大鼠血管外膜成纤维细胞的原代培养及生物学行为研究

目的:建立大鼠血管外膜成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的方法,并对其生物学特征进行观察。方法:通过组织块贴壁法,以含20%胎牛血清的DMEM诱导细胞生长,0.25%的胰酶消化细胞传代后用含10%胎牛血清的DMEM在37℃,5%CO₂,饱和湿度下培养。倒置显微镜下观察成纤维细胞形态,进行细胞中间丝蛋白的免疫化学鉴定,并绘制细胞生长曲线。结果:成纤维细胞能够迅速从组织块长出并增殖,波形蛋白免疫细胞化学染色为阳性,结蛋白及第Ⅷ因子染色为阴性,细胞在第(2～4)天进入指数生长期。结论:该方法所获得的血管外膜成纤维细胞可在体外稳定培养,为在细胞水平研究血管再狭窄机制提供了充足可靠的靶细胞模型。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的:探索纯度较高、相对经济简便的大鼠脑微血管内皮细胞分离和原代培养的方法。方法:取1～10 d SD大鼠脑皮质经胰蛋白酶消化后,通过不同孔径的筛网过滤,再用胶原酶2次消化获得的微血管内皮细胞进行培养,采用相差显微镜形态学观察及Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定。结果:1～2 d细胞呈区域性单层贴壁生长,7～9 d呈典型的铺路卵石样征象,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测内皮细胞表达阳性,可见细胞的胞浆及核周呈棕黄色,胞核呈阴性,阳性细胞占绝大部分。结论:采用2次消化、2次过滤技术可以成功分离培养出较理想的大鼠脑微血管内皮细胞。     

两步酶法在小鼠睾丸支持细胞分离与培养过程中的研究

目的:探讨两步酶法分离小鼠睾丸支持细胞以及在体外培养、纯化、鉴定过程中的优越性。方法:选取7~8d雄性昆明小鼠,用胶原酶Ⅳ及胰蛋白酶两步酶法分离小鼠睾丸组织获得支持细胞,利用细胞差速贴壁特性纯化支持细胞,利用倒置显微镜、PI染色、特异性抗体标记的方法从多个维度鉴定小鼠睾丸支持细胞。结果:培养72 h后支持细胞呈片状平铺于培养皿底层,相互接触,连接成片。用波形蛋白特异性鉴定证实本实验分离所获得的小鼠睾丸支持细胞。经过PI染色提示这些支持细胞为具有活性的支持细胞。结论:本研究提示两部酶法是一种简便且高效的分离小鼠睾丸支持细胞的有效方法,值得推广。     

猪的冠状动脉内皮细胞体外培养方法

目的:建立实验小型猪的冠状动脉内皮细胞体外培养方法。方法:冠状动脉血管块短暂酶消化后采用植块法进行培养。结果:植块培养2日细胞从植块中移出;培养6日植块周围细胞呈铺路石样特征,传代/纯化一次后5日细胞单层贴壁生长,融合成片。细胞因子Ⅷ免疫荧光检测内皮细胞表达阳性,纯度100%。结论:成功建立猪冠状动脉内皮细胞体外培养方法,此方法操作简单、快速,得到细胞纯度高。     

人骨髓间充质干细胞体外向血管内皮细胞诱导分化的研究

目的体外研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）分化为血管内皮细胞的潜能，探讨作为血管组织工程种子细胞来源的应用前景。方法用人淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出成人骨髓单个核细胞，经贴壁法获取MSCs，体外扩增培养并进行鉴定。在内皮细胞生长培养基（I）MEM）中以血管内皮细抱上长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）定向诱导hMSCs向血管内皮细胞分化，观察细胞形怨学变化，扩增培养后经流式细胞仪进行细胞袁型鉴定和超微结构观察。结果形态学观察显示，培养的人骨髓间充质干细胞经bFGF、VEGF诱导后的hMSCs可见类似内皮细胞样改变，向血管内皮诱导分化24d后，经流式细胞仪检测，CD34表达转为阳性．而CD106、HLA—DR表达明显上调。结论在血管内皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子诱导作用下，hMSCs具有向内皮细胞分化潜能．产生功毙性内皮细胞。     

骨髓源性血管内皮祖细胞体外分离、培养及分化为内皮细胞的研究

目的探讨骨髓源性血管内皮祖细胞(EPCs)在体外分离、培养、诱导分化及鉴定的方法。方法抽取SD大鼠的骨髓细胞,离心法提取骨髓液中单个核细胞,用含有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)的培养液诱导培养EPCs,观察并记录EPCs的生长分化过程;对培养后的细胞进行免疫荧光染色,鉴定细胞表面标志物,同时,RT-PCR法检测EPCs特异性分子标志物。结果培养24 h后细胞开始贴壁,4 d后细胞呈集落样生长,细胞从集落中央向外周生长,至培养的第7天成片生长的细胞集落相互连接,10 d后细胞形态明显改变,呈现典型的"鹅卵石样"外观。贴壁细胞免疫荧光检测显示CD34、CD133、VEGFR-2、FGFR1均阳性,经RT-PCR法检测,EPCs表达的特异性分子标志物均为阳性。结论以梯度离心法获得骨髓单个核细胞经培养后,可扩增出具有典型特征的EPCs,呈贴壁增殖状态且具有分化能力,经体外诱导可分化为成熟的血管内皮细胞。     

淫羊霍苷对HCY诱导的血管内皮细胞内质网应激的影响

目的:研究淫羊藿苷(icariin,ICA)对同型半胱氨酸(homocysteinemia,HCY)诱导的血管内皮细胞内质网应激的影响,探讨ICA抗动脉粥样硬化的机制。方法:建立HCY诱导的兔血管内皮细胞损伤模型,与不同浓度的ICA共同培养48h后,TUNEL法检测细胞凋亡率;RT-PCR检测葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)基因表达;目的基因克隆、鉴定并测序。结果:荧光显微镜观察显示HCY模型组可见多数凋亡细胞,ICA组细胞未见明显凋亡形态学改变;ICA处理组细胞GRP78mRNA表达明显减少,与HCY组比较差异显著(P0.01);测序结果表明,来源于血管内皮细胞的全长648bp的基因片断与兔GRP78基因高度同源。结论:ICA拮抗HCY诱导的血管内皮细胞凋亡,减缓血管内皮细胞内质网应激可能是其作用机制之一。     

川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞长期诱导效应的研究

目的 探讨川芎嗪提取液体对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的长期诱导效应.方法 分离培养大鼠骨髓MSCs,用1.50g/L川芎嗪提取液对MSCs进行诱导,倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化,并应用免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞浆内Nestin和NSE蛋白表达.结果 川芎嗪诱导培养8h后即可见细胞形态发生变化,24 h后表现为典型的神经元细胞形态,Nestin和NSE神经细胞特异性标志物呈阳性表达,3d后诱导效果最好,6d后,有些细胞突起变长,出现分叉,并且有些细胞出现衰老死亡.结论 川芎嗪早期诱导BMSCs向神经元样细胞分化的效果较好,长期诱导的特异性不明显.但可促进细胞突起的生长,并且促进神经细胞的成熟和死亡.     

人参皂苷Rg3诱导淋巴管内皮细胞凋亡作用的研究

目的：探讨人参皂苷Rg3（20（R）-Ginsenoside Rg3）对淋巴管内皮细胞的抑制效应及凋亡诱导作用。方法：取健康猪的胸导管内皮细胞进行分离、培养;VIII因子对淋巴管内皮细胞进行鉴定。用含不同浓度人参皂苷Rg3处理淋巴管内皮细胞,采用MTT法检测药物对细胞的抑制作用,倒置显微镜观察细胞形态学改变;Hoechst 33258荧光染色检测淋巴管内皮细胞凋亡。结果：经VIII因子对培养的淋巴管细胞进行鉴定,为典型淋巴管内皮细胞。随着药物浓度的升高,作用时间的延长,人参皂苷Rg3对淋巴管内皮细胞的生长抑制率逐渐增高;在人参皂苷Rg3作用下,淋巴管内皮细胞呈凋亡改变,出现凋亡小体。结论：人参皂苷Rg3能诱导淋巴管内皮细胞凋亡,抑制淋巴管内皮细胞增殖。     

一种颈椎后纵韧带细胞的原代培养方法

目的建立颈椎后纵韧带成纤维细胞的体外培养方法。方法采用组织块培养法培养小鼠颈椎后纵韧带细胞,行HE染色,光镜及电镜观察;采用免疫细胞化学法对其进行鉴定。结果倒置相差显微镜下观察细胞呈梭形,胞质近中央处有椭圆形胞核,细胞呈放射状、漩涡状等走行形式。HE染色见细胞为长梭形,胞核为淡蓝色,胞质为粉红色。透射电镜下见胞质内有较为丰富的粗面内质网和高尔基体,线粒体呈卵圆形,常染色质丰富,异染色质靠近核膜,有核仁。免疫细胞化学鉴定表达波形蛋白,角蛋白表达为阴性。结论在体外可成功培养出颈椎后纵韧带成纤维细胞,第3-5代体外培养细胞是细胞实验的最佳选择。     

自体外周血单个核细胞对原代肝癌细胞生长的影响及芦荟多糖对其干预作用

目的 观察、探讨自体外周血单个核细胞(PBMC)对原代肝癌细胞生长的影响及芦荟多糖AP11的干预作用.方法 以手术切除肝癌组织为标本,胰酶短暂消化加吹打、单细胞悬液培养法原代培养肝癌细胞.通过倒置显微镜观察其形态学特征.于分离培养第2天,加芦荟多糖AP11、芦荟多糖AP11干预及未干预的PBMC于癌细胞中,倒置显微镜观察其对癌细胞形态的影响,MTT法观察其对癌细胞生长的影响.结果 采用胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液原代培养的方法,可成功获取原代肝癌细胞;与空白对照组相比,芦荟多糖组癌细胞在形态上无明显差别,MTT实验结果表明其对癌细胞的生长无明显影响;与空白对照组相比,芦荟多糖AP11干预与未干预PBMC组癌细胞形态均有较大变化,MTT实验结果表明,其对癌细胞的生长有显著抑制作用.结论 芦荟多糖AP11无直接体外抗肿瘤活性,其抗肿瘤活性可能是通过与PBMC的相互作用,通过调节机体的免疫系统而达到的.     

SD新生大鼠c-kit阳性心肌细胞的分离纯化

目的:建立新生SD大鼠c-kit阳性细胞分离纯化及传代的培养方法。方法:取出生24h之内新生SD大鼠心尖部组织,用PBS液洗去心尖部的血液,将其剪碎成lmm3以下的组织块培养,培养48h后,0.5%Trypsin-EDTA消化,用免疫磁珠分选c-kit阳性的心肌细胞,继续培养传代。用倒置显微镜观察c-kit阳性心肌细胞,用免疫细胞化学法检测心肌组织特异性cTnT及Desmin蛋白。结果:用心脏组织培养法成功得到了体外搏动的原代心肌细胞;用免疫磁珠分选了c-kit阳性心肌细胞,倒置显微镜下观察到c-kit阳性心肌细胞具有传代增殖的特性;同时,检测了c-kit阳性心肌细胞胞质cTnT及Desmin结合蛋白的阳性表达。结论:采用改良后的培养方法获得了c-kit阳性心肌细胞,该细胞具有心肌干细胞的蛋白表达特性,并具有一定的传代增殖能力。     

人骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的：探讨一种优化的骨髓问充质干细胞（Bonemarrow stromal stem cells,BMSCs）获取、分离、培养、鉴定的方法,为进一步骨组织工程实验研究奠定基础。方法：抽取健康自愿者骨髓,采用密度梯度离心法分离贴壁培养BMSCs,倒置显微镜观察细胞形态,结合流式细胞技术来间接鉴定BMSCs。结果：首次换液时间为5—6d,20d左右细胞逐渐汇集可以进行传代,获得纯化的人的BMSCs。结论：采用密度梯度离心法分离贴壁培养的方法能够分离纯化的人BMSCs,9代以前生长迅速,形态稳定,可传至11代,可以作为后续骨组织工程实验种子细胞。     

熊胆冻干粉针剂对缺氧-再复氧损伤血管内皮细胞的保护作用

目的探讨熊胆冻干粉针剂对缺氧-再复氧损伤的血管内皮细胞的保护作用及抗动脉粥样硬化机制。方法采用脐静脉血管内皮细胞(hum an umb ilical ve in endothelial cell,HUVEC)体外原代培养方法。通过倒置相差显微镜观察和比较,各组内皮细胞形态,用MTT法检测吸光度值,利用比色法测定细胞上清夜中的丙二醛(m alond ialdehyde,MDA)和一氧化氮(n itric oxide,NO)含量。结果MTT法结果显示:正常组、熊胆组与缺氧-再复氧组比较有显著差异(P<0.01)。缺氧-再复氧组的MDA含量增高,而NO含量降低,正常组和熊胆组中检测结果相反。结论熊胆冻干粉针剂对缺氧-再复氧损伤的血管内皮细胞有保护作用。     

复方丹参注射液对受损伤的血管内皮细胞形态结构的影响

目的探讨复方丹参注射液对氧化所致损伤的血管内皮细胞的保护作用。方法采用脐静脉血管内皮细胞(hum anumb ilical ve in cells),用倒置相差显微镜和扫描电镜观察各组内皮细胞(endothelial cell,EC)的形态学特点。分光光度计测定细胞上清液中丙二醛的含量。结果扫描电镜观察显示过氧化氢组EC皱缩变小,细胞表面干裂,表面微绒毛减少甚至消失,细胞间隙增宽,而经丹参预处理过的过氧化氢组细胞形态结构则明显改善。MDA含量测定表明过氧化氢组的MDA含量明显增高。相反,正常组和丹参组中MDA含量减少(P<0.01)。结论复方丹参注射液通过其抗氧化作用,对氧化所引起的受损血管EC有保护作用。     

犬脂肪基质干细胞复合珊瑚支架材料裸鼠皮下成骨的实验研究

目的:探讨犬脂肪基质干细胞(adipose derived stromal cells,ADSCs)作为种子细胞复合珊瑚支架材料在裸鼠皮下成骨的可行性。方法:体外分离培养、成骨诱导、扩增犬ADSCs,将第2代细胞接种于珊瑚支架上,形成细胞-材料复合物。倒置相差显微镜观测细胞形态,DIO染色后激光共聚焦荧光显微镜观察细胞在材料上的生长状况,细胞材料复合物植于8只裸鼠右侧背部皮下作为实验组,在左侧对称部位植入单纯珊瑚支架作为对照组。分别在移植后第4、8周取材,HE染色,进行组织学及组织形态计量学分析。结果:ADSCs倒置相差显微镜下为成纤维细胞样梭形外观,与材料共培养后共聚焦显微镜可见细胞贴附于材料表面及孔隙内生长。HE染色显示,4周时实验组可见新生骨组织形成;8周时实验组新生骨组织形成增加。图像分析显示,两个时间点实验组成骨量与对照组相比差异皆有统计学意义(P0.05);实验组第8周成骨量高于第4周,差异也具有统计学意义(P0.05)。结论:犬ADSCs作为种子细胞复合珊瑚支架材料可以在裸鼠皮下形成骨样组织。     

丹参酮ⅡA磺酸钠对肢体缺血再灌注后大鼠肺组织超微结构的影响

目的探讨丹参酮ⅡA磺酸钠对大鼠肢体缺血再灌注后肺组织超微结构的影响。方法将60只雄性SD大鼠随机分成假手术组(A组)、单纯缺血再灌注组(B组)和丹参酮ⅡA磺酸钠组(C组)。采用常规法建立大鼠肢体缺血再灌注损伤模型。利用光镜和电镜观察肺组织形态学改变和超微结构改变,利用比色法测定肺组织中MDA、SOD、XOD水平,并进行比较。结果与B组相比,C组肺血管扩张、炎性细胞聚集、组织损伤明显减轻;肺组织MDA、XOD活力明显降低,SOD活力升高。结论丹参酮对肢体缺血再灌注后肺组织结构具有明显的保护作用。