三羟异黄酮对肝癌细胞HepG2的ADAM17表达的调节

目的:观察三羟异黄酮(genistein)对肝癌细胞HepG2的生长增殖及ADAM17基因表达的影响. 方法: 培养肝癌细胞HepG2,加入三羟异黄酮特异性阻断酪氨酸蛋白激酶(TPK),MTT法观察genistein对HepG2细胞生长增殖的影响,PCR分析ADAM17基因水平变化,免疫组化法观察细胞水平ADAM17蛋白表达的变化. 结果:经过genistein处理的肝癌细胞HepG2生长增殖受到明显抑制,在48、72和96小时有统计学意义(P＜0.01);而且ADAM17的基因表达和蛋白表达都受到明显抑制(P＜0.05),抑制程度呈现时间依赖性关系.结论: 三羟异黄酮可以通过抑制TPK通路抑制肝癌细胞HepG2的生长增殖,并且抑制ADAM17基因和蛋白表达水平,从而间接调节HepG2细胞生长信号的传递.     

siRNA靶向抑制CDCA5基因表达对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制细胞分裂周期相关蛋白5（CDCA5）基因表达对人肝癌HepG2细胞株增殖及凋亡的影响。方法 优化siRNA转染条件,将3条靶向抑制CDCA5基因的siRNA载体片段（序列1、2和3）分别高效转染人肝癌HepG2细胞（A、B和C组）,并设阴性对照组（NC组）及空白组。免疫印迹法检测转染72h各组CDCA5蛋白的表达水平。CCK-8法检测转染24、48、72、96、120h各组细胞的增殖能力,Annexin V-FITC／PI 双标记流式细胞术检测各组转染48h的凋亡情况。结果 A、B和C组的CDCA5蛋白水平均低于NC组和空白组（P＜0.05）,其中B组的表达率最低,抑制率最高,达89.3％,故选择序列2进行后续实验。自转染48h起,B组的相对增殖率均低于NC组和空白组（P＜0.05）;B组转染72h的相对增殖率为（66.58±2.58）％,均低于其他观察时间点（P＜0.05）。B组转染48h的早期和晚期凋亡率分别为（17.43±2.31）％和（22.37±2.21）％,均高于NC组和空白组（P＜0.05）。 结论 通过siRNA能够降低HepG2细胞的CDCA5表达水平,有效抑制HepG2细胞的增殖并促进其凋亡。     

三羟异黄酮对肝癌细胞HepG2的ADAM17表达的调节

目的：观察三羟异黄酮（genistein）对肝癌细胞HepG2的生长增殖及ADAM17基因表达的影响。方法：培养肝癌细胞HepG2,加入三羟异黄酮特异性阻断酪氨酸蛋白激酶（TPK）,MTT法观察genistein对HepG2细胞生长增殖的影响,PCR分析ADAM17基因水平变化,免疫组化法观察细胞水平ADAM17蛋白表达的变化。结果：经过genistein处理的肝癌细胞HepG2生长增殖受到明显抑制,在48、72和96小时有统计学意义（P〈0．01）;而且ADAM17的基因表达和蛋白表达都受到明显抑制（P〈0．05）,抑制程度呈现时间依赖性关系。结论：三羟异黄酮可以通过抑制TPK通路抑制肝癌细胞HepG2的生长增殖,并且抑制ADAM17基因和蛋白表达水平,从而间接调节HepG2细胞生长信号的传递。     

干扰NBS1表达抑制肝癌HepG2细胞增殖并促进凋亡

目的:探讨干扰NBS1基因表达对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响。方法:应用Lipofectamine 2000将NBS1特异性小干扰RNA（siNBS1）转染至肝癌细胞HepG2中,以空载脂质体作为对照组。采用RT-PCR及Western blot法检测NBS1基因表达情况,采用CCK-8法检测转染质粒后siNBS1对HepG2细胞增殖能力的影响,采用流式细胞术检测siNBS1对HepG2细胞凋亡的影响。结果:不同浓度siNBS1（10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L）均能抑制HepG2细胞中的NBS1基因在mRNA水平上的表达（P＜0.05或P＜0.01）。最高浓度siNBS1（50 nmol/L）能抑制NSB1蛋白产物的表达水平（P＜0.05）。CCK-8实验显示,转染不同浓度siNBS1的HepG2细胞与对照组相比,细胞活力明显减弱（P＜0.05或P＜0.01）,转染48 h后增殖率下降最为显著;流式细胞检测结果显示,细胞凋亡的比率在转染后明显升高（P＜0.05或P＜0.01）,并随浓度增加而更为显著。结论:干扰NBS1基因的表达可以明显抑制HepG2细胞的增殖,并促进癌细胞凋亡。     

siRNA下调星形细胞上调基因1表达对胃癌SGC-7901细胞增殖和细胞周期的影响

目的 探讨星形细胞上调基因1(AEG-1)表达水平对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响,研究其可能的分子机制.方法 以siRNA和AEG-1 siRNA转染胃癌SGC-7901细胞后48 h,将细胞分为未转染组、siRNA对照组和AEG-1 siRNA转染组.应用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染后SGC-7901细胞中AEG-1 mRNA和蛋白的表达,应用CCK-8检测细胞增殖能力,应用流式细胞术检测转染前后细胞周期的分布,应用Western blot检测细胞增殖和细胞周期相关蛋白表达的变化.结果 与未转染组和siRNA对照组比较,AEG-1 siRNA转染组胃癌细胞中AEG-1蛋白的表达水平下降(P＜0.05).与未转染组和siRNA对照组比较,AEG-1 siRNA转染组AEG-1 mRNA表达水平下降(P＜0.05).与未转染组和siRNA对照组比较,AEG-1 siRNA转染组转染AEG-1后的24h及其后续的各个时间点,SGC-7901细胞的增殖均明显受到抑制(均P＜0.05).AEG-1 siRNA转染组中G0/G1期细胞数比例[(61.26±1.25)％]显著高于未转染组[(46.17±1.91)％]和siRNA对照组[(46.46±1.96)％],差异均有统计学意义(均P ＜0.05).AEG-1表达水平下降可使cdk2和cyclinD1表达水平下降以及p21表达水平升高.结论 AEG-1表达水平下降抑制胃癌细胞的增殖和改变细胞周期分布,可能与cdk2、cyclin D1和p21蛋白的表达密切相关.     

Cathepsin B表达对肝癌细胞系HepG2转移潜能影响的观察

目的:探讨小干扰RNA降低组织蛋白酶B(Cat B)基因表达对HepG2细胞增殖、运动及侵袭能力的影响。方法:将肝癌HepG2细胞分为Cat B siRNA干扰组、阴性对照siRNA干扰组(阴性对照组)、空脂质体组和空白对照组。脂质体转染法将Cat B siRNA转染入HepG2细胞;半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染后48hCat B的表达变化;收集转染后48h的细胞,再分别以CCK-8法、划痕实验和Transwell侵袭实验检测各组细胞增殖、运动及侵袭能力的变化。结果:半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测Cat B mRNA和蛋白水平表达变化,Cat B siRNA干扰组较其余各组均明显降低,差异有统计学意义,P<0.05。CCK-8法测细胞生长曲线示,将转染后48h的细胞种入96孔板后12h,Cat B siRNA干扰组增殖能力较对照组明显降低,差异有统计学意义,P<0.05。划痕实验中,Cat B siRNA干扰组细胞迁移距离较对照组明显降低,差异有统计学意义,P<0.05。Transwell侵袭实验中,Cat B siRNA干扰组穿膜细胞数较对照组明显降低,差异有统计学意义,P<0.05。结论:特异性干扰Cat B基因表达可抑制HepG2细胞的增殖、运动及侵袭能力。     

阻断肝再生增强因子的表达对人肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用

背景与目的:前期研究中已发现人肝再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,hALR)在肝癌细胞中呈高表达,在正常肝细胞中几乎不表达,并在体外能刺激肝癌细胞株增殖,而对正常肝细胞无影响。本研究通过运用hALR的siRNA和hALR单克隆抗体阻断人肝癌细胞株HepG2表达,探讨hALR对细胞增殖的影响。方法:设计、构建siRNA表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B。将构建的pSIALR-A和pSIALR-B分别转染HepG2细胞。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,以计算转染效率。转染48h后,免疫细胞化学及RT-PCR法检测HepG2细胞中hALR的表达。用3H-TdR掺入法检测hALR的siRNA和特异性单克隆抗体对HepG2细胞增殖的影响。结果:HepG2细胞中有hALR的表达。成功构建了针对hALR基因编码区的siRNA表达质粒pSIALR-A。转染入细胞后发现,pSIALR-A能明显抑制hALR的表达(mRNA的表达量减少83%),而随机序列的siRNA却无此作用。hALR的siRNA在体外能显著抑制人肝癌细胞株HepG2增殖,分别转染质粒pSIALR-A和pSIALR-B后HepG2细胞的cpm值为67687±6548和104807±5713(P<0.05)。抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后,可部分抑制肿瘤细胞自主性生长(P<0.05)。结论:HepG2细胞高表达hALR;针对hALR的siRNA能显著、特异性地抑制hALR表达,进而抑制HepG2细胞的生长。抗hALR单克隆抗体也能部分抑制HepG2细胞自主性生长。     

沉默锌指蛋白217基因对食管鳞癌EC9706细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨锌指蛋白217基因(ZNF217)在食管鳞癌侵袭转移中的作用.方法 合成ZENF217基因的siRNA序列并转染对数生长期食管鳞癌EC9706细胞.设置转染无义序列siRNA和未转染EC9706细胞为阴性对照和空白对照.半定量RT-PCR和Western blot方法分别检测转染48 h后3组细胞ZNF217 mRNA和蛋白的表达变化;侵袭小室检测3组细胞穿膜细胞数变化;MTT法分析3组细胞增殖能力的变化.结果 与空白对照组和阴性对照组比较,转染ZNF217 siRNA组EC9706细胞ZNF217 mRNA和蛋白表达均显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05);转染ZNF217 siRNA组EC9706细胞穿膜细胞数显著下降,差异有统计学意义(P ＜0.05);ZNF217 siRNA能明显抑制EC9706细胞体外增殖能力(P＜0.05).结论 ZNF217基因表达下降能显著抑制EC9706细胞体外侵袭力和增殖能力,ZNF217基因有望成为食管癌基因治疗的有效靶点.     

靶向抑制COX-2基因对胃癌细胞BGC823凋亡及药物敏感性的影响

目的:研究siRNA靶向抑制环氧合酶-2(COX-2)基因后对胃癌细胞BGC823增殖、凋亡及药物敏感性的影响.方法:将COX-2 siRNA(siRNA-COX-2组)及negative control siRNA(siRNA-control组)序列转入细胞BGC823中,检测细胞增殖能力,观察多西紫杉醇(docetaxel艾素)、奥沙利铂(L-OHP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)的药物敏感性变化,及转染前后BGC823细胞COX-2、β-catenin、Bcl-2 mRNA基因和蛋白的表达.结果:siRNA-COX-2组细胞在转染后第四天开始增殖能力下降,与siRNA-control组差异存在明显统计学意义(P＜0.05),而siRNA-control组细胞于BGC823组增殖能力差异无明显统计学意义(P＞0.05).MTT法检测转染后胃癌细胞对艾素、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶的IC50较转染前药物敏感性明显增加.流式细胞术检测转染前后胃癌细胞凋亡率为(3.08％±0.27％vs 16.14％ ±1.89％,P＜0.05),转染后凋亡明显增加(P＜0.05).qRT-PCR法检测发现转染后COX-2、β-catenin、Bcl-2 mRNA基因的表达明显下降,Westernblot检测发现,转染后48小时COX-2蛋白表达达到最低,转染后48小时β-catenin、Bcl-2蛋白表达明显下降(P＜0.05).结论:通过下调COX-2基因的表达,可有效抑制WNT信号通路的激活,同时有效降低Bcl-2基因的表达.抑制COX-2基因后可有效降低胃癌细胞BGC823的细胞增殖能力,可有效提高对艾素、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶的药物敏感性,有效促进细胞凋亡.     

沉默S100A4基因对人膀胱癌T-24细胞生物学特性的影响

目的:探讨应用siRNA 技术沉默S100A4基因表达后,对人膀胱癌细胞系T-24增殖、凋亡及细胞侵袭能力的影响。方法:设计并合成S100A4 基因特异性的siRNA 序列,转染人膀胱癌细胞系T-24,48h后应用RT-PCR 和Western blot法检测在mRNA 和蛋白水平siRNA 对S100A4的影响,MTT 法检测T-24细胞增殖能力,流式细胞术检测转染S100A4 siRNA 后T-24细胞凋亡率,Transwell 法观察siRNA 抑制S100A4 后对人膀胱癌细胞系侵袭能力的影响。结果:与空白对照组、阴性对照组相比,S100A4 siRNA转染组T-24细胞的S100A4基因和蛋白表达降低(P＜0.05)。MTT法检测发现S100A4 siRNA转染组细胞增殖率明显下降（P＜0.01）;流式细胞术检测siRNA转染组细胞凋亡率高于其他各组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;Transwell小室实验检测发现T-24细胞侵袭能力明显下降（P＜0.05）。结论:膀胱癌细胞中S100A4 表达与癌细胞侵袭、增殖和凋亡能力有关。S100A4 siRNA 能够抑制T-24细胞S100A4的表达,进而抑制细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡。S100A4基因和蛋白表达与膀胱癌的生物学特性密切相关,可能成为预测其发生转移和复发,以期指导临床治疗的重要指标。     

小分子RNA干扰Notch1基因对肾癌Caki-1细胞增殖的影响

目的：探讨Notch1在肾透明细胞癌株中的表达,采用短片段RNA（small interferhtg RNA,siRNA）干扰技术沉默肾透明细胞癌中Notch1的表达,并观察其对Caki-1增殖的影响。方法：体外培养人正常肾小管上皮细胞HK-2及人肾癌细胞786—0和Caki-1。实时荧光定量PCR（RT—PCR）检测Notch1 mRNA的表达,蛋白印迹法检测Notch1蛋白的含量。特异性Notch1 siRNA干扰肾癌Caki-1细胞,用Lipofectamine2000转染48h后,实时荧光定量PCR和蛋白印迹法分别检测其中Notch1 mRNA、蛋白的表达变化,CCK-8与克隆形成实验检测其增殖情况。结果：Notch1在肾癌细胞株中的表达要明显高于正常肾小管上皮细胞,差异具有统计学意义（P〈0.05）。siRNA—Notch1干扰以后可以明显降低Caki-1细胞中Notch1 mRNA和蛋白的表达,差异具有统计学意义（P〈0.05）,同时检测Caki-1细胞增殖能力也随之下降（P〈0.05）。结论：Notch1在肾癌透明细胞癌中高表达,下调Notch1信号通路可以抑制肾细胞癌Caki—1的增殖,调节肾癌的生长。     

RNA干扰HOXA9基因对人类急性单核细胞白血病U937细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA（siRNA）沉默HOXA9基因对人类急性单核细胞白血病U937细胞株增殖、凋亡的影响。方法设计合成针对HOXA9的特异性siRNA寡核苷酸链,应用阳离子脂质体介导瞬时转染U937细胞。实验分为3组：实验组（脂质体转染靶向HOXA9的siRNA）、阴性对照组（脂质体转染阴性对照siRNA）和细胞对照组（仅加等量细胞及培养液）。利用反转录．聚合酶链反应法、Western blot法分别检测各组细胞HOXA9 mRNA、蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果转染靶向HOXA9的siRNA后,实验组、阴性对照组、细胞对照组mRNA相对表达水平分别为、（22.980±0．548）％、（82．371±1．517）％、（8d．637±2．252）％（P〈0．05）,蛋白相对表达水平分别为（50．377±2．773）％、（102．275±3．898）％、（107．510±3．905）％（P〈0．05）;siRNA转染后实验组U937细胞增殖明显受抑制且细胞凋亡率显著增高,24、48、72h增殖抑制率分别为（41．909±4．333）％、（54．470±3．756）％、（65．835±1．024）％,凋亡率为（26．800±2．081）％,与细胞对照组、阴性对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论靶向HOXA9的siRNA可有效沉默U937细胞HOXA9基因表达,明显抑制细胞的增殖并促进细胞凋亡,为临床白血病HOXA9基因靶向治疗提供了实验依据。     

顺铂诱导肝癌细胞凋亡过程中的Survivin表达变化及意义

目的：研究顺铂体外对肝癌细胞株HepG2 Survivin基因表达的影响。方法：培养人肝癌细胞株HepG2,加入2μg/ml的顺铂,对照组和加药后24h、48h分别以PT-PCR和免疫印迹技术检测Survivin mRNA和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率变化。结果：顺铂体外对肝癌HepG2细胞作用后,对照组和加药后24h和48h的细胞凋亡率分别是（1.74±0.36）%,（9.38±1.10）%,（16.87±2.26）%;其Survivin mRNA则分别比对照组提高了1.3倍和2.8倍;蛋白分别提高了1.2倍和3.5倍。结论：顺铂可促使肝癌细胞内Survivin的表达上调,抵抗其诱导的细胞凋亡。     

不同种类细胞株对UVB紫外线的耐受性初探

目的： 探索几种细胞株对UVB紫外线的耐受性。方法：0、20和50 mJ/cm2紫外线照射后,利用MTT、荧光素酶报告基因检测和克隆形成率实验,检测人表皮细胞HaCaT、人黑色素细胞A875、人肺腺癌细胞A549和H322、人肝癌细胞HepG2的存活及增殖能力。结果：MTT实验结果表明HaCaT、A875、A549、H322和HepG2细胞在受到20和50 mJ/cm2紫外线照射后第1天,细胞活力均显著降低(P<0.05),到照射后第3天,细胞活力仍显著低于未照射组(P<0.05)。克隆形成率实验结果表明,HaCaT、A875和HepG2细胞在照射后,细胞增殖能力受到显著抑制。荧光素酶活性检测实验结果表明,A549细胞在受到20和50 mJ/cm2紫外线照射后第5和第10天,细胞活力显著低于未照射组(P<0.05)。结论：UVB紫外线对表皮细胞、肺腺癌细胞和肝癌细胞的存活和增殖能力均产生影响,其中正常表皮细胞HaCaT细胞对UVB紫外线的耐受性大于肿瘤来源的A875、A549、H322和HepG2细胞。     

CyclinD1干扰RNA对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的作用

[目的]探讨干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2的CyclinDl基因表达以及细胞增殖、凋亡的影响。[方法]将表达CyclinDlsiRNA的重组质粒pU6-CyclinDl-siRNA导入HepG2细胞,同时设立阴性对照空载体转染组及空白对照组。倒置荧光显微镜观察G418筛选稳定转染的细胞。MTr法检测细胞生长增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR、WesternBlot方法检测CyclinDl沉默效果。[结果]与阴性对照组及空白对照组相比,转染组细胞生长速度减慢,凋亡率上升,CyclinDlmRNA和蛋白表达水平均明显下降（P均〈0．05）。[结论]RNA干扰技术可有效抑制细胞增殖,导致细胞凋亡,使CyclinDlmRNA及蛋白表达水平均明显下降。     

5-脂氧合酶抑制剂对人肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响

目的：研究5-脂氧合酶（5-lipoxygenase,5-Lox）在人肝癌细胞株HepG2中的表达,以及5-Lox抑制剂对人肝癌细胞株HepG2增殖、凋亡的影响。方法：应用免疫细胞化学染色及RT-PCR分别检测5-Lox的蛋白和mRNA在人肝癌细胞株HepG2中的表达,采用MTT法及流式细胞术检测5-Lox抑制剂齐留通（Zileuton）对人肝癌细胞株HepG2增殖、凋亡的影响。结果：5-Lox蛋白表达于肝癌细胞浆,局灶细胞核膜亦见阳性染色,RT-PCR可检测到肝癌细胞5-Lox的mRNA的表达。人肝癌细胞株HepG2给予不同浓度的齐留通处理24小时后,细胞存活率呈剂量依赖性下降;流式细胞术检测可见细胞凋亡率呈剂量依赖性升高。结论：人肝癌细胞株HepG2存在5-Lox的表达,5-Lox抑制剂齐留通可抑制人肝癌细胞株HepG2的增殖,诱导细胞凋亡。     

Sox2在肝癌中的表达及其对细胞生长增殖的作用

[目的]明确Sox2蛋白在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达,探讨Sox2分子对肝癌细胞生长增殖的作用及机制。[方法]选取临床肝癌组织标本、正常肝细胞系和多种肝癌细胞系为实验对象,从蛋白水平比较Sox2的表达水平;选取高表达Sox2的肝癌细胞系,利用RNA干涉技术降低Sox2表达,运用BrdU掺入实验、MTT实验等技术检测Sox2分子对肝癌细胞生长、增殖的影响,并检测肿瘤相关分子Wnt/β-catenin的表达水平。[结果]Sox2在肝癌组织及几种肝癌细胞中表达明显升高,以HepG2细胞系最多;MTT实验显示,与正常对照组和阴性对照组比较,从第3天开始Sox2干涉组A。值明显降低（P〈0．05）;BrdU掺人实验显示,Sox2干涉组细胞BrdU掺入率明显减少（P〈0．05）;降低Sox2表达后,Wnt/β-catenin水平明显降低。[结论]Sox2在肝癌组织及肝癌细胞中表达升高,并通过Wnt/β-catenin促进肝癌细胞生长及增殖。     

和厚朴酚对人急性白血病细胞株U937细胞增殖及凋亡的影响

 目的 探讨和厚朴酚在体外对人急性白血病细胞株U937细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测和厚朴酚对细胞增殖的影响,Annexin V/PI双染检测细胞凋亡,RT-PCR检测Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 8 和 Caspase 9基因的表达。结果 5 μg/ml的和厚朴酚作用48 h对U937细胞增殖即可表现抑制作用,10 μg/ml的和厚朴酚作用48 h对细胞的增殖抑制率高达50%以上,作用120 h可完全抑制细胞增殖。经10 μg/ml和厚朴酚处理的U937细胞凋亡率达到26.8% (P＜0.01)。10 μg/ml的和厚朴酚处理U937细胞后48 h,Bcl-2基因表达降低（对照组：0.33±0.02,实验组：0.14±0.01,P＜0.01）,Bax基因表达升高（对照组：0.1±0.01,实验组：0.87±0.08,P＜0.01）。Caspase 3（对照组：0.48±0.01,实验组：0.87±0.06,P＜0.01）、Caspase 8（对照组：0.23±0.02,实验组：0.41±0.07,P＜0.01）和Caspase 9（对照组：0.44±0.05,实验组：0.76±0.06,P＜0.01）基因表达均升高。Caspase 3活性为0.325±0.089,较对照组有显著地升高(P＜0.01.结论 和厚朴酚能明显抑制人急性白血病细胞株U937细胞增殖并引起细胞凋亡。其机制在于上调凋亡促进基因Bax的表达,下调凋亡抑制基因Bcl 2的表达,并且内源性和外源性途径均参与了凋亡过程。