下调METTL3-LYN m6A-IGF2BP2通路抑制内皮细胞迁移

目的 研究甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase like 3,METTL3)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)迁移能力的影响,并初步探究其作用机制.方法 通过在线设计靶向METTL3第1个外显子的sgRNA,构建到lentiCRISPR v2载体;Western blot和免疫荧光染色实验检测METTL3蛋白表达水平;细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移能力;m6A甲基化RNA免疫沉淀实验检测细胞迁移相关基因酪氨酸激酶LYN mRNA上m6A甲基化修饰情况;荧光定量PCR(qPCR)检测LYN的表达情况;利用shRNA敲低m6A识别蛋白IGF2BP1和IGF2BP2,siRNA敲低m6A识别蛋白YTHDF2,qPCR检测识别蛋白敲低水平及LYN的mRNA表达情况;RNA免疫沉淀实验进一步检测IGF2BP2与LYN mRNA的结合情况;放线菌素D抑制转录后,qPCR检测LYN mRNA半衰期.结果 利用CRISPR-Cas9技术成功构建METLL3基因敲低的HUVECs细胞系.METTL3基因敲低后,内皮细胞的迁移能力下降(P＜0.05),细胞迁移相关基因LYN mRNA上m6A甲基化修饰水平显著降低(P＜0.01),且LYN mRNA的表达明显下调(P＜0.05).敲低m6A识别蛋白YTHDF2和IGF2BP1,对LYN mRNA的表达量无显著影响(P＞0.05),而敲低IGF2BP2,LYN的mRNA表达量显著下调(P＜0.01),RNA免疫沉淀实验结果显示IGF2BP2与LYN mRNA结合.mRNA半衰期实验结果表明敲低IGF2BP2降低LYN mRNA稳定性.结论 敲低METTL3抑制内皮细胞迁移,其机制可能通过IGF2BP2识别并结合LYN mRNA上m6A修饰位点,调控其mRNA稳定性来发挥作用.     

RNA干扰抑制p62基因表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的:研究shRNA降低p62基因表达对人宫颈腺癌HeLa细胞增殖的影响。方法:构建具有沉默p62表达的慢病毒载体短发夹RNA（shRNA）序列,采用Polybrene将其转染入宫颈腺癌HeLa细胞中（shRNA组）,设立shNC作为阴性对照组,另设未加慢病毒转染载体的空白对照组。采用实时荧光定量qRT-PCR技术检测各组相对空白对照组的p62基因相对表达量;采用CCK-8实验检测3组细胞的增殖情况,采用集落克隆形成实验检测3组细胞的克隆形成率。结果:沉默p62基因表达的宫颈癌HeLa细胞成功构建;shRNA组p62mRNA相对空白对照组的相对表达量为（0.18±0.08）,而shNC组的p62mRNA相对空白对照组的相对表达量为（1.01±0.12）（t=9.97,P<0.01）;shRNA的干扰效率为81.00%;shRNA组较阴性对照组和空白对照组细胞增殖速度变慢（P<0.05）,克隆形成率减少（P<0.01）。结论:p62基因沉默后,宫颈癌HeLa细胞的增殖速度变慢。p62基因在宫颈癌HeLa细胞的增殖中起着重要的作用。     

宫颈癌细胞PAX1基因甲基化的CRISPR靶向调控系统的构建

目的:建立PAX1基因甲基化的CRISPR靶向调控系统。方法:首先,通过甲基化特异性PCR（MSP）测定宫颈癌细胞系（CaSki,SiHa）及正常细胞（人胚肾细胞HEK293T）中 PAX1基因启动子的DNA甲基化水平;通过荧光定量PCR（RT-PCR）和免疫印迹（Western blotting）分别检测上述细胞系的mRNA及蛋白表达。然后,在PAX1高甲基化的宫颈癌细胞共转染sgRNA（single guide RNA）和dCas9-Tet1质粒,采用焦磷酸测序（Pyrosequencing）和 RT-PCR分别检测其基因甲基化和表达水平的改变。最后,结合生物信息学预测和RT-PCR评估该CRISPR系统的脱靶效应。结果:与HEK293T细胞相比,宫颈癌细胞的PAX1基因启动子呈现高甲基化,且其mRNA（CaSki:t=9.13;SiHa:t=12.31;P<0.05）和蛋白表达水平（CaSki:t=16.72;SiHa:t=11.81;P<0.05）均降低。在CaSki及SiHa细胞系中,去甲基化sgRNA3（act-sgRNA3）组调控最显著,其PAX1基因的甲基化水平在CaSki和SiHa细胞系中分别下降了22.21%（t=6.65,P<0.05）、19.62%（t=17.00,P<0.05）,其mRNA表达水平均显著上调（P<0.05）。且该系统脱靶效应基因的表达差异均小于2倍。结论:本研究成功建立了PAX1基因甲基化的CRISPR靶向调控系统,可有效的降低其甲基化水平,增强其内源性的表达水平。     

氯丙嗪对膀胱癌BT-B细胞迁移功能的影响

目的:探讨盐酸氯丙嗪对膀胱癌BT-B细胞迁移功能的影响及其机制。方法:用不同浓度的氯丙嗪处理膀胱癌BT-B细胞,通过MTT、细胞划痕和Transwell迁移实验验证氯丙嗪对细胞生长和迁移功能的影响。蛋白印迹实验和RT-qPCR实验验证氯丙嗪对Yes相关蛋白1（YAP1)和Ras相关蛋白1A（RAP1A）蛋白表达水平和mRNA表达水平的影响。免疫荧光实验验证氯丙嗪对YAP1细胞亚定位的影响。质粒转染实验验证YAP1和RAP1A与上皮间质转化（EMT）的调控关系。结果:氯丙嗪可抑制膀胱癌BT-B细胞的生长（t=11.53,P<0.001;t=35.83,P<0.000 1;t=36.1,P<0.000 1;t=194.6,P<0.000 1）和迁移（t=5.80,P<0.01;t=7.43,P<0.01;t=5.13,P<0.01;t=6.61,P<0.01;t=18.51,P<0.000 1;t=19.04,P<0.000 1）;与对照组相比,氯丙嗪作用于BT-B细胞后,YAP1（t=6.12,P<0.05;t=7.64,P<0.05）和RAP1A（t=4.87,P<0.05;t=8.30,P<0.05）的蛋白表达水平和mRNA表达水平（t=21.13,P<0.001;t=40.59,P<0.001）均显著降低;与对照组相比,氯丙嗪给药处理2 h后YAP1的荧光表达明显变弱;与对照组相比,YAP1表达增加后RAP1A蛋白（t=9.05,P<0.05）和EMT相关分子N-cadherin蛋白、Slug+snail蛋白（t=7.24,P<0.05;t=5.57,P<0.05）表达均显著增加,而YAP1敲低后RAP1A蛋白（t=4.36,P<0.05）、N-cadherin蛋白和Slug+snail蛋白（t=4.50,P<0.05;t=4.49,P<0.05）表达均显著降低。结论:氯丙嗪可通过 YAP1调节RAP1A抑制膀胱癌的迁移,可能是治疗膀胱癌的一种新选择。     

宫颈癌HeLa细胞中Bcrp1+、CK17+及CD44v5+表型细胞的检测与分离

目的：检测Bcrp1、CK17及CD44v5在宫颈癌HeLa细胞中的表达情况及相互关系,推测该3种抗体成为宫颈癌干细胞标记物的可能。方法：采用免疫荧光标记物流式细胞仪分选并检测HeLa细胞中的CK17+、CD44v5+、Bcrp1+表型细胞;利用免疫细胞化学染色法,检测Bcrp1+ 及Bcrp1-1两组HeLa细胞中CK17及CD44v5的表达情况。结果： HeLa细胞中存在CD44v5+细胞,所占比例为0.1%,CK17+细胞为0.7%,Bcrp1+细胞为11%;Bcrp1+组HeLa细胞中存在CK17+及CD44v5+细胞,而Bcrp1-组中则无,组间比较差异有显著性（P<0.05）。结论：表达CK17及CD44v5的HeLa细胞同时表达Bcrp1转运蛋白,CK17及CD44v5均有可能成为宫颈癌干细胞的标记物。     

SiRNA-CD147降低HeLa中survivin表达的研究

目的研究下调CD147表达后宫颈癌细胞系HeLa细胞中survivin表达及凋亡的变化。方法设计、合成两对CD147编码基因的反向重复序列,运用瞬间转染方法抑制HeLa中CD147表达,应用RT-PCR、Western blotting方法检测干扰后CD147、survivin、Bim及caspase-3表达改变,流式细胞术检测干扰后肿瘤细胞的凋亡情况。结果 SiR-NA sequence 1、2均有效抑制CD147基因表达（P〈0.05）,干扰后的survivin表达明显下降,干扰后caspase-3mRNA水平升高（P〈0.05）,活性caspase-3蛋白及Bim水平增高（P〈0.05）,肿瘤细胞凋亡增加,以细胞早期凋亡改变最为明显（P〈0.05）。结论沉默CD147基因表达可下调HeLa细胞中survivin的表达,诱导肿瘤细胞凋亡。     

p38δ在宫颈癌细胞中的表达及其对缺氧HeLa细胞凋亡的影响

目的探讨p38δ在宫颈癌组织细胞和HeLa细胞系中蛋白表达水平及p38δ对缺氧诱导HeLa细胞凋亡的影响。方法采用蛋白印迹法检测组织及细胞蛋白表达水平。采用慢病毒转染及细胞耐药性筛选构建稳定表达p38δ HeLa细胞株。采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染色法检测细胞凋亡水平。结果宫颈癌细胞系HeLa 细胞中p38δ蛋白表达水平低于非癌性细胞系人胚肾293 细胞及小鼠胚胎纤维细胞，差异有统计学意义（P <0.05）；宫颈癌组织细胞中p38δ蛋白表达水平低于正常宫颈组织细胞，差异有统计学意义（P <0.05）；p38δ 过表达提高缺氧条件下HeLa细胞凋亡水平，差异有统计学意义（P <0.05）；p38δ 过表达促进缺氧条件下HeLa 细胞中凋亡相关因子Bcl-2 蛋白表达水平下调及Bax、p53 蛋白表达水平上调，差异有统计学意义（P <0.05）。结论在宫颈癌组织细胞和宫颈癌HeLa 细胞中，p38δ的蛋白表达水平降低。HeLa细胞中高表达p38δ 促进缺氧细胞凋亡。     

TALENs介导的Nanog基因表达下调对宫颈癌HeLa 细胞恶性行为的影响

目的 研究Nanog表达下调对宫颈癌HeLa 细胞恶性行为的影响。方法 通过基因编辑工具转录激活样效应器核酸酶（TALENs）介导Nanog 下调表达,基因测序分析Nanog的突变情况;挑取单个细胞培养以筛选出Nanog明显下调表达的单克隆HeLa细胞;RT-PCR 检测mRNA 表达水平;Western blot 检测蛋白表达水平;HeLa细胞的集落形成能力、侵袭性及耐药性分别通过集落形成实验、 Transwell 侵袭实验及药物敏感性实验检测。 结果 TALENs成功介导Nanog 基因突变并导致其下调表达,Nanog突变的单克隆HeLa细胞Nanog mRNA和蛋白表达水平较野生型HeLa细胞均下调表达（P<0.05）。Nanog突变单克隆HeLa细胞相对于野生型HeLa细胞表现出明显减弱的侵袭、集落形成及化疗药物抵抗能力（P<0.05）。 结论 Nanog突变减弱HeLa 细胞的恶性行为,下调或沉默Nanog表达有望成为一种新型的治疗宫颈癌策略。     

PKG抑制剂KT-5823对宫颈癌HeLa细胞活力、凋亡、自噬的影响

目的:明确宫颈癌HeLa细胞对环鸟苷酸依赖性蛋白激酶（PKG）抑制剂KT-5823的敏感性,探究KT-5823对HeLa细胞活力、凋亡和自噬的影响及机制。方法:使用不同浓度的KT-5823干预HeLa细胞24h,CCK-8、免疫印迹试验分别测定细胞活力、PKG1表达水平,进而确定后续药物刺激浓度。将HeLa细胞分为两组,即DMSO组（对照组）和KT-5823组（实验组）,流式细胞术检测细胞凋亡,GFP-LC3B荧光斑点实验检测自噬斑点形成数量,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测PKG1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3Ⅱ）、Beclin1mRNA的表达水平,免疫印迹试验检测PKG1、自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、自噬相关通路蛋白蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2家族蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）蛋白的表达水平。增加自噬抑制剂SBI-0206965组观察自噬在此过程中的作用。结果:与对照组相比,实验组在3～100μmol/L刺激浓度下均可导致HeLa细胞活力降低（t=10.23～14.83,均P＜0.05）,PKG1蛋白表达水平逐渐降低（t=10.01～14.17,均P＜0.05）。最终选取3μmol/L为刺激浓度,用于后续研究。与对照组相比,细胞凋亡增加（t=10.78,P=0.004）,荧光自噬斑点数量增加（t=10.12,P=0.0005）,PKG1mRNA、蛋白的表达水平降低（t=13.56,P=0.0002;t=5.461,P=0.0055）、LC3Ⅱ、Beclin1mRNA（t=8.359,P=0.0011;t=5.782,P=0.0044）、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白（t=6.924,P=0.0023;t=11.84,P=0.0003）的表达水平增加,p-Akt/Akt（t=5.194,P=0.0065）、p-mTOR/mTOR（t=12.78,P=0.0002）、Bcl-2/Bax（t=13.79,P=0.0002）的比值降低,Caspase3表达增加（t=9.341,P=0.0007）。与实验组相比,30、50、70、100μmol/L自噬抑制剂SBI-0206965组可增加细胞凋亡（t=7.616,P=0.0016;t=15.43,P=0.0001;t=11.01,P=0.0004;t=15.39,P=0.0001）。结论:PKG抑制剂KT-5823可有效抑制HeLa细胞增殖、促进细胞凋亡,同时可抑制Akt-mTOR通路诱导细胞发生自噬,且KT-5823诱导的自噬在此过程中起保护性作用,PKG可成为宫颈癌临床治疗的新靶点。     

四溴苯三唑对宫颈癌HeLa细胞凋亡的诱导作用及其机制

目的：探讨四溴苯三唑（TBB）对人宫颈癌HeLa细胞的促凋亡作用,阐明其对相关信号转导通路的作用机制。方法：选取处于对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞,将其分为对照组（未给予TBB）和实验组（给予TBB）。采用MTT比色法检测HeLa细胞存活率,采用倒置显微镜观察人宫颈癌HeLa细胞形态表现,采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法及流式细胞术检测HeLa细胞凋亡率,采用Western blotting法检测细胞中凋亡相关蛋白p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3和Pro-caspase-3表达水平。结果：MTT法检测,与对照组比较,实验组HeLa细胞存活率明显降低（P<0.01）,且呈浓度依赖性;倒置显微镜下观察,实验组HeLa细胞出现体积缩小、细胞核皱缩等细胞凋亡的形态变化;Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法和流式细胞术检测,与对照组比较,实验组各时间段（3、6、12和24 h）细胞凋亡率明显升高（P<0.05或P<0.01）;Western blotting检测,与对照组比较,实验组HeLa细胞中抗凋亡蛋白p-Akt和Bcl-2表达水平逐渐降低,促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3表达水平逐渐升高,Pro-caspase-3表达水平逐渐降低（P<0.05或P<0.01）。结论：TBB可能通过抑制Akt信号通路的活性进而有效促进HeLa细胞凋亡。     

Fus依赖ac4C修饰调控促进宫颈癌细胞增殖

目的：探讨Fus RNA结合蛋白(Fus)影响宫颈癌细胞增殖的机制。方法：通过MTT实验观察Fus对宫颈癌细胞HeLa增殖的影响;采用RT-qPCR和Western印迹观察人N-乙酰转移酶10(NAT10)对Fus表达的影响;利用RNA免疫沉淀实验(RIP)检测Fus mRNA的富集情况;通过RNA稳定性实验观察NAT10对Fus mRNA稳定性的影响;基于生物信息学软件PACES预测Fus mRNA上的ac⁴C修饰位点,构建含有Fus mRNA上ac⁴C修饰位点的野生型和突变型的EGFP报告质粒,利用EGFP-reporter实验和乙酰化RIP(ac⁴C-RIP)确定Fus mRNA上发生ac⁴C修饰位点;最后通过挽救实验观察NAT10介导Fus对宫颈癌细胞增殖的影响。结果：Fus促进宫颈癌HeLa细胞增殖(t_Fus=14.06,t_{sh R-Fus}=5.74,均P<0.05);Fus蛋白和mRNA的表达水平随NAT10表达增加而增加(t_N...     

YTHDF1对HBV蛋白表达和HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用

目的:探讨YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1(YTHDF1)对乙型肝炎病毒(HBV)蛋白表达和抗原分泌的影响.方法:分别以pCD3/Flag-KBE和pSilencer2.1-U6 neo为载体,构建过表达和敲降YTHDF1质粒.在Huh7细胞中过表达HBV蛋白质粒的同时表达pshR-YTHDF1和对照质粒,通过W...     

低氧对胰腺癌PANC-1细胞株中TWIST表达的影响

目的:探讨低氧条件对胰腺癌PANC-1细胞中TWIST表达的影响及可能的机制.方法:低氧浓度下培养PANC-1细胞,蛋白质印迹检测不同时间点TWIST蛋白的表达水平,免疫荧光检测TWIST、E-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白的表达;转染TWIST siRNA后,在常氧及低氧条件下培养,蛋白质印迹检...     

灵芝乙醇提取物对宫颈癌细胞生物学行为和JAK1/STAT3信号通路的影响

目的：探讨灵芝乙醇提取物(GLEE)对宫颈癌细胞生物学行为和Janus激酶1 (JAK1)/信号传导和转录激活因子3 (STAT3)信号通路的影响,并阐明其可能的作用机制。方法：将人宫颈癌HeLa细胞随机分为对照组(给予完全培养液)和低、中及高剂量GLEE组(给予25、50、100 mg·L^-1GLEE)。MTT法检测各组细胞增殖抑制率,平板克隆实验检测各组克隆形成率,Transwell小室实验检测各组迁移细胞数和侵袭细胞数,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组细胞中JAK1和STAT3 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中JAK1、磷酸化JAK1 (p-JAK1)、STAT3、磷酸化STAT3 (p-STAT3)、细胞因子信号传导抑制蛋白3 (SOCS3)和活化STAT蛋白抑制因子1 (PIAS1)蛋白表达水平。结果：与对照组比较,低、中和高剂量GLEE组宫颈癌HeLa细胞增殖抑制率升高(P<0.05),细胞克隆形成率、迁移细胞数和侵袭细胞数降低(P<0.05),细胞中JAK1和STAT3 mRNA表达水平降...     

胃癌标本和正常胃组织中P53基因及其下游基因METTL9表达研究

目的联合检测P53及其下游基因METTL9（P53 Activated Protein 1）在胃癌中的表达并探讨其作用及二者之间的关系。方法提取正常胃组织和胃癌及癌旁组织中的RNA,采用荧光定量PCR方法对标本中P53基因及其下游基因METTL9的表达及相对定量结果。结果胃癌组织P53蛋白表达明显低于正常组织和癌旁组织,胃癌旁组织P53蛋白表达明显低于正常组织,胃癌组织和癌旁组织METTL9表达明显高于正常组织,以上结果具有显著性差异（P〈0.05）,METTL9与P53呈负相关（P〈0.05）。结论 P53与METTL9在胃癌组织中高表达且与胃癌的分化程度及转移密切相关,METTL9作为P53的下游基因与P53的表达呈负相关性。     

肠道菌群失调通过促进炎性反应影响颈动脉粥样硬化的形成

目的:观察肠道菌群失调对颈动脉的影响，探讨肠道菌群失调对颈动脉粥样硬化形成的机制。方法: C57BL/6小鼠随机分为对照组（n=15）和肠道菌群失调组（n=15）。肠道菌群失调组小鼠予头孢曲松钠（0.1 g/mL，2 mL）灌胃，对照组小鼠予同体积生理盐水灌胃，2次/d，共持续6周。灌胃结束后禁食12 h，行肠道细菌培养及计数，观察颈动脉苏木素伊红（HE）染色图片，测颈动脉内膜横截面积和狭窄率，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测颈动脉白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA的表达，使用Western印迹法观察颈动脉核因子κB p65（NF-κB p65）的表达情况。结果: 两组在肠道菌群组成（肠球菌、乳酸杆菌及双歧杆菌）上存在差异（t=2.72、2.27、2.56， 均P<0.05）。与对照组比较，肠道菌群失调组小鼠颈动脉内膜增厚[（0.14±0.01）mm2 vs. （0.45±0.08）mm2，P<0.05]，管腔狭窄率升高[（2.15±0.92）% vs.（18.31±6.82）%，P<0.05]，炎症细胞浸润较多，IL-6、TNF-α、TGF-β1 mRNA以及NF-κB p65蛋白含量明显增多，差异均有统计学意义（t=2.15、2.67、3.16、6.95，均P<0.05）。结论: 肠道菌群调节炎症反应，影响颈动脉粥样硬化的形成。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589抑制基底样乳腺癌生长和转移

目的：探究组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对基底样乳腺癌（BLBC）生长和转移的抑制作用。方法：通过MTT法和平板克隆实验检测LBH589对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞系4T1增殖能力的影响;Transwell实验检测LBH589对细胞迁移和侵袭能力的影响;实时荧光定量PCR和免疫印迹实验检测LBH589对细胞上皮-间质转化的作用;构建4T1乳腺癌细胞Balb/c小鼠脂肪垫成瘤模型,腹腔注射LBH589,观察4T1细胞成瘤和转移能力。结果：体外实验结果显示,与对照组相比,LBH589显著抑制MDA-MB-231和4T1细胞的增殖能力（t=11.37,P<0.05;t=18.18,P<0.05）、克隆形成能力（t=7.76,P<0.05;t=15.22,P<0.05）、迁移（t=8.8,P<0.05;t=18.0,P<0.05）和侵袭能力（t=8.24,P<0.05;t=15.99,P<0.05）;与对照组相比,LBH589上调细胞的上皮标志物CDH1的mRNA(t=7.33,P<0.05)表达水平,抑制细胞的...