银杏抗菌肽蛋白基因原核表达及其重组蛋白的体内外抑菌作用研究

目的:获取银杏抗菌肽(GBA)重组蛋白,并考察其体内外抗菌活性,为解决病原菌耐药问题、规模化生产植物源性新型抗菌剂提供实验基础。方法:根据Genebank中公布的GBA基因序列(FJ865399),利用基因技术构建重组质粒pET32a(+)-GBA,再以大肠杆菌原核表达获取重组蛋白,并采用凝胶电泳和Western blotting法对所得蛋白进行纯化及鉴定。采用纸片扩散法考察所获重组蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌的药物敏感度;采用肉汤稀释法测定重组蛋白最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC);考察重组蛋白对金黄色葡萄球菌感染模型小鼠的保护作用。结果:成功表达并纯化获得目标重组蛋白(大小约32 kDa)。该重组蛋白对金黄色葡萄球菌中度敏感,对其他3种细菌低度敏感;对金黄色葡萄球菌的MIC为(50.00±5.00)mg/mL、MBC为(138.33±12.58)mg/mL,MIC显著高于其他3种细菌(P<0.05)。高剂量重组蛋白(8.0 g/kg)能显著降低金黄色葡萄球菌导致的小鼠死亡率(P<0.05),对小鼠的保护效果与阳性药物青霉素接近。结论:所获重组蛋白对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显,对大肠杆菌和绿脓杆菌有一定的抑制作用,对鼠伤寒沙门氏菌抑制作用较弱;该蛋白高剂量给药对金黄色葡萄球菌感染小鼠具有明显的保护作用。     

菌丝霉素的高效表达、纯化及活性

将来自腐生子囊菌中的菌丝霉素成熟肽基因经大肠杆菌密码子优化后,克隆到pET32a(+)载体中,构建了含His-tag标签和TEV酶识别位点的菌丝霉素表达质粒pYG330,使含菌丝霉素的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高效表达.建立了菌丝霉素的纯化路线,将融合蛋白进行TEV酶切后脱盐再进行亲和色谱分离,收集目的蛋白冻干浓缩,通过高效液相色谱进一步纯化获得纯度72％的目的多肽.纯化所得菌丝霉素对临床耐药金黄色葡萄球菌M-2和枯草芽孢杆菌有明显的抑菌活性.     

hG—CSF大肠杆菌分泌表达系统的构建

构建了hG-CSF大肠杆菌融合分泌表达载体pSEGF,利用该系统可直接将hG-CSF融合蛋白分泌到培养基中,重组蛋白具有高度的可溶性,并具生物学活性。在该系统中,外源蛋白N端融合了金黄色葡萄球菌蛋白AIgG结合区,由lac启动子与金黄色葡萄球菌蛋白A启动子控制表达,信号肽选用金黄色葡萄球菌蛋白A的信号肽序列。在融合头与目的蛋之间设计了蛋白酶识别位点,可用Factor Xa蛋白酶特异切割,得到与天然氨基酸序列完全相同的重组hG-CSF蛋白。该系统的构建成功,为简化下游纯化工艺,提高收率带来可能。     

石榴皮鞣质的抗菌活性及其对金黄色葡萄球菌的抗菌机制

目的:研究石榴皮鞣质(tannins from Pericarpium Granati,TPG)的抗菌活性及对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)的抗菌机制。方法:实验采用牛津杯法和试管二倍稀释法研究了石榴皮鞣质对5种不同细菌的抗菌活性,并以药物敏感性最强的金黄色葡萄球菌为供试菌,通过测定菌体胞外碱性磷酸酶(AKP)含量、胞外钾离子(K⁺)浓度、大分子核酸的吸光度值、胞内和胞外总三磷酸腺苷酶(T-ATPase)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和透射电镜(TEM)观察,研究了石榴皮鞣质对金黄色葡萄球菌的抗菌机制。结果:石榴皮鞣质对革兰阳性菌具有较强的抗菌活性,而对革兰阴性菌抗菌活性较弱,经药物作用后金黄色葡萄球菌菌体胞外AKP、K⁺和核酸含量与对照组相比均升高,胞内ATP酶浓度显著降低。SDS-PAGE分析表明石榴皮鞣质能够抑制菌体蛋白质合成,尤其是大相对分子质量蛋白。透射电镜表明菌体细胞膜结构和完整性被破坏。结论:石榴皮鞣质对革兰阳性菌具有较强的抗菌活性,能够显著影响金黄色葡萄球菌的细胞壁和细胞膜结构,且对菌体内蛋白合成具有一定的抑制作用。     

葡萄球菌蛋白A(SPA)阳性菌株的筛选及其在肠道杆菌鉴定上的应用

<正> 葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,简称SPA)系大多数金黄色葡萄球菌细胞壁的成分之一,能与人及多种哺乳动物血清中IgG的Fc段(IgG3例外)发生非特异性结合,在琼脂凝胶中呈现沉淀线,但并不影响Fab段的活性。故可用已知抗体标记SPA阳性菌株来检测未     

金黄色葡萄球菌A蛋白的制备和鉴定

许多株金黄色葡萄球菌的细胞壁均含有一种 A蛋白,称为:金黄色葡萄球菌 A 蛋白(以下简称SPA)。它能与人和多种哺乳动物 IgG 的 Fc 段结合。由于 SPA 具有这一重要特性,已广泛应用于     

乳凝法检定药品中金黄色葡萄球菌

乳凝法是利用金黄色葡萄球菌具有血浆凝固酶和A蛋白(SPA)皆阳性的特点在乳胶表面吸附纤维蛋白原和人血清IgG,被吸附     

葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化

目的构建表达金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)抗体结合区基因SPA-ZZ的pET-32a-ZZ表达载体,在大肠杆菌BL21中进行高效表达并初步纯化。方法用PCR从pEZZ18中克隆SPA抗体结合区基因ZZ,构建重组表达质粒pET32-ZZ,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,IPTG诱导表达,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE),并用Q-Sephrose Fast Flow柱进行初步纯化。结果得到了高效表达SPA-ZZ的pET32-ZZ表达载体,表达产物经SDS-PAGE检测相对分子质量为41 000,初步纯化后可得到较纯的表达蛋白。结论SPA抗体结合区蛋白ZZ能在大肠杆菌中高效表达,为SPA-ZZ的应用奠定了一定的基础。     

重组人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达的研究

目的构建含有人组织因子(h TF)基因的毕赤酵母高效表达系统,实现胞外高效分泌表达。方法全基因合成h TF胞外区序列,PCR扩增该基因片段,经Xho I和Xba I双酶切后,和表达载体p GAPZa A相连,并电转化毕赤酵母SMD1168H。在YPD培养基中进行表达,取培养基上清进行SDS-PAGE检测,并利用Western进行确证,通过BCA法检测胞外蛋白表达量。结果在毕赤酵母中成功表达人组织因子,通过Western确证目的蛋白分子量大小正确,BCA法检测摇瓶表达胞外总蛋白达1 g/L,Bandscan软件分析目的蛋白占胞外总蛋白80%以上。结论本研究实现了截短型人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达,获得了具有与完整因子相同凝血活性的截短型组织因子。     

植物药复方MYD-20抗金黄色葡萄球菌的作用及机制研究

目的 研究植物药复方MYD-20及其软膏剂对金黄色葡萄球菌的抑制作用及初步作用机制。方法 采用肉汤稀释法测定复方MYD-20对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Methicillin-resistant S.aureus(MRSA)临床菌株的最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC);通过测定药物处理后菌液的碱性磷酸酶(AKP)活性、胞外大分子浓度变化以及扫描电子显微镜的观察结果确定复方MYD-20的抑菌作用机制;建立小鼠烫伤感染模型,探究MYD-20软膏剂的药效作用。结果 MYD-20对金黄色葡萄球菌和MRSA表现出强抑菌活性,对金黄色葡萄球菌、MRSA的MIC和MBC均分别为1.0%、2.0%。经MYD-20处理后,菌液中AKP的活性、胞外大分子的含量均显著上升,结合扫描电子显微镜的观察结果,发现细菌的表面结构受到破坏。MYD-20软膏剂对皮肤深Ⅱ度烫伤感染的模型小鼠显示出显著的创口愈合作用;并降低了创口处炎症因子的表达。结论 复方MYD-20对金黄色葡萄球菌和MRSA具有较强的抗菌作用,其作用机制与破坏细菌细胞膜、细胞壁的通透性...     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

不相容双质粒共表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB及其辅因子合成酶基因caiE

基因caiB和基因caiE分别编码肉碱脱水酶及其辅因子合成酶，携带这两个基因的重组菌可以共表达两个外源蛋白，得到高活性肉碱脱水酶。分别构建这两个基因的表达质粒pET28caiB和pET22caiE，利用双抗生素筛选法，获得能稳定遗传的双质粒转化子。经IPTG诱导，两个基因共表达，表达量分别占菌体总蛋白的39％和20％，共转化菌的酶活力比pET28caiB单转化菌提高了2．3倍，并由此建立了不相容质粒共表达外源基因的新方法。     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

一种新穿膜肽的构建、表达及其活性检测

通过对穿膜肽TAT-PTD构效关系的分析和结构改造，构建能有效进入血脑屏障且低毒的新穿膜肽。该研究用分子克隆技术构建出表达型载体pET28a—T1-GFP，重组质粒在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白His-T1-GFP，经组氨酸亲和层析纯化后，用荧光显微镜和免疫组化的方法来检测His—T1-GFP在活体动物小白鼠体内的跨膜递送作用。经测序证实成功构建了表达型载体pET28a—T1-GFP，融合蛋白His—T1-GFP在大肠杆菌EcoliB L21（DE3）中表达率为20％。经组氨酸亲和纯化，得到纯度达85％的融合蛋白。SDS-PAGE和Western Blotting显示纯化蛋白为His-T1-GFP，动物实验表明融合蛋白His—T1-GFP能够有效跨过血脑屏障，主要分布在大脑皮层和海马回。该研究成功地构建了-种新的穿膜肽-T1，为其携带有生物活性的大分子物质到达脑部进行蛋白治疗奠定了基础。     

基因工程法生产L-5-甲基四氢叶酸的研究

目的在E.coli BL21(DE3)中表达5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR),并检测MTHFR的表达情况及L-5-甲基四氢叶酸的增加量。方法采用PCR法获得MTHFR基因(metF)全长DNA,分别在其5'端和3'端加上BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。经BamHⅠ和SacⅠ双酶切后,连接到经同样双酶切的表达载体pET-28a(+)中,经限制性酶切、菌落PCR和测序验证正确后,转化至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测MTHFR表达量,HPLC检测L-5-甲基四氢叶酸量。结果经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pET28a-MTHFR构建成功,表达产物相对分子质量约为33 000,与MTHFR大小相符,工程菌的L-5-甲基四氢叶酸的产量显著增加。结论通过将MTHFR的基因导入L-5-甲基四氢叶酸产生菌能够提高L-5-甲基四氢叶酸产量。     

抗AFP重链可变区单域抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定

目的 构建抗甲胎蛋白(AFP)重链可变区(VH)单域抗体融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达,并初步鉴定表达产物的活性.方法 从已构建的抗AFP单链抗体(ScFv)的载体中,经PCR扩增出VH 单域抗体基因,再克隆到融合蛋白表达载体pET32a( )中进行表达;用SDS-PAGE及Western-blot鉴定表达产物;并通过竞争抑制ELISA分析TrxA-VH融合蛋白的结合活性;细胞免疫组化染色分析其内化及结合情况.结果 VH 单域抗体基因全长339 bp,将其克隆到pET32a( )中,转化大肠杆菌可获得高效表达,Western-blot证实在相应分子质量处,有TrxA-VH融合蛋白的显色条带.经初步纯化和复性后,获得抗AFP的VH单域抗体融合蛋白.竞争抑制ELISA及细胞免疫组化证明,表达产物具有与AFP特异结合的活性.结论 成功构建了抗AFP的VH单域抗体融合蛋白,为临床的应用研究奠定了基础.     

蝎毒活性肽BmK AS的基因克隆与表达

目的克隆东亚钳蝎活性肽BmKAS的基因,在大肠杆菌中进行表达。方法利用PCR技术从蝎尾cDNA pool中扩增BmKAS基因,通过基因工程方法构建表达载体pET28a-BmKAS,在E.coli中进行表达,表达产物为包含体。采用分步稀释复性法对表达产物进行体外变复性。结果BmKAS以包含体的形式得到表达,表达量的质量约占菌体总蛋白质量的31%。表达产物复性后,通过离子交换柱层析进一步纯化,达到了电泳纯,收率为1.6 mg.L-1。结论首次对具有多种药理活性的蝎毒活性肽BmKAS进行了表达,并对表达产物进行体外变复性研究,获得了毫克级的收率,满足了深入研究需要。     

丹参柯巴基焦磷酸合酶基因的优化表达、纯化及抗体制备

用含丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase，SmCPS)基因的重组质粒pET32CPS转化大肠杆菌BL21trxB (DE3)进行诱导表达，SDS-PAGE结果表明SmCPS基因在大肠杆菌中获得了表达；对影响可溶性表达的4个因素，即诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A₆₀₀)和诱导时间进行了优化。结果发现在宿主菌A₆₀₀达到1.0时加入0.4 mmol·L^-1 IPTG，在20 ℃诱导培养8 h表达的可溶性蛋白量最高，约占细胞总蛋白的35.6%。用Ni²⁺亲和色谱法纯化表达产物，纯化蛋白产率达到12.3 mg·L^-1。将纯化蛋白免疫制备兔源SmCPS抗血清，ELISA测定效价为1∶24 300，且经Western blotting鉴定该抗体可特异性识别SmCPS抗原，获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体，为进一步从蛋白水平研究SmCPS表达与丹参酮类有效成分生物合成相关性提供了物质基础。     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

霍乱毒素B亚单位与p277融合基因在大肠杆菌中表达及免疫分析

为了增强多肽表位的免疫原性,构建了霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)和p277的融合基因CTB-p277,将该融合基因克隆到pET28a( )中,获得原核表达载体pET28a-CTB-p277;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经2%的乳糖诱导5 h后的表达产物用12%的SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,融合蛋白占全菌蛋白约40%,且主要以包含体的形式存在。包含体经洗涤、裂解,用DEAE纤维素离子交换纯化,可以获得99.1%的重组蛋白。重组蛋白的包含体经复性后,在体外可以自组装成五聚体。重组蛋白免疫KK-Ay小鼠后,ELISA的分析表明可以产生抗p277的抗体。血糖和体重的测定结果显示,给药组小鼠的血糖有明显的降低,体重也有相应的减轻。同时GM1-ELISA的检测表明,CTB-p277在体外可以和神经节苷脂GM1(Monosialoganglioside)特异结合,具有生物活性。