细胞SKOV3凋亡的研究

目的探讨Smac小分子compound 3调节顺铂对卵巢癌细胞SKOV3凋亡及生长抑制作用。方法噻唑蓝法检测Smac小分子compound 3单独应用组、顺铂单独应用组及二者联合应用组对卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制率、存活率的影响;并绘制生长曲线。Annexin V/PI双标流式细胞术检测Smac小分子compound 3单独应用组、顺铂单独应用组及二者联合应用组对SKOV3凋亡率的影响。Western印迹检测Smac小分子compound 3单独应用组、顺铂单独应用组及二者联合应用组对SKOV3的X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosisprotein,XIAP)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达影响。结果 Smac小分子compound 3单独应用组、顺铂单独应用组及二者联合应用组12、24、48 h SKOV3生长受到抑制,且呈时间依赖性。二者联合应用组与顺铂单独应用组比较生长抑制率明显升高。二者联合应用组的凋亡率高于顺铂单独应用组及Smac小分子compound 3单独应用组。Smac小分子compound 3单独应用组及二者联合应用组SKOV3的XIAP表达降低,二者联合应用组的caspase-3的激活片段表达明显高于其他两组。结论 Smac小分子compound 3能够调节顺铂对SKOV3生长抑制作用,促进顺铂对卵巢癌细胞SKOV3凋亡作用。Smac小分子compound 3通过影响XIAP的表达来实现其促凋亡及生长抑制作用。     

γ分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路对人卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察γ分泌酶抑制剂 （DAPT）对人宫颈癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法 不同浓度DAPT对SKOV3细胞作用后,采用CCK-8法检测对SKOV3细胞的增殖抑制作用,吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）荧光双染色法及流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR、Western blot检测SKOV3细胞Notch1 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果 与空白对照组相比,5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L浓度的DAPT对SKOV3细胞均有一定的增殖抑制作用（P<0.05),且其抑制作用呈剂量依耐性增加（P<0.05),24 h抑制率分别为19.87%、28.38%、46.67%。与空白对照组相比,不同浓度的DAPT作用SKOV3细胞24 h后凋亡率增加（P<0.05),且随DAPT浓度增加,凋亡细胞逐渐从早期凋亡过渡至晚期凋亡;Notch1 mRNA和蛋白表达抑制,其抑制率分别为 （10.23%、20.50％、38.83％）和 （12.89%、27.47％、49.84％）。结论 γ分泌酶抑制剂DAPT可阻断Notch信号通路,能抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖,促进细胞凋亡,其作用机制可能与下调Notch1表达有关。     

花生红衣原花青素通过Wnt/β-catenin信号通路下调survivin表达诱导胰腺癌细胞凋亡

目的 探讨花生红衣原花青素(PSP)通过下调survivin表达诱导胰腺癌细胞凋亡的分子机制。方法 体外常规培养胰腺癌细胞株,配制100、200、300、400、500、600 μg/mL不同质量浓度的PSP,CCK-8法检测并计算不同质量浓度PSP在72 h内对胰腺癌细胞的抑制率,选取IC50=450 μg/mL作为PSP处理组剂量,并设对照组。Western blotting法检测胰腺癌细胞GSK-3β和β-catenin磷酸化程度、survivin、caspase-3和caspase-7蛋白表达水平,RT-PCR法检测胰腺癌细胞survivin mRNA表达水平,Annexin V-FITC/PI法检测24、48、72 h时PSP对胰腺癌细胞凋亡率的影响。 结论 与对照组相比,PSP处理组胰腺癌细胞GSK-3β和β-catenin磷酸化程度于12 h达到最高(P＜0.01)。PSP处理组胰腺癌细胞survivin mRNA的表达量与对照组比较明显降低(P＜0.01)。与对照组比较,在PSP的作用下,胰腺癌细胞中survivin蛋白表达量在72 h时最低(P＜0.01),caspase-3和caspase-7表达量在72 h时最高(P＜0.01),胰腺癌细胞凋亡率随着时间延长越来越高,在72 h时达到51.59%(P＜0.01)。结论 PSP可通过Wnt/β-catenin信号通路下调survivin蛋白表达诱导胰腺癌细胞凋亡。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .