Muller细胞与视网膜神经元再生

Mu ller细胞(Mu ller glia)为一种特殊的神经胶质细胞,在脊椎动物视网膜中,占细胞总数90%以上,在视网膜的发育和功能活动中有着重要的作用。最近证实,Mu ller细胞在形态和功能上均有表现视网膜祖细胞特性的潜能。当视网膜受到毒性损伤后,Mu ller细胞会出现增殖,同时去分化并开始表达视网膜干细胞相关转录因子,最终部分增殖的Mu ller细胞可分化为视网膜神经元。由此可见,Mu ller细胞可成为视网膜神经元再生的细胞来源,为临床治疗视网膜神经元退行性变等疾病提供光明的前景。     

视网膜中Muller细胞分布的免疫组织化学研究

用抗非神经元烯醇化酶（ＮＮＥ）抗体研究６－３８周人胚胎，成人视网膜和视网膜母细胞瘤中Ｍｕｌｌｅｒ细胞的分布。发现Ｍｕｌｌｅｒ细胞呈放射状，胞体位于内核层，分支包绕神经元的胸体和突起。不同视网膜Ｍｕｌｌｅｒ细胞的分支和ＮＮＥ含量有差异。提示与视网膜的功能状态有关。     

大鼠视神经切断后视网膜Muller细胞及小胶质细胞变化特点

目的观察视网膜Muller细胞和小胶质细胞在大鼠视神经切断后的变化特点．方法应用大鼠视神经完全横断模型,随机分为术后1d、3d、7d、14d4个损伤组和假手术组（每组n=5）;分别用Muller细胞和小胶质细胞特异性标记物谷氨酰胺合成酶（GS）和OX-42,进行免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶连结（sP）法染色,以显示视网膜Muller细胞和小胶质细胞的变化．结果在视神经切断后,大鼠视网膜Muller细胞GS阳性产物立即增粗、深染,并与周围细胞紧密联系在一起,3d达高峰,14d明显减弱;小胶质细胞OX-42的阳性产物表达在视神经切断后7d明显增强,14d达高峰．结论视神经切断后大鼠视网膜Muller细胞反应性增生,小胶质细胞被激活,但反应高峰晚于Muller细胞,其作用有待进一步研究．     

胰岛素对视网膜Muller细胞生长活力的影响

目的：研究不同浓度胰岛素对视网膜Muller细胞生长活力的影响，探讨Muller细胞在视网膜神经损伤中的作用。方法：取兔视网膜Muller细胞进行培养及鉴定。取第3代细胞，应用MTT测定方法，测定1U／ml、4U／ml、8U／ml、12U／ml胰岛素分别在6小时、12小时、24小时对视网膜Muller细胞增殖的影响。结果：在胰岛素作用6h、12h时，均为4U／ml浓度组MTT值最高，与对照组的差异最显著（F值5．60、7．31，均P〈0．001）。结论：不同浓度胰岛素在一定浓度范围、一定作用时间内，对视网膜Muller细胞的生长有显著的促进作用。     

Muller细胞诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化

目的研究Muller细胞在视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化中的作用。方法分离培养Muller细胞和不同时期的胚胎视网膜前体细胞,将其与Muller细胞共同培养,并进一步用Muller细胞条件培养液来诱导视网膜前体细胞的分化。倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况,Thy1.1标记视网膜神经节细胞并计数。结果视网膜前体细胞能分化为多种视网膜细胞类型,包括视网膜神经节细胞。不同时期、不同培养条件下的视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比不同。单独培养组、共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比,E14分别为(16.91±4.05)%,(47.25±9.67)%和(42.36±10.52)%,E18则分别为(4.65±1.88)%,(9.90±3.19)%和(8.69±3.01)%。相同时期的视网膜前体细胞,共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比较单独培养组高,差异有统计学意义。相同培养条件下,E14视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比较E18高,差异有统计学意义。结论Muller细胞能诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化,可能通过Muller细胞释放某些可溶性因子发挥作用。     

视网膜Muller细胞病变与糖尿病视网膜病关系的研究进展

糖尿病视网膜病（DR）是糖尿病的主要微血管病变之一，可导致视力下降甚至失明，其发病机制尚未完全明了该病典型的病理改变为视网膜水肿和新生血管生成，近年采，随着对视网膜Muller细胞的深入研究，发现Muller细胞可参与多种病理和生理过程，并且在糖尿病视网膜病进展中起了重要作用蕾文就视网膜Muller细胞与糖尿病视网膜痛进展之间的联系以及目前对Muller细胞研究的最新进展作一综述，     

胰蛋白酶在原代细胞制备中的灵活应用

目的：探讨胰蛋白酶消化组织块制备原代细胞的最佳浓度。方法：在37℃下，相同时间里不同浓度的胰蛋白酶消化等量的组织块，制备原代细胞，对获得的原代细胞细胞数、细胞成活率及细胞粘附性进行观察。结果：在同等条件下，0.125％胰蛋白酶为制备大多数种类原代细胞的较为理想的浓度。结论：在一定的温度及时间条件下，用0.25%的胰蛋白酶消化原代细胞得率较低，而0.125％胰蛋白酶消化的细胞得率较高。     

改良消化复合植块法培养新生大鼠雪旺细胞

目的探讨改良的单酶消化法与组织贴块法相结合的培养雪旺细胞(SCs)的方法,并与经典植块法和普通消化复合植块法进行比较。方法取新生3~5 d的SD大鼠双侧坐骨神经和臂丛神经,分别采用经典植块法、普通消化复合植块法、改良消化复合植块法培养SCs。培养7 d后进行细胞消化和传代,在显微镜下计数并计算细胞总量。用S-100免疫荧光染色法检测所获细胞的纯度。结果改良消化复合植块法培养的SCs生长增殖速度最快,可获取(1.85±0.13)×106个细胞;普通消化复合植块法次之,可获取(1.10±0.10)×106个细胞;经典植块法所获SCs的生长增殖速度最慢,可获取(0.77±0.03)×106个细胞,3种方法比较差异均有统计学意义(P<0.01)。S-100免疫荧光染色结果显示,改良消化复合植块法细胞纯度为(95.73±1.51)%,普通消化复合植块法为(84.66±2.68)%,经典植块法为(74.50±4.23)%,3种方法比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论改良消化复合植块法可以在短时间内获得大量高纯度的SCs,为研究周围神经修复再生奠定良好的基础。     

胰蛋白酶预处理在人角质形成细胞传代培养中的应用

1　材料和方法1.1　材料　 1KC的培养 :无菌条件下手术取人包皮 ,尽量剪除皮下组织 ,置于 1.5 g· L- 1 Dispase液中 4℃ 18～ 2 4h.将真表皮分离 ,取表皮分别置于 2 .5 g· L- 1胰蛋白酶 0 .1g·L- 1二乙胺四乙酸二钠 (EDTA)及含 10 0 m L· L- 1血清的DMEM中吹打成单细胞悬液 ,离心 30 0 g· m in- 1 ,10 min,弃悬液 ,KC无血清培养基 (Gibco BRL )重悬细胞 ,调整细胞数至1× 10 3· L- 1 ,接种至 6孔培养板 ,2 4h后换液 .当细胞生长至 80 %～ 90 %汇合时 1∶ 2传代 .1.2　方法　 1分组 :KC传代时分为两组 ,预处理组 :细胞约80 %…     

经胰蛋白酶消化真皮皮浆培养成纤维细胞

采用手术切除的包皮或其它部位的正常断层皮，经胰蛋白酶消化揭去表皮，真皮成份在适量的细胞培养液中剪成皮浆，将此皮浆混悬液按点状法接种于培养瓶（皿）中，４～６ｈ可贴壁，然后再加入含胎牛血清的细胞培养液继续培养，结果２４ｈ便可观察到新细胞萌出，２周左右细胞增长成片，结果表明：与常用的胶原酶消化法和普通的组织贴块法相比，具有培养周期短等优点．     

Ephrin-A2 and -A3 are negative regulators of the regenerative potential of Müller cells

Background In a previous study, we demonstrated that ephrin-A2 and -A3 negatively regulate the growth of neural progenitor cells in the central nervous system. Adult mice deficient in ephrin-A2 and -A3 （A2＋A3＋） displayed active ongoing neurogenesis throughout the brain, and mice deficient in ephrin-A3 alone showed increased proliferation of ciliary epithelium derived retinal stem cells. This study aimed to detect that the increase in proliferation and neurogenic potential of MOiler cells is influenced by the absence of ephrin-A2 and -A3. Methods We assessed the retinal and MOiler cell expression of ephrin-As and their receptor and neural progenitor cell markers by immunostaining and real-time PCR. We cultured purified primary MOiler cells derived from wild-type and A2＋A3＋ mice in a defined culture medium that enables trans-differentiation of Mu11er cells into retinal neurons. To evaluate proliferating MOiler cells in vivo, we injected 5＇-ethylnyl-2-deoxiuridine （EdU） intraperitoneally to adult mice. Results Expression of ephrin-A2/A3 and their receptor EphA4 were detected in the retinas of adult mice, with EphA4 expression particularly enriched in MOiler cells. MOiler cells of A2＋A3＋ mice exhibited significantly elevated expression of retinal progenitor cell markers, Pax6 and Chx10, when compared with those from wild-type mice. Moreover, a higher percentage of Mu11er cells of A2＋A3＋ mice trans-differentiated and became recoverin＋ and β-Ⅲ-tublin＋ in the culture than those from wild type mice. Strikingly, an increased number of EdU＋ retinal cells was detected in the retinas of adult A2＋A3＋ mice as compared with wild-type mice. Conclusions Ephrin-A2 and -A3 are negative regulators of the proliferative and neurogenic potentials of Mu11er cells. Manipulating ephrin-A signaling may thus represent a novel strategy for stimulating neuroregeneration from endogenous progenitors to participate in retinal repair in case of disease or damage.     

猫胰岛细胞的分离纯化和培养

目的建立猫胰岛细胞分离纯化和体外培养的方法。方法在自制玻棒持续振荡下常规分离胰岛细胞,进行单层细胞培养和组织块培养。采用差速贴壁法。碘乙酸法、消化时间差法去除培养中的成纤维细胞。动态收集单层细胞培养液, 分别用放射免疫法和比色法检测胰岛素和淀粉酶含量。光镜下观察５～３０ｄ细胞生长情况。分别对培养第５、１５、２１天的 细胞进行葡萄糖负荷试验、组织块培养的细胞进行透射电镜检查。结果猫胰岛细胞在体外培养可保持良好的生物学活 性３周或３周以上（组织培养）。结论　在国内首次建立的猫体外胰岛细胞培养方法可行可靠,体外培养第７～２５ｄ的细 胞形态和功能良好,是进行实验研究的极好材料。     

简易的单个肿瘤干细胞分离及其培养方法

目的建立一套简单有效的单个肿瘤干细胞分离及培养方法,提高研究的效率与质量。方法在火焰上轻烤拉伸后的毛细管,与无菌塑料管连接建立口控毛细管单细胞分离装置。分离单个SW480细胞无血清培养筛选出克隆球,CD133、CK7荧光标记鉴定;消化克隆球吸取单个肿瘤干细胞并移至石蜡油封闭的微滴及96孔板中培养对比观察。结果 SW480细胞克隆形成率约为1.04%,其CD133表达强CK7表达弱;口控毛细管单细胞分离装置分离单个肿瘤干细胞的有效率可高达98.99%;单个肿瘤干细胞在微滴中培养与在96孔板中培养的比较:在分裂时间点上,前两次分裂时间相差无几(P>0.05),在微滴中培养的细胞后续分裂需时较长;在持续扩增的数量上,微滴培养为11.5%(22/192)而96孔板为9.2%(17/184),两者差异无统计学意义(P>0.05)。结论单个SW480细胞无血清培养可形成肿瘤干细胞球,口控单细胞分离装置能够有效分离单个肿瘤干细胞,石蜡油封闭微滴培养法和96孔板培养法均能够有效扩增单个肿瘤干细胞。但石蜡油封闭微滴培养法操作灵活、观察便捷、环境稳定,可作为培养单个肿瘤干细胞的首选。     

一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法

目的:建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的方法. 方法:采用胰蛋白酶/胶原酶(1∶1)混合酶液消化法培养人脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合后用胰蛋白酶消化传代;用形态学、免疫细胞化学法进行鉴定. 结果:种植在培养瓶中的内皮细胞4h贴壁生长,48～96 h生长最快,7～10 d汇合. 内皮细胞呈单层铺路石样外观,Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ:Ag)和内皮细胞生长因子受体2(KDR)鉴定内皮细胞纯度达95%以上. 结论:用混合酶液灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型.     

改良法培养鼠腹膜间皮细胞

目的 :建立一种从腹腔灌注消化液分离鼠腹膜间皮细胞的培养模型。方法 :用 0 .12 5 %的胰蛋白酶 - 0 .0 1%EDTANa2 消化液注入鼠腹腔 ,抽取腹腔灌注液进行培养 ,采用相差显微镜、电镜和免疫组化鉴定间皮细胞。结果 :分离并培养的细胞融合后在相差显微镜下呈铺路卵石状 ,纯度达 95 %以上。电镜下可见丰富的微绒毛。免疫组化鉴定角蛋白和波形蛋白阳性 ,Ⅷ因子和白细胞CD4 5抗原阴性。结论 :鼠腹膜间皮细胞培养模型建立成功 ,该模型可为进一步研究腹膜透析并纤维化的防治提供实验基础     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养方法优化

目的：建立一个分离、培养、纯化大鼠的骨髓间充质干细胞的方法。方法使用贴壁法分离大鼠的骨髓间充质干细胞,通过培养初期的频繁换液和传代过程中减少胰蛋白酶的暴露时间,达到骨髓间充质干细胞的纯化。流式细胞仪检测细胞表面标志物,MTT法检测细胞生长状况,暴露于不同的诱导培养基使细胞成骨、成脂,并向肝胆系分化。结果分离所得的细胞阳性表达CD29、CD44、CD90,而对于造血细胞标志物CD45呈阴性。在成骨、成脂培养基的诱导下,细胞ALP、茜素红、油红O染色均呈阳性,并发现传至10代的细胞仍保持分化功能。将骨髓间充质干细胞贯续暴露于不同的细胞因子和激素,得到了表达肝细胞、胆管上皮细胞特异标志的子代细胞。结论通过改良后的方法可以高效、简洁地分离出形态均一的大鼠骨髓间充质干细胞,并能够向多胚层的细胞分化。     

改良组织块法培养SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞

目的应用改良植块法体外培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞。方法15只SD雄性大鼠,随机分成3组,每组5只,分别采用组织块法、酶消化法及改良组织块法分离大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,在含双抗及20%胎牛血清DMEM,37℃、5%CO2、95%空气的细胞培养箱静置中培养,相差显微镜观察细胞形态及扩增情况,用α-平滑肌肌动蛋白(a-SM-Actin)及结蛋白(desmin)免疫组织化学染色,鉴定细胞类型。结果α-平滑肌肌动蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为96.3%,在成纤维细胞中阳性率为23.8%,结蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为74.4%,在成纤维细胞中呈阴性。三组间结蛋白阳性细胞率具有显著差异,改良组织块法组结蛋白阳性细胞率高于组织块法和酶消化法组。结论结蛋白是鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标,改良组织块法可获纯度更高、结构和功能良好的阴茎海绵体平滑肌细胞。     

SD大鼠肝枯否细胞分离培养的改良方法与鉴定

目的枯否细胞(Kupffer cells,KC)是肝内巨噬细胞群,活化的KC参与多种生物、病理学反应过程。然而,KC分离、培养技术进展缓慢。为研究KC致炎、抗炎活化机制,旨在建立经济、简便、有效、稳定分离培养SD大鼠肝KC的方法。方法选用健康雄性SD大鼠,采用0.05%IV型胶原酶灌注肝,经25%和50%percoll密度梯度离心,提取肝KC。荧光显微镜下观察细胞自发荧光情况,锥虫蓝拒染实验鉴定细胞活力,倒置显微镜下观察KC培养过程中细胞形态变化,吞噬墨水、latex珠实验以及免疫细胞化学染色法鉴定细胞纯度。结果大鼠肝KC得率为(3.22±0.31)×107(n=24),细胞活力为(92.35±0.13)%,细胞纯度均在(94.62±0.24)%。结论该方法简单、可行,为进一步研究KC功能和作用机制奠定基础。