噬菌体展示技术筛选PirB 受体拮抗肽及其体外功能研究

目的：运用噬菌体展示技术筛选能够与Aβ42 竞争性结合其受体PirB 的小分子多肽，并验证其生物学功能，为以PirB 受体为靶点的小分子多肽治疗阿尔茨海默病提供新的依据。方法：以PirB 受体为目标蛋白，经过三轮生物淘选，从Ph.D.-7 噬菌体随机展示肽库筛选获得高特异性的单克隆噬菌体，ELISA 检测分析单克隆噬菌体与PirB 的结合能力。提取阳性克隆菌ssDNA，测序翻译，分析比对阳性序列与Aβ42 的相似度及疏水轮廓，合成候选多肽。采用MTT 检测多肽细胞毒性，利用细胞免疫荧光结合实验验证候选多肽是否和PirB 结合。利用链霉素- 亲和素结合实验进一步测量候选肽与PirB 的结合能力，得到解离常数。采用神经元突起损伤模型探究多肽的体外生物活性。Western Bolt 检测PirB 下游信号ROCK2，CRMP2，p-CRMP2 的表达情况。结果：三轮生物淘选后获得29 个阳性克隆，结合ELISA 结果选定11 个阳性克隆，提取ssDNA，测序翻译，体外合成11 条候选肽。经软件分析比对后，其中候选肽P11（命名为P2）与PirB 高亲和力的配体Aβ42有三个相同的氨基酸，与Aβ42 带同样的电荷，具有较高的相似性，更有可能阻断Aβ42 与受体PirB的结合。经过MTT、免疫荧光结合实验及体外神经元损伤模型，对11 条候选多肽进行筛选验证发现P2 为目标肽，P2 可能阻断Aβ42 与受体PirB 的结合。MTT 结果表明P2 在16 μmol·L-1 浓度范围内都不具备生物毒性。免疫荧光结合实验表明P2 结合能力强。细胞荧光共定位实验也表明，P2 能够特异性的与PirB 结合。链霉素- 亲和素结合实验表明，P2 与受体PirB 特异性结合，解离常数 Kd 为 0.128 μmol·L-1。生物学功能表明，在原代皮质神经元突起损伤模型中P2 可拮抗Aβ42介导的突起损伤作用，促进神经突起的再生。WB 结果表明，P2 降低PirB 受体下游蛋白 ROCK2，p-CRMP2 的表达。结论：成功的从噬菌体随机展示肽库中筛选得到具有生物活性的PirB 受体高特异性拮抗肽，命名为P2。P2 与受体PirB 特异性结合，解离常数 Kd 为 0.128 μmol·L-1，P2 能缓解Aβ42 引起的神经生长突起抑制作用，促进神经突起再生，其分子机制为降低PirB 受体下游信号蛋白ROCK2 的表达以及CRMP2 蛋白的磷酸化。     

苯并[a]芘对神经胶质细胞中胰岛素降解酶与脑啡肽酶表达的影响

目的：探讨苯并［a］芘［benzo(a)pyrene,BaP］对神经胶质细胞中具有β-淀粉体（β-amyloid,Aβ）清除作用的胰岛素降解酶（insulin-degrading enzyme,IDE）及脑啡肽酶（neprilysin,NEP）表达的影响。方法：制备新生SD大鼠原代神经胶质细胞混合培养体系,接受不同浓度的BaP、Aβ1-42寡聚体、Aβ1-42纤维体单独或联合处理24 h后,采用细胞增殖 毒性检测试剂盒测定细胞存活率。随机分为对照组、BaP（2.00 μmol/L）组、Aβ1-42（20.00 mg/L）寡聚体组、BaP+Aβ1-42寡聚体组、Aβ1-42（20.00 mg/L）纤维体组、BaP+Aβ1-42纤维体组,其中BaP均为预处理12 h后再与不同聚集状态的Aβ1-42共同作用。进一步采用实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹技术检测体系中IDE、NEP的mRNA和蛋白表达水平。结果：20.00 μmol/L及以下浓度的BaP处理,20.00、40.00 mg/L的Aβ1-42寡聚体或Aβ1-42纤维体单独处理,BaP与Aβ1-42寡聚体或BaP与Aβ1-42纤维体联合处理对神经胶质细胞的存活率均无明显影响。与对照组相比,BaP单独处理组中IDE、NEP的mRNA和蛋白水平均未明显改变;而Aβ1-42寡聚体单独作用可明显上调IDE的mRNA及蛋白水平（P<0.05）,同时BaP预处理可显著抑制Aβ1-42寡聚体作用引起的IDE表达水平上调（P<0.05）;另一方面,Aβ1-42纤维体在单独处理或有BaP预处理情况下,IDE、NEP的mRNA和蛋白水平均未发生明显改变。结论：在对细胞存活率无明显影响的前提下,BaP预处理显著抑制了Aβ寡聚体作用后的IDE表达水平上调,提示苯并［a］芘可能干扰Aβ寡聚体降解途径导致Aβ增多聚集,进而可能促进认知功能降低及阿尔兹海默病的形成。     

沉默信息调节因子1 对抗APP 高表达转基因小鼠脑组织及β- 淀粉样肽寡聚体处理的原代培养神经元中氧化应激水平升高的作用

目的：由于氧化应激水平升高是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的可能性发病机制之一，而沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的功能与抗氧化有关，本文试图了解SIRT1 是否能对抗β- 淀粉样肽前体蛋白（APP）高表达的小鼠大脑或经β- 淀粉样肽寡聚体（AβOs）处理的神经元中氧化应激水平的升高。方法：APP/PS1 双转基因种鼠与野生型（WT）雌鼠合笼繁殖，筛选出APP/PS1 双转基因小鼠，分别饲养至4 月龄或8 月龄时，用白藜芦醇（RSV，SIRT1 激活剂）或苏拉明（SIRT1 抑制剂）通过灌胃方法处理转基因小鼠，每次20 mg·kg-1 体重/ 天，时间2 个月；采用原代海马神经元培养，用0.5 μmol·L-1 AβOs 处理48 小时后分别用20 μmol·L-1RSV 或300 mg·mL-1 苏拉明处理细胞24 小时。采用CCK-8 方法检测细胞存活率，筛选最佳药物处理浓度；用蛋白印记及实时定量PCR 方法分别检测SIRT1 蛋白和mRNA 表达水平；用免疫组织化学方法检测APP 高表达转基因小鼠脑组织内老年斑分布情况；用激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测原代海马神经元中活性氧（ROS）水平；用生物化学方法检测小鼠脑组织及细胞中OH-、H2O2、O2.- 水平，丙二醛（MDA）含量，以及超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果：与WT 小鼠或未经处理的原代神经元相比，APP/PS1 小鼠大脑或经AβOs 处理的神经元中SIRT1 的表达显着降低；小鼠脑组织中老年斑数量明显增加；脑组织及培养神经元中氧化应激水平明显升高，抗氧化酶水平明显降低。APP/PS1 小鼠大脑或经AβOs 处理的神经元中这些异常改变可通过RSV 处理后减弱，而用苏拉明处理后则使其增强。结论：SIRT1 可以降低APP 高表达小鼠大脑及经AβOs 处理的神经元中的氧化应激水平，具有神经保护作用。     

辛伐他汀对转β分泌酶HEK293细胞RhoA/ROCK途径及Aβ42生成的影响

目的 观察辛伐他汀(Sim)通过RhoA/ROCK途径对转β分泌酶(BACE1)-HEK293细胞分泌β-淀粉样蛋白(Aβ)的影响。方法 体外培养BACE1-HEK293细胞,在保证培养环境胆固醇充足的条件下分为对照组、1μmol/L Sim组、1μmol/L Sim+250μmol/L甲羟戊酸(Mev)组、5μmol/L Sim组、5μmol/L Sim +250μmol/L Mev组对细胞进行处理。MTT检测细胞存活率;ELISA检测Aβ42分泌量;Western blotting检测细胞膜RhoA及细胞浆磷酸化肌球蛋白磷酸酶肌球蛋白结合亚基(p-MYPT1)表达量。结果 MTT显示各组细胞存活率无差异(P>0.05); 1μmol/L Sim组和5μmol/L Sim组细胞分泌Aβ42较对照组减少(P<0.05); 两组细胞膜上RhoA及细胞浆p-MYPT1含量较对照组显著降低(P<0.01),分别加入250μmol/L Mev后能对抗Sim的作用(P<0.01)。结论 Sim可以通过降低胆固醇以外的途径减少RhoA蛋白的细胞膜定位和下游激酶ROCK的活化,抑制细胞Aβ42的分泌。     

Nogo-A中不同功能片段对体外培养大鼠皮质神经元细胞内钙离子浓度的影响

目的研究Nogo-A主要功能片段Nogo-66、amino-Nogo对大鼠皮质神经元细胞内钙离子浓度的影响。方法体外原代培养并鉴定新生大鼠皮质神经元,将神经元按照干预药物不同分为对照组(给予Krebs-ringer液)、Nogo-66组、amino-Nogo组、amino-Nogo+尼莫地平组,以Fluo4/AM标记神经元细胞内钙离子,采用激光共聚焦显微镜技术检测药物干预1、3、5、7 min时各组神经元细胞内钙离子信号。结果加入药物后,对照组和Nogo-66组神经元细胞内钙离子信号强度在各时间点未见明显变化(P>0.05),而amino-Nogo组和amino-Nogo+尼莫地平组钙离子信号持续升高(P<0.05)。组间比较结果显示,在药物干预1 min时,4组间的神经元细胞内钙离子信号比较差异无统计学意义(P>0.05);在药物干预3、5、7 min时,Nogo-66组神经元细胞内钙离子信号与对照组比较差异无统计学意义(P<0.05),而amino-Nogo组和amino-Nogo+尼莫地平组神经元细胞内钙离子信号与对照组和Nogo-66组同时间点比较均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。在药物干预3 min时,amino-Nogo组神经元细胞内钙离子信号与amino-Nogo+尼莫地平组比较差异无统计学意义(P>0.05);在药物干预5、7 min时,amino-Nogo组神经元细胞内钙离子信号高于amino-Nogo+尼莫地平组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 amino-Nogo是Nogo-A中导致神经元细胞内钙离子浓度升高的责任功能片段。     

ET-1对高血压大鼠脑基底动脉血管平滑肌细胞增殖的作用

目的观察内皮素-1(ET-1)对高血压大鼠脑基底动脉血管平滑肌细胞增殖的作用。方法将高血压大鼠和正常血压大鼠按加入ET-1浓度的不同各分为6组:10%胎牛血清(对照组);10%胎牛血清+20μmol·L-1 ET-1(20μmol·L-1组);10%胎牛血清+40μmol·L-1 ET-1(40μmol·L-1组);10%胎牛血清+60μmol·L-1 ET-1(60μmol·L-1组);10%胎牛血清+80μmol·L-1 ET-1(80μmol·L-1组)及10%胎牛血清+100μmol·L-1 ET-1(100μmol·L-1组)。使用细胞计数试剂盒计数各组细胞个数;采用氚标胸腺嘧啶脱氧核苷([3 H]-TdR)掺入法测定各组血管平滑肌细胞的DNA的合成量作为细胞增殖的指标。结果 ET-1刺激高血压大鼠脑基底动脉平滑肌细胞增生。高血压大鼠20、40、60、80及100μmol·L-1各组脑血管平滑肌细胞数量及DNA合成量较对照组均增加,以80mol·L-1组细胞数量及DNA合成量增加最为明显(均P<0.05)。正常血压鼠各组脑血管平滑肌细胞数量变化及DNA合成量增加不明显(P>0.05)。结论 ET-1可明显促进高血压大鼠脑基底动脉血管平滑肌细胞增殖,提示ET-1可能促进高血压诱发的脑血管重构。更多     

记忆相关基因KIBRA 抑制Aβ 诱导的神经元凋亡研究

目的：为了明确记忆相关基因KIBRA 在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）转基因动物模型中是否存在表达改变及及其对神经元凋亡的影响,进而探讨KIBRA 如何参与Aβ诱导的神经元凋亡及其相关机制。方法：本研究首先通过免疫组织染色及免疫蛋白印迹的方法,观察在不同月龄APP/PS1 小鼠中是否存在KIBRA 的表达改变。其次,通过TUNEL 免疫荧光染色,观察在KIBRA 基因敲除小鼠中是否存在神经元凋亡。最后,我们使用CRISPR/CAS9 慢病毒及过表达慢病毒分别转染HT22 细胞,建立KIBRA 基因敲除和KIBRA 过表达细胞模型,进而探讨KIBRA 对Aβ诱导的神经元凋亡及其相关机制的研究。结果：①KIBRA 在APP/PS1 转基因小鼠脑内特异性表达：选用9 月龄及12 月龄APP/PS1 小鼠作为AD 研究模型,通过KIBRA 免疫组织染色分析,无论整个海马,还是海马亚区CA1 区和CA3 区,9 月龄和12 月龄APP/PS1 小鼠KIBRA 阳性细胞数量均明显低于对照组,其中12 月龄尤为显著（P<0.01,P<0.001）。免疫蛋白印迹结果同样证实12 月龄APP/PS1 小鼠海马区KIBRA 的表达明显低于野生型小鼠（P<0.001）。随着月龄的增加,KIBRA在APP/PS1 转基因小鼠海马区的表达逐渐减少,提示KIBRA 在AD 小鼠海马区的特异性降低,与学习记忆障碍密切相关。②KIBRA 在神经元凋亡中的重要作用：通过TUNEL 荧光染色发现,与野生型小鼠相比,12 月龄APP/PS1 小鼠海马神经元凋亡比例明显增多（P<0.01,P<0.01）。4 月龄KIBRA 基因敲除小鼠海马神经元凋亡比例比野生型小鼠明显增加（P<0.05）,提示KIBRA 在神经元凋亡的发生中扮演不可或缺的角色。③KIBRA 对Aβ诱导的神经元凋亡的保护作用：CCK8及免疫蛋白印迹结果显示,与空病毒组相比,经1 μmol·L-1 的Aβ1-42 寡聚体处理后的KIBRA 敲除组细胞活力明显降低（P<0.01）;凋亡相关蛋白（剪切的PARP、活化的caspase3）的表达量明显增高（P<0.05,P<0.01）。KIBRA 过表达组细胞存活率明显优于空病毒组（P<0.05）,凋亡相关蛋白较空病毒组显著减少（P<0.05）,进一步提示KIBRA 参与抑制Aβ诱导的神经元凋亡,促进细胞增殖和存活。4. KIBRA 通过激活Akt 信号通路抑制Aβ诱导的神经元凋亡：本实验筛选凋亡相关信号通路,结果显示,在1 μmol·L-1 Aβ1-42 寡聚体处理1 min 后,KIBRA 敲除组Akt Ser473 位点磷酸化水平比空病毒组显著降低（P<0.05）。在Aβ1-42 寡聚体处理1 分钟后,KIBRA 过表达组Akt Ser473 位点磷酸化明显被激活,Akt Ser473 位点磷酸化水平比空病毒组显著增高（P<0.01）。此外,与Aβ1-42 寡聚体干预组相比,Akt 特异性抑制剂（MK2206）预处理组KIBRA 过表达细胞存活率明显降低（P<0.05）;剪切的PARP 表达量明显增高（P<0.05）。以上结果表明KIBRA 通过激活Akt Ser473 位点的磷酸化水平,抑制Aβ诱导的神经元凋亡。结论：KIBRA 作为一种神经保护因子,通过激活Akt 信号通路抑制Aβ诱导的神经元凋亡,促进细胞增殖及存活,为AD 发病机制及治疗药物的研究提供了新的靶点。     

复方丹参片对老年痴呆症合并焦虑障碍的研究

目的：探讨复方丹参片对老年痴呆症合并焦虑障碍的作用及机制。方法：4 月龄野生型小鼠和APP/PS1 转基因小鼠分别灌胃给予溶剂或复方丹参片60 天后,采用Morris 水迷宫实验、新物体识别实验、新奇抑制摄食实验和高架十字迷宫实验评价复方丹参片对APP/PS1 转基因小鼠学习记忆功能和焦虑样行为的影响;应用ELISA 检测小鼠海马淀粉样蛋白Aβ40、Aβ42、γ- 氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）和脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）的含量;Real time PCR 和Western Blot 分别检测IDE/NEP 的mRNA 和蛋白水平变化。结果：复方丹参片720 mg·kg-1 明显短缩小鼠在水迷宫实验中找到平台的潜伏期,360 mg·kg-1 和720 mg·kg-1 明显增加小鼠原有平台象限的探索时间;复方丹参片720 mg·kg-1 可显著性增加APP/PS1 转基因小鼠对新物体的识别指数;复方丹参片360 mg·kg-1、720 mg·kg-1 显著性增加APP/PS1 转基因小鼠在高架十字迷宫中开臂的时间百分比和进入开臂的次数;复方丹参片360 mg·kg-1、720 mg·kg-1 显著性缩短APP/PS1 转基因小鼠摄食潜伏期;复方丹参片360 mg·kg-1、720 mg·kg-1 显著性降低APP/PS1 转基因小鼠海马Aβ40、Aβ42 的浓度和增加GABA 和BDNF 含量;复方丹参片720 mg·kg-1 显著性上调APP/PS1 转基因小鼠海马IDE、NEP mRNA 的表达;复方丹参片720 mg·kg-1 显著性增加小鼠海马IDE 蛋白表达。结论：复方丹参片改善APP/PS1 转基因小鼠的学习记忆损伤和焦虑样行为,可能与增加脑组织GABA 和BDNF 含量、IDE 的蛋白表达及降低Aβ40、Aβ42 水平有关。     

氟西汀对海马神经元生长的影响

目的研究不同浓度氟西汀对体外培养的新生大鼠海马神经元生长的影响。方法进行新生SD大鼠海马神经元原代培养,采用烯醇化酶(NSE)免疫组织化学和尼氏染色鉴定海马神经元。在培养3 d的海马神经元中加入不同浓度(1、10、20、40μmol.L-1)的氟西汀,并设正常对照组,48 h后观察细胞有突起的神经元数目、突起长度和胞体长径。研究氟西汀对海马神经元生长的影响。结果10μmol.L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组比较,有突起的神经元数目增加、最长突起长度增长(P<0.05);40μmol.L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组比较,有突起神经元数目减少(P<0.05),最长突起长度及胞体长径无统计学差异(P>0.05);1μmol.L-1、20μmol.L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组比较,有突起神经元数目、最长突起长度及胞体长径无统计学差异(P>0.05)。结论一定浓度的氟西汀能促进海马神经细胞的生长。     

NF-κB对Aβ1-42诱导神经元KATP亚基Kir6.2/SUR1表达的影响

目的 研究神经细胞核转录因子-κB(NF-κB)对β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)诱导原代培养皮层及海马胆碱神经元ATP敏感性钾通道(KATP)亚基Kir6.2/SUR1蛋白表达的影响,探讨NF-κB的可能作用。方法 实验分为空白对照组、Aβ1-42组、Aβ1-42+SN50组和SN50组。运用细胞原代培养的方法培养大鼠皮层及海马胆碱神经元并进行鉴定,用Western blotting法检测药物干预后的Kir6.2/SUR1蛋白及NF-κB亚基p65蛋白表达的变化。结果 加入药物处理神经细胞72h后,与空白对照组相比,Aβ1-42组的p65蛋白和Kir6.2/SUR1蛋白表达均显著升高(P均<0.05);与Aβ1-42组相比,Aβ1-42+SN50组的Kir6.2/SUR1蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 NF-κB信号通路在Aβ1-42诱导神经元Kir6.2/SUR1蛋白的表达中起保护作用。     

Study on the Protective Effects and Mechanisms of Dendrobium Nobile Lindle. Alkaloids on PC12 Cells induced by Aβ25-35

Objective：This study was designed to investigate the protective effect of Dendrobium nobile Lindle. Alkaloids （DNLA） on the oxidative stress and apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25-35,and further explore its potential mechanisms. Methods：PC12 cells were divided into 5 groups：control group,model group（10 μmol·L-1Aβ25-35）,DNLA-L group（0.035 mg·L-1 DNLA+10 μmol·L-1 Aβ25-35）,DNLA-M group （0.35 mg·L-1 DNLA+10 μmol·L-1 Aβ25-35）, DNLA-H group（ 3.5 mg·L-1 DNLA+10 μmol·L-1 Aβ25-35）. The cells were cultured in vitro and treated with Aβ25-35 for 24 h to induce PC12 after 6 hDNLA（ 0.035~3.5 mg·L-1） exposure. MTT assay was used to evaluate the effect of DNLA on cell viability induced by Aβ25-35,meanwhile Annexin V/PI staining by flow cytometry was used to detect apoptotic cells. Based on the identifi cation on that DNLA have antiapoptosis function towards that model,do research on effects of DNLA on oxidative stress induced byAβ25-35in PC12 cells by measuring intracellular ROS level,GSH level and SOD activity. Inverted immunofl uorescence microscopy was used to examine the effect of DNLA on mitochondrial membrane potential （MMP） stained with JC-1. Bax,Bcl-2,cleaved-caspase-9 and cleaved-caspase-3 expression level,key proteins of mitochondrial apoptotic pathway,were detected by Western blot,respectively. Results：Compared with control group,the cell viability was markedly decreased and the apoptosis showed notable increase in model group;exposure of cells to Aβ25-35 for 24 h elicited ROS production, while SOD activity,GSH expression level and MMP were markadly decreased,respectively;the protein expression of Bax,cleaved-caspase-9 and cleaved-caspase-3 were signifi cantly increased and the protein expression of Bcl-2 were decreased. However,compared with model,the cell viability of DNLA-M and DNLA-H was signifi cantly increased,and the apoptotic death was markedly decreased;ROS production was signifi cantly reduced,as well as SOD activation;on the other hand,pretreatment with DNLA at the concentration of 3.5 mg·L-1 dramatically enhanced both GSH content and MMP;the level of apoptosis relate protein Bax,cleaved-caspase-9 and cleaved-caspase-3 were significantly reduced;the protein expression of Bcl-2 was notably increased. Conclusions：Under the experimental conditions,DNLA have signifi cant inhabitation function on the apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25-35,and its protential mechanism can be related to reducing the level of oxidative stress to inhibit mitochondrial apoptosisrelated protein expression.     

调控量子点对小鼠胚胎干细胞活性影响的研究

目的:探讨调控量子点对小鼠胚胎干细胞活性的影响.方法:通过微波合成法制备荧光性能优越的量子点,并在体外对小鼠胚胎干细胞进行标记,采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察分析量子点对小鼠胚胎干细胞标记率、活力、增殖等方面的影响,并通过ROCK抑制剂Y-27632调控小鼠胚胎干细胞的活力和增殖能力.结果:用20 nmol·L-1的量子点标记小鼠胚胎干细胞培养24 h后,小鼠胚胎干细胞的标记率达到92.5%,存活率只有40.7%;使用10 μmol·L-1 Y-27632调控量子点标记的小鼠胚胎干细胞培养24 h后,小鼠胚胎干细胞的存活率提高20%.结论:量子点的浓度越大,小鼠胚胎干细胞的标记率越高,成活率越低,添加Y-27632可以阻止量子点标记的胚胎干细胞的凋亡,明显增加胚胎干细胞的生物活性.     

鳖甲煎丸通过RhoA/ROCK信号通路抑制肝癌细胞血管形成拟态的生成

目的观察鳖甲煎丸对肝癌细胞血管生成拟态（VM）形成的作用及其对RhoA/ROCK通路信号分子和VE-cadherin、PI3K 表达的影响,探讨鳖甲煎丸抑制肝细胞肝癌（HCC）转移侵袭的分子机制。方法将40只雄性SD大鼠随机分为4组,分别以鳖甲 煎丸高（H）、中（M）、低剂量（L）及生理盐水（N）灌胃,4 d后采血,制备药物血清。肝癌HepG2细胞体外Matrigel三维培养,药物 血清及RhoA/ROCK抑制剂Y-27632（P）干预24 h后,应用图像采集和分析系统检测各组VM形成情况,采用Western blotting技 术检测各组细胞RhoA和ROCK1的表达水平,ELISA法检测各组细胞培养上清中VE-cadherin、PI3K的含量。结果鳖甲煎丸 可显著抑制HepG2 细胞VM的生成,且VM管径显著高于阴性对照组（P<0.01）,Y-27632 完全抑制了HepG2 细胞VM的生成 （P<0.01）;同时,鳖甲煎丸和Y-27632 都能够抑制HepG2 细胞中RhoA、ROCK1 的表达（P<0.05）,降低细胞培养上清中VEcadherin 、PI3K的表达水平（P<0.05）。结论鳖甲煎丸可抑制肝癌细胞VM的形成,其作用机制可能与其能抑制三维培养的 HepG2细胞中RhoA/ROCK通路信号分子及VE-cadherin、PI3K的表达有关。     

α-突触核蛋白寡聚体抑制大鼠原代培养神经元突起早期生长

目的 观察人α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)和其形成的寡聚体对大鼠原代培养神经元突起生长的影响,明确α-Syn的生理功能,探讨其寡聚化对神经元的毒性及其在帕金森病发病机制中的作用.方法 制备α-Syn的寡聚体,向分组培养的大鼠脑皮质神经元培养基中添加,培养1、2和4h后固定,观察对神经元突起生长的影响.神经元的突起以成像显微镜观察测量,Western blotting法、免疫荧光法实验进行鉴定.结果 添加α-Syn寡聚体组的神经元培养至1、2和4h时,其突起的平均长度均小于对照组和添加α-Syn单体组(P＜0.05).增加α-Syn寡聚体浓度,随浓度增高神经元突起的平均长度与对照组差异越大(P＜0.01).Western blotting法和免疫荧光实验明确了外源性α-Syn寡聚体可以从培养基进入到神经元内.结论 α-Syn寡聚体在原代神经元生长初期对其突起生长具有抑制作用,这一现象可能与其在帕金森病发病机制中的作用有关.     

脑心清片对脂多糖诱导的BV-2 细胞的抗炎及抗凋亡作用

目的：通过研究脑心清片（NXQ）对脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞（BV-2）的炎症因子及凋亡细胞的表达作用,探讨脑心清片对脑卒中的抗炎及抗细胞凋亡的作用。方法：采用LPS 诱导的BV-2 细胞作为体外神经炎症模型,用脑心清片进行干预,用ELISA 检测促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量水平;采用Western Blot 法检测IL-6、IL-1β和TNF-α、p-Akt、p-Erk、Bax、Bcl-2 的蛋白表达水平。结果：LPS 刺激BV-2 细胞24 h 之后,IL-6、IL-1β和TNF-α炎症因子表达水平明显升高（P<0.01）,NXQ 预处理后,IL-1β含量在10、20 μmol·L-1 时相对于LPS 处理组均有显著性的差异（P<0.05,P<0.05）,IL-6、TNF-α含量在20 μmol·L-1 时相对于LPS 处理组均有统计学意义（P<0.05）;LPS 刺激BV-2 细胞24 h 之后,IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,NXQ 预处理后,能呈现浓度依赖性的降低这些蛋白的表达水平,并且在10、20 μmol·L-1 时相对于LPS 处理组均有显著性的差异（P<0.05,P<0.01）;LPS 刺激BV-2 细胞24 h 之后,p-Akt、p-Erk 蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,NXQ 预处理后,能呈现浓度依赖性的升高这些蛋白的表达水平,并且在10、20 μmol·L-1 时相对于LPS 处理组均有显著性的差异（P<0.01,P<0.01）;LPS 刺激BV-2 细胞24 h 之后,促凋亡蛋白Bax 表达水平明显升高（P<0.01）,NXQ 预处理后,Bax 蛋白表达水平下降,
并且在20 μmol·L-1 时相对于LPS 处理组有统计学意义（P<0.05）。LPS 刺激BV-2 细胞24 h 之后,抗凋亡蛋白Bcl-2 表达水平明显降低（P<0.01）,NXQ 预处理后,Bcl-2 蛋白表达水平呈现浓度依赖性的升高,并且在10、20 μmol·L-1 时相对于LPS 处理组均有统计学意义（P<0.05,P<0.05）。结论：脑心清片对脂多糖诱导的小胶质细胞产生的炎症和毒性具有一定的调节作用,通过调节炎症因子的表达和激活Akt/Erk 通路,具有抗炎和抗细胞凋亡作用,进一步阐明了脑心清片抗脑卒中的作用机理。     

α7 神经型尼古丁受体对突触功能和钙信号通路的影响及在阿尔茨海默氏病中的神经保护作用机制研究

目的：研究β- 淀粉样蛋白（ β-amyloid protein,Aβ） 的聚集是否会引起突触形态及相关蛋白表达水平的变化以及与Aβ、胆碱能受体及突触功能密切相关的钙离子通路是否发生变化,进一步探讨这些改变之间是否具有一定的相关性;研究特异性激动原代海马神经元中的 α7nAChR 对突触形态及其相关蛋白、钙信号通路相关蛋白、Ca2+ 浓度以及 α7nAChR 对抗 Aβ 毒性作用的神经保护作用机制,为进一步阐明AD 发病机制提供一定的理论依据。方法：原代培养大鼠海马神经元细胞;实验细胞分为A 组：对照组;B 组：α7nAChRs 特异性激动剂 PNU-282987 处理组;C 组：Aβ1-42 寡聚体处理组;D 组：PNU-282987+ Aβ1-42 寡聚体处理组;采用Real-time PCR 法和蛋白免疫印迹（ Western Blot） 法分别测定各组细胞中突触相关蛋白Syn、PSD95、SNAP25、DYN1、AP180,钙信号通路相关蛋白CaM、CaMKⅡ、pCaMKⅡ、CREB、PCREB mRNA 和蛋白表达水平的变化,流式细胞仪检测神经细胞钙离子水平。结果：Aβ1-42 寡聚体可引起神经元细胞内钙超载,Aβ1-42 寡聚体可减少各组细胞中突触相关蛋白Syn、PSD95、SNAP25、DYN1、AP180 和钙信号通路相关蛋白CaMKⅡ、pCaMKⅡ、CREB、pCREB mRNA 及蛋白表达水平,增加CaM mRNA 及蛋白的表达水平;特异性激动海马神经元细胞α7nAChR 后神经细胞内钙离子水平相对减少,神经元细胞中的突触相关蛋白Syn、PSD95、SNAP25、DYN1、AP180 和钙信号通路相关蛋白CaMKⅡ、pCaMKⅡ、CREB、pCREB mRNA 及蛋白表达水平升高,且能对抗Aβ对突触蛋白及钙通路相关蛋白的影响。结论：Aβ1-42 寡聚体对细胞的神经毒性能够损伤突触功能以及钙信号通路;α7nAChR 可增加突触相关蛋白的表达以及可能通过激活钙信号通路来抵抗Aβ的神经毒性发挥神经保护作用。     

红景天甙对HSC—T6细胞株Rho／ROCK信号通路影响的研究

目的:观察红景天甙对大鼠肝星状细胞株HSC-T6细胞增殖活化、胶原合成、Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶-I(Rho associated coiled coil forming protein kinase-Ⅰ,ROCK-Ⅰ)及基质金属蛋白酶抑制剂-1(Tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1)表达的影响并以ROCK特异性抑制剂Y-27632作为阳性对照,探讨红景天甙抗肝纤维化作用的分子机制.方法:MIT法检测HSC-T6细胞生长增殖;酶联免疫吸附(ELlsA)法检测HSC-T6 细胞上清Ⅰ型胶原含量;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、ROCK-Ⅰ、TIMP-1mRNA的表达;Western blot 检测细胞α-SMA、ROCK-Ⅰ、TIMP-Ⅰ蛋白表达.结果:MTT检测显示红景天甙和Y-27632对HSC-T6细胞的生长增殖具有抑制作用,并呈剂量依赖性;ELISA结果提示红景天甙和Y-27632可抑制HSC-T6细胞I型胶原的分泌;Real-time PCR和Western blot结果表明红景天甙和Y-27632均能下调HSC-T6细胞ROCK-Ⅰ、TIMP-1和α-SMA的表达.结论:红景天甙可抑制HSC-T6细胞活化增殖.减少其Ⅰ型胶原分泌,其机制可能与抑制HSC-T6细胞的Rho/ROCK信号通路有关.     

p38MAPK蛋白在体外培养神经元中的表达及W-7的干预作用

目的:探讨p38MAPK蛋白在体外培养神经元中的激活及钙调蛋白抑制剂W-7的干预作用.方法:神经元原代培养并采用NSE免疫细胞化学技术鉴定神经元.取原代培养7 d的大鼠皮质神经元随机分为5组:正常对照组,仅用DMEM/F12完全培养基;NMDA组,去除正常神经元培养液,加入NMDA 50 μmol·L-1,处理时间10...     

尼氟灭酸对氯化钴诱导海马神经元凋亡的抑制作用

目的:探讨尼氟灭酸(NFA)对氯化钴(CoCl₂)诱导的海马神经元凋亡的抑制作用,阐明其可能的机制。方法:原代培养乳鼠海马细胞,并在倒置显微镜下观察海马细胞的形态变化。将海马神经元随机分为对照组(含1%血清培养液)、CoCl₂损伤组(含200 μmol·L^-1NFA等体积培养液)和不同浓度NFA组(在CoCl₂损伤组基础上加入20、40、80 μmol·L^-1 NFA)。MTT法检测各组海马神经元的存活率,流式细胞术分析海马神经元调亡率, ELISA法检测神经元培养液上清中相关凋亡蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和缺氧相关蛋白低氧诱导因子(HIF-1α)的表达水平。结果:海马神经元在培养7 d后形态规则,突触相互交织形成网络。MTT检测,与对照组比较,CoCl₂损伤组神经元存活率明显降低(P<0.01);与CoCl₂损伤组比较,20、40和80 μmol·L^-1NFA组神经元存活率升高(P<0.05或P<0.01)。流式细胞术检测,与对照组比较,CoCl₂损伤组神经元早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率升高(P<0.05或P<0.01);与CoCl₂损伤组比较,20、40和80 μmol·L^-1NFA组神经元早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率下降 (P<0.05或P<0.01)。ELISA法检测,与对照组比较,CoCl₂损伤组神经元培养液上清中HIF-1α、caspase-3 和Bax表达水平升高(P<0.01);与CoCl₂损伤组比较,20和40 μmol·L^-1 NFA组神经元培养上清中HIF-1α、caspace-3 和Bax表达水平下降,Bcl-2表达水平升高(P<0.05或P<0.01)。结论:NFA可以降低CoCl₂对海马神经元的缺氧损伤作用,其机制与抑制HIF-1α的表达、下调Bax/Bcl-2及抑制神经元凋亡有关联。     

5 nm金纳米颗粒对大鼠皮质神经元的作用及机制初探

目的:探讨直径5 nm的小尺寸金纳米颗粒(gold nanoparticles,GNPs)对大鼠皮质神经元细胞的作用及相关机制?方法:使用硼氢化钠还原法制备GNPs,用透射电镜(TEM)及紫外-可见光光谱(UV-Vis)进行鉴定?用5% 牛血清白蛋白(BSA)对GNPs进行包裹提纯后制备成不同浓度(600?1 200?2 400 μg/L)的GNPs培养液?采用免疫荧光染色鉴定原代培养的大鼠皮质神经元纯度?体外培养原代大鼠皮质神经元72 h后,以正常培养的神经元为对照组,以不同浓度GNPs溶液孵育48 h后的神经元作为实验组?采用TEM观察GNPs在细胞内的分布;采用CCK-8试剂盒检测细胞活力;采用TUNEL法检测细胞凋亡;采用丙二醛(MDA)?超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测氧化应激水平?结果:TEM及UV-Vis显示硼氢化钠还原法制备的GNPs呈尺寸均一的球形,在溶液中均匀分散?原代培养的大鼠皮质神经元纯度为(82.0 ± 2.3)%?GNPs主要以聚合体形式分布于胞浆?溶酶体?囊泡中?随着GNPs浓度的增高,细胞活性逐渐降低,尤其1 200和2 400 μg/L处理组细胞活力较对照组显著降低(P < 0.05)?TUNEL染色结果显示,随着GNPs浓度的增高,凋亡细胞数逐渐增加,1 200和2 400 μg/L处理组细胞凋亡明显,具有显著性差异(P < 0.05)?随着GNPs浓度的增高,细胞内MDA含量逐渐增加,SOD含量逐渐减少,1 200和2 400 μg/L处理组与对照组相比MDA含量显著升高,SOD含量显著降低(P < 0.05)?结论:5 nm GNPs能降低大鼠皮质神经元的细胞活力,促进其凋亡,其机制可能与氧化应激损伤相关?