HIF-1α介导BMSCs复合PLGA修复大鼠颅骨标准骨缺损的研究

目的 构建低氧诱导因子(HIF)-1α介导骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)支架材料血管化组织工程骨,观察其在大鼠颅骨标准骨缺损中的修复效果.方法 将目的基因HIF-1 α转染至BMSCs后,与支架材料PLGA复合,修复SD大鼠颅骨双侧直径5 mm的标准骨缺损(n=18),随机分为3组:实验组植入HIF-1 α-BM-SCs/PLGA复合体(n=6),对照组植入BMSCs/PLGA复合体(n=6),材料组仅植入PLGA支架材料(n=6).术后8周处死大鼠取材,分别行大体观察、X线片检查和HE染色观察缺损区骨形成情况.结果 大体观察、X线片检查和HE染色均显示实验组缺损区新骨形成量明显大于对照组及材料组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 体内研究表明HIF-1α能够介导BMSCs促进骨组织形成,PLGA是理想的支架材料,用其构建的血管化工程骨能够有效修复骨缺损.     

负载BMP的新型组织工程骨的构建及骨缺损修复实验

目的 探讨以聚乳乙醇酸(poly-(D,L-lactide-co-glycolide),PLGA)、骨形态发生蛋白(BMP)、骨髓基质干细胞(BM-SCs)构建成新型组织工程骨并观察其在动物体内的成骨能力。方法 制作新西兰大白兔右桡骨中段15mm骨缺损实验模型,随机分为实验组、对照组和空白组,实验组植入同时负载5mgBMP及1×10⁶个已向成骨细胞诱导的BMSCs的PLGA、对照组植入负载1×10⁶个已向成骨细胞诱导的BMSCs的PLGA、空白组仅植入PLGA。术后对动物进行大体观察、摄X线片观察各组不同时相骨缺损修复情况、比较不同时相的骨缺损区X线阻射密度、并于术后第4、8、12周取出骨缺损区标本进行大体观察和组织学切片观察,图像分析骨小梁的生成数量。结果 实验组在12周内骨缺损完全修复,且同时期内新生骨的数量和质量显著优于对照组,空白材料组骨缺损主要由纤维结缔组织填充。结论 利用含BMP的PLGA支架与BMSCs复合构建的新型组织工程骨具有良好的骨缺损修复能力。     

联合应用成骨诱导后骨髓间充质干细胞与PLGA支架材料修复免桡骨缺损的实验研究

目的研究聚乳酸聚乙醇酸复合物（ Po （ yclactic - co - glycolic acid ）, PLGA ）支架作为组织工程骨支架修复骨缺损的可行性。方法体外培养兔骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）,在成骨诱导荆地塞米松等的诱导下,向成骨细胞转化,并使之与修饰后PLGA支架复合,植入兔桡骨缺损模型,作为实验组。对照组a为PLGA材料对照,对照组b为空白对照,通过影像学观察骨缺损的修复情况。结果地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,碱性磷酸酶表达明显增高,并表达I型胶原。应用多聚赖氨酸修饰的PLGA与成骨诱导的BMSCs复合植入骨缺损后,与对照组相比影像学显示明显促进骨缺损的愈合。结论适当浓度成骨诱导剂可成功的将免骨髓间充质细胞向成骨细胞诱导,诱导后细胞与PLGA支架联合应用可较好修复兔桡骨缺损。     

联合应用成骨诱导后骨髓间充质干细胞与PLGA支架材料修复兔桡骨缺损的实验研究

目的研究聚乳酸聚乙醇酸复合物（ Po （ yclactic - co - glycolic acid ）, PLGA ）支架作为组织工程骨支架修复骨缺损的可行性。方法体外培养兔骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）,在成骨诱导荆地塞米松等的诱导下,向成骨细胞转化,并使之与修饰后PLGA支架复合,植入兔桡骨缺损模型,作为实验组。对照组a为PLGA材料对照,对照组b为空白对照,通过影像学观察骨缺损的修复情况。结果地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,碱性磷酸酶表达明显增高,并表达I型胶原。应用多聚赖氨酸修饰的PLGA与成骨诱导的BMSCs复合植入骨缺损后,与对照组相比影像学显示明显促进骨缺损的愈合。结论适当浓度成骨诱导剂可成功的将免骨髓间充质细胞向成骨细胞诱导,诱导后细胞与PLGA支架联合应用可较好修复兔桡骨缺损。     

PLGA/CPC支架材料复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的体外效果评价

目的：探讨聚乳酸聚羟基乙酸/磷酸钙骨水泥(PLGA/CPC)复合骨髓基质干细胞（BMSCs）构建组织工程骨的可行性,为预防剩余牙槽嵴萎缩和促进骨再生提供科学理论指导。方法：采用溶剂浇铸-粒子沥滤技术结合相分离法制备PLGA/CPC支架材料;体外分离、培养、纯化大鼠BMSCs;第3代BMSCs经Dil染色后接种于复合支架材料。实验分为实验组（PLGA/CPC +BMSCs）和对照组（单纯BMSCs）。扫描电镜和激光共聚焦观察支架材料的孔隙率及BMSCs在支架上的黏附情况;CCK-8和碱性磷酸酶(AKP)法检测2组细胞增殖和分化。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均为200~300 μm,支架材料与细胞黏附性较好;原代BMSCs前3 d增殖较慢,3～6 d增殖较快,6 d后增殖较慢;BMSCs表面抗原CD44和CD105均呈阳性表达;茜素红和Ⅰ型胶原染色,BMSCs有良好的成骨活性;Dil染色,细胞标记率达90%以上,标记物对细胞形态无明显影响。CCK-8和AKP法检测,实验组和对照组BMSCs增殖率和AKP活性差异无统计学意义（P>0.05）。结论：PLGA/CPC是理想的组织工程支架材料。     

不同质量比SF/PLLA复合纤维支架上共培养的上皮细胞和成纤维细胞增殖和表型的变化

目的: 观察不同质量配比的丝素蛋白(SF)和聚乳酸(PLLA)构建的SF/PLLA复合纤维支架对上皮细胞和成纤维细胞增殖和表型的影响,阐明SF/PLLA生物工程膜的细胞相容性。方法: 使用SF和PLLA作为支架材料,以SF与PLLA不同质量比(S50/P50、S40/P60和S30/P70)进行混合纺丝,制备出不同比例的SF/PLLA复合纤维支架,采用SF/PLLA复合纤维支架与皮肤组织中分离的原代上皮细胞和成纤维细胞进行共培养。采用CCK8方法检测细胞在不同质量比的支架材料上的增殖活性,免疫荧光染色观察共培养细胞的特异标记蛋白表达。结果: 共培养第5和6天时,在S50/P50组复合纤维支架上的成纤维细胞增殖活性高于S40/P60组和S30/P70组(P<0.01),在S40/P60组复合纤维支架上的上皮细胞增殖活性明显高于S50/P50和S30/P70组(P<0.05或P<0.01)。接种于SF/PLLA复合纤维支架的上皮细胞表达CK19蛋白,接种的成纤维细胞表达Vimentin 蛋白。2种细胞与SF/PLLA复合纤维支架共培养,S40/P60和S50/P50组复合纤维支架上的细胞生长状态优于S30/P70组。结论: 支架中SF的浓度增加可以明显提高细胞增殖活性,促进细胞存活,SF/PLLA复合纤维支架对细胞的生物表型无明显影响。     

HGF基因重组腺病毒载体构建及其转染对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响

目的构建携带大鼠肝细胞生长因子(HGF)基因的重组腺病毒载体,并转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测其在BMSCs的表达、以及对BMSCs增殖和迁移的影响。方法利用全基因合成方法得到目的基因HGF序列,将HGF基因片段与穿梭质粒pDC316-mCMV-增强绿色荧光蛋白(EGFP)连接,构建含有目的基因的pDC316-mCMV-EGFP-HGF重组质粒,经过病毒包装及扩增,获得带有荧光报告基团EGFP与HGF基因的重组腺病毒载体pDC316-mCMV-EGFP-HGF。将pDC316mCMV-EGFP-HGF重组腺病毒载体转染BMSCs细胞,通过ELISA检测HGF表达水平,CCK-8法检测BMSCs增殖能力,Transwell法检测BMSCs迁移。结果构建了表达HGF基因和荧光报告基因EGFP的重组腺病毒载体pDC316-mCMV-EGFP-HGF,转染BMSCs后,BMSCs细胞HGF表达水平、增殖及迁移均明显高于非转染组(P<0.05)。结论成功构建pDC316-mCMV-EGFP-HGF重组腺病毒载体,可以介导HGF在BMSCs中稳定表达,并提高BMSCs增殖及迁移能力。     

骨保护素基因修饰的Beagle犬骨髓基质细胞在牙周组织再生中的作用

目的观察骨保护素(OPG)基因修饰的骨髓基质细胞(BMSCs)复合PLGA材料移植对牙周骨缺损的修复作用。方法4只成年Beagle犬,选其24颗前牙丝线结扎饲以高糖饮食构建牙周病模型。翻瓣检查修整近中牙槽骨缺损至3mm,实验牙分为3组:实验组(缺损处植入OPG基因修饰的BMSCs复合PLGA)、阴性对照组(缺损处植入BMSCs复合PLGA)、空白对照组(常规牙周翻瓣治疗)。6周后临床、X线片观察,切片组织学观察,统计学分析相关数据。结果OPG基因修饰的BMSCs明显促进骨缺损的修复,组织学评分与两对照组相比差异有显著性(P<0.01)。结论OPG能有效促进犬牙周骨缺损的骨组织再生。     

β-TCP/PLGA复合BMSCs联合高压氧修复海水浸泡兔桡骨骨缺损的作用研究

目的 探讨β-磷酸三钙/聚乳酸-羟基乙酸共聚物(β-TCP/PLGA)复合骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合高压氧修复海水浸泡骨缺损的疗效.方法 复苏和传代的BMSCs接种于pTCP/PLGA支架上,构建组织工程骨.60只新西兰兔在双侧桡骨制作1.5cm的骨缺损,经海水浸泡3h后,分成4组,A组:空白对照组;B组:单纯BMSCs组;C组:BMSCs+高压氧组;D组:β-TCP/PLGA+ BMSCs高压氧组.分别于术后4、8A2周分别X射线摄片处死后取桡骨.通过X线片、苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学检测,评价各组海水浸泡骨缺损修复效果.结果 影像学检查,术后12周A组骨缺损未完成修复,断端硬化;B组骨缺损部分修复;C组骨缺损基本完成修复,髓腔未通;D组骨缺损完成修复,髓腔再通.各个时间点骨痂灰度值D组＞C组＞B组＞A组(P＜0.05).组织学观察,术后12周,A组少量板层骨;B组少量板层骨形成,少量骨小梁生成;C组大量板层骨形成,骨小梁排列欠规则;D组大量板层骨形成,骨小梁排列规则.免疫组织化学检测各组表达骨钙素(OCN)强度,术后4周最强,术后8周减弱,术后12周达到最低.术后4周和8周,OCN表达强度D组＞C组＞B组＞A组(P＜0.05),术后12周各组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 β-TCP/PLGA复合BMSCs联合高压氧是修复海水浸泡骨缺损的有效方法之一.     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7（BMP-7）的骨髓基质干细胞（BMSCs）,并与纳米羟基磷灰石胶原（nHAC）材料复合培养体外构建组织工程骨。方法用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养。荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;以四唑盐（MTT）实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶（ALP）活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况。结果慢病毒24h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异（P〉0.05）;RT-PCR检测到BMP-7表达,在1300bp处出现特异性条带;ELISA检测24hBMP-7蛋白含量为（150.2±18.3）pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好。结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨。     

负载成骨生长肽的静电纺丝PLGA支架可加速大鼠颅骨缺损再生

目的 从体内外水平评价一种负载了成骨生长肽（OGP）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纤维支架作为新型骨组织工程支架的可行性。方法 采用静电纺丝法制备支架,一共有4组。对照组：纯PLGA支架（不含OGP的 PLGA支架）;实验组：0.1%OGP@PLGA（电纺含有0.1%OGP的PLGA溶液制得的支架）、0.2%OGP@PLGA（电纺含有0.2%OGP的PLGA溶液制得的支架）、0.4%OGP@PLGA（电纺含有0.4%OGP的PLGA溶液制得的支架）。通过扫描电子显微镜（SEM）观察支架的微观结构,将材料浸泡在PBS中观察支架中OGP的释放规律,CCK-8和活死细胞染色实验评估支架的体外生物相容性,ALP活性检测和ARS染色评估支架上大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的体外成骨分化水平,在雄性SD大鼠上制备直径为5 mm大小的颅骨缺损模型,将支架植入8周后利用Micro-CT检测、HE染色和Masson染色分析缺损处的骨修复情况。结果 SEM结果显示,支架具有类细胞外基质（ECM）的纤维结构,负载的OGP能持续从支架内缓释长达1月以上,将细胞与支架共培养4、7 d后,负载高浓度OGP（OGP浓度大于2%）的PLGA支架细胞增殖率显著高于纯PLGA支架（P<0.01）,ALP活性检测结果显示第14天时,在负载0.4%含量OGP的PLGA支架上rBMSCs的ALP活性最高（P<0.01）。ARS染色结果显示,细胞14 后在负载0.4% OGP的PLGA支架上分泌的钙化结节最多。Micro-CT扫描结果发现,负载0.4% OGP的PLGA组材料周围较其他两组有更多的新骨生成（P<0.01）。此外组织学HE和Masson染色结果和以上结果类似。结论 负载OGP的静电纺丝PLGA支架有效模拟了体内细胞外基质,具有良好的生物相容性及促成骨分化能力,是一种具有潜在应用价值的新型骨组织工程支架。     

聚乳酸-聚羟基乙酸植入大鼠拔牙创对骨愈合的影响

目的 探讨多孔聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物（PLGA）植入大鼠拔牙创对牙槽骨再生的影响。方法： 选用健康雄性Wistar大鼠60只, 随机分为实验组30只和对照组30只,拔除右下颌中切牙后,实验组即刻植入PLGA支架材料,自然愈合拔牙创作为对照组,于术后1、2、4、8和12周分别处死大鼠。用软X线及组织形态学方法评价大鼠下颌切牙拔牙窝的愈合情况。 结果：术后4、8周与对照组相比,实验组剩余牙槽嵴长度明显降低（P<0.05）;术后 2、4和8周实验组剩余牙槽嵴的相对宽度高于对照组（P<0.05）。 组织形态学显示,术后8周,实验组拔牙窝内可见极少量的未降解的支架材料,对照组拔牙窝内充满新生骨,但有间隙存在;术后12周,支架材料完全降解,实验组和对照组拔牙窝内均可见编织状骨,实验组骨沉积线明显。 结论： PLGA生物材料在不影响牙槽窝骨组织愈合过程的同时,能有效地保持剩余牙槽嵴的长度和宽度。该材料不但具有良好的生物相容性和稳定性,而且具有骨引导的效应。     

负载BMP的新型组织工程骨的构建及骨缺损修复实验

OBJECTIVE: To construct a new tissue-engineered bone with poly (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA), bone morphogenetic protein (BMP) and bone marrow-derived stem cells (BMSCs) and observe its effect in repairing segmental bone defects. METHODS: A 15-mm bone defect in the right radius was induced in New Zealand white rabbits, and the models were randomized into three groups to receive implantation of the tissue-engineered bone grafts constructed with PLGA carrying 5 mg BMP and about 1 x 10(6) BMSCs (experimental group), grafts of PLGA with about 1 x 10(6) BMSCs (control group), or grafts of exclusive PLGA (blank control group), respectively. The osteogenesis in the bone defect after the implantation on was evaluated X-ray films, and the histological changes of the tissues sampled from the bone defect 4, 8, and 12 weeks after operation were observed and new bone formation was measured by image analysis. RESULTS: The bone defect was completely repaired in the experimental group 12 weeks after the implantation, showing the best results among the 3 groups. The bone defects in the blank control group was filled with only fibrous and connective tissues at 12 weeks. CONCLUSION: This tissue-engineered bone constructed with PLGA, BMP and BMSCs possesses good ability in repairing segmental bone defect.     

生物活性复合膜对大鼠牙周组织缺损的修复作用

目的：联合应用胶原（Co）、聚乳酸/聚羟基乙酸共聚体（PLGA）、牙周膜细胞（PDLCs）和血小板胶（APG）制作生物活性复合膜,评价其对大鼠牙周组织缺损的修复效果。方法：合成厚度约0.5 mm的PLGA膜,与PDLCs体外共培养3 d。扫描电镜观察PLGA结构及PDLCs生长情况。选取1只成年雄性Wistar大鼠,抽取全血10 mL制作富血小板血浆（PRP） 1 mL,加入含有1 000 U•mL^-1牛凝血酶的10% CaCl2溶液制成APG。应用酶联免疫吸附法测定全血和PRP中生长因子水平。将60只成年雄性Wistar大鼠随机分为5组,分别制作大鼠下颌牙周骨缺损模型（5 mm×2 mm,去除根面牙骨质）。各组按置入材料不同命名为对照组、PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组、PLGA+PDLCs+Co组和PLGA+PDLCs+APG+Co组。术后2、4和6周每组分别处死4只大鼠,HE染色观察新生牙周骨量,应用Image-Pro Plus测量新生牙周骨面积。结果：PLGA膜平均孔径为(131.80±43.97)  μm,孔隙率为60%;PDLCs能在PLGA膜上黏附生长、状态良好。PRP中血小板浓度高达全血的4倍以上,PRP上清液中生长因子水平高于血浆(P<0.05)。术后6周牙周新生骨量PLGA+PDLCs+APG+Co组分别高于PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组和PLGA+PDLCs+Co组,差异有统计学意义（P<0.05）; PLGA+APG+Co组和PLGA+PDLCs+Co组高于PLGA+Co组（P<0.05）; PLGA+Co组、PLGA+APG+Co组、PLGA+PDLCs+Co组和PLGA+PDLCs+APG+Co组均高于对照组（P<0.05）;PLGA+APG+Co组与PLGA+PDLCs+Co组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：PLGA膜生物相容性良好,孔径大小适宜,具有良好的机械性能;PLGA+PDLCs+APG+Co生物活性复合膜能促进牙周组织生长,对牙周骨组织缺损修复具有显著作用。     

antagomir-30d转染BMSCs联合CPC支架材料的异位成骨作用

目的：构建antagomir-30d/种子细胞骨髓间充质干细胞（BMSCs）/磷酸钙骨水泥（CPC）复合物,并将该复合物植入裸鼠皮下,研究antagomir-30d促进体内骨形成的作用。方法：将转染有150 nmol/L antagomir-30d、NC的BMSCs以及未经转染的空白BMSCs转移到CPC支架进行孵育,后植入到BALB/c-nu裸鼠皮下,以此研究裸鼠异位成骨。术后2、4、8周分别取出植入体。2周时,取出植入体,提取RNA进行RT-PCR检测,分析成骨基因碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）以及Runt相关转录因子2(RUNX2)mRNA表达情况。此外,4周和8周的植入体分别进行苦味酸品红组织学染色和组织形态学分析新骨形成的情况。结果：植入2周RT-PCR结果显示,各成骨基因mRNA水平的表达量中转染有antagomir-30d组最高,并显著高于另外2组（P<0.05）。组织学染色结果表明,植入后4周,antagomir-30d组有少量新骨形成,而另外2组则少有新骨形成。组织形态学分析显示,新骨面积百分比antagomir-30d组为1.28%±0.19%。植入后8...     

复合BMSCs的异种骨移植材料异位成骨研究

目的:制备兔脱钙骨基质(DBM),研究复合骨髓间充质干细胞(BMSCs)的DBM的异位成骨能力。方法:制备DBM材料,将体外培养的ICR小鼠BMSCs与DBM复合培养后构建的组织工程骨植入ICR小鼠股部肌袋中,以单纯DBM植入组为对照,术后7d及28d行X线检测,并于术后7,14,28d取植入材料作组织学检测、钙含量测定。结果:DBM与BMSCs复合体植入后7d即有成骨细胞出现,随着时间增加成骨细胞增多,术后28d即有较成熟骨质形成,移植物钙含量随时间推移逐渐增高。单纯植入DBM术后14d出现少量成骨细胞,术后28d出现少量类骨质,钙含量持续处于较低水平。结论:DBM与BMSCs复合后具有很好的异位成骨能力,DBM是组织工程骨研究较理想的支架材料。