二甲双胍通过调控MSTN抑制小鼠骨骼肌细胞C2C12分化

目的：探讨二甲双胍对小鼠骨骼肌细胞C2C12分化的影响及其分子机制。方法：将小鼠骨骼肌C2C12细胞系分为对照组和二甲双胍（5 mmol/L）组,用含5%马血清分化培养基诱导C2C12细胞分化,观察肌管形成情况。qPCR检测肌球蛋白重链（MyHC）和肌肉生长抑制素（MSTN）mRNA水平。Western印迹检测My HC、Ⅰ型肌球蛋白重链（MyHCⅠ）、Ⅱa型肌球蛋白重链（MyHCⅡa）、Ⅱb型肌球蛋白重链（MyHCⅡb）、Ⅱx型肌球蛋白重链（MyHCⅡx）和MSTN蛋白表达。应用siRNA下调MSTN的表达,并将小鼠骨骼肌C2C12细胞系分为MSTN敲低阴性对照组（siNC组）,MSTN敲低阴性对照+二甲双胍组（siNC+metformin组）,MSTN敲低组（siMSTN组）,MSTN敲低+二甲双胍组（siMSTN+metformin组）,检测二甲双胍是否通过升高MSTN抑制C2C12细胞分化。结果：显微镜观察显示,与对照组相比,二甲双胍组肌管数量减少、肌管直径较小。qPCR结果显示,与对照组相比,二甲双胍组My HC mRNA水平降低（t=29.47,P<0.000 1）,...     

达格列净促进小鼠骨骼肌细胞系C2C12分化的作用及机制的研究

目的 探讨达格列净(DAPA)在促进骨骼肌细胞分化中的作用及机制.方法 将小鼠成肌细胞系C2C12分为未分化组以及分化组(DAPA 0、5、10、50μmol/L).使用含2％马血清分化培养基诱导C2C12细胞分化,观察肌管形成情况,计算细胞分化指数,测定肌酸激酶(CK)活性.采用实时荧光定量聚合酶链反应检测生肌决定因子1(MyoD)、生肌素(Myogenin)、肌球蛋白重链(MyHC)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及p-AMPK mRNA表达水平,Western blot检测MyoD、Myogenin、MyHC、AMPK及p-AMPK蛋白表达水平.结果 随DAPA浓度增加,C2C12细胞分化指数明显增加,CK活性也明显增加;但DAPA 50μmol/L组C2C12细胞分化指数、CK活性与DAPA 10μmol/L组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);C2C12细胞分化过程中DAPA(10μmol/L)使MyoD、Myogenin、MyHC在mRNA和蛋白水平表达均明显上调,差异均有统计学意义(P<0.05).DAPA促进C2C12细胞AMPK磷酸化,而AMPK抑制剂——Compound C可阻断DAPA对C2C12细胞的促分化作用.结论 DAPA可通过激活C2C12细胞AMPK活性,促进细胞分化.     

Axin1调节骨骼肌GLUT4蛋白表达的作用研究

目的：探讨体轴发育抑制因子（Axin1）调节骨骼肌葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)蛋白表达的作用及其机制。方法：利用RNAi干扰的Axin1腺病毒（Ad-siAxin1）感染C2C12小鼠骨骼肌细胞敲低Axin1,荧光显微镜和MTS实验明确Ad-siAxin1最佳感染浓度和时间。分别用携带绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-GFP）、Ad-siAxin1、载体质粒（vector）和Axin1质粒转染C2C12小鼠骨骼肌细胞敲低或过表达Axin1蛋白,Western印迹检测Axin1、端锚聚合酶蛋白（TNKS）和GLUT4蛋白水平。结果：荧光显微镜和MTS实验结果显示,在C2C12小鼠骨骼肌细胞中Ad-siAxin1作用的最佳浓度和时间分别为160μL和48 h。Western印迹结果显示,与Ad-GFP组相比,Ad-siAxin1组中Axin1蛋白降低（t=6.746,P<0.01）。Ad-siAxin1组TNKS蛋白水平降低（t=4.019,P<0.05）,GLUT4蛋白水平下调（t=3.248,P<0.05）。与vector组相比,转染Axin1质粒后,Axin1蛋白水平上...     

双氢睾酮逆转棕榈酸诱导的小鼠骨骼肌细胞胰岛素抵抗及其机制

目的：探讨双氢睾酮（DHT）对棕榈酸（PA）诱导的C2C12小鼠骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响及其分子机制。方法：分别用牛清蛋白（BSA）、PA或PA+DHT孵育C2C12细胞24 h,Western印迹检测胰岛素信号通路蛋白激酶B(Akt)、Akt底物AS160以及炎症相关蛋白核因子κB抑制蛋白（IκB）激酶（IKK）、核因子κB(NF-кB)的磷酸化水平、促炎细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白水平,qPCR检测IL-6和TNF-α mRNA水平。结果：Western印迹结果显示,PA降低胰岛素刺激的Akt、AS160磷酸化水平（均P<0.05）;DHT逆转PA对胰岛素刺激的Akt和AS160磷酸化的抑制作用（F=59.29、7.829;均P<0.05）。PA升高IKK和NF-κB磷酸化水平（均P<0.05）及IL-6和TNF-α蛋白表达（均P<0.01）;DHT降低PA升高的IKK、NF-κB磷酸化水平（F=13.94、10.65,均P<0.05）和IL-6和TNF-α蛋白表达（F=10.82、15.14,均P<0...     

hnRNPU过表达抑制PIM1诱导的细胞衰老的机制研究

目的:探讨人前病毒整合位点1（PIM1）诱导细胞衰老的分子机制。方法:构建过表达PIM1的2BS细胞系,通过Western印迹法和衰老相关β-半乳糖苷酶染色实验测定过表达PIM1是否诱导细胞衰老。免疫沉淀联合质谱分析测定PIM1是否能有效免疫沉淀核异质核糖核蛋白U（hnRNPU）蛋白。运用Real-timePCR和Western印迹法测定PIM1是否影响hnRNPUmRNA和蛋白表达水平。构建同时过表达PIM1和hnRNPU的2BS细胞系,运用Western印迹法和衰老相关β-半乳糖苷酶染色实验检测hnNRPU过表达对PIM1诱导的细胞衰老的影响。结果:与空载对照组相比,过表达PIM1组中衰老信号通路关键基因p53、p21和p16的表达显著增加（p53,t=4.36,P<0.05;p21,t=3.814,P<0.05;p16,t=4.72,P<0.01）,衰老细胞的比例增加（t=6.831,P<0.01）。免疫沉淀联合质谱分析结果显示PIM1能有效免疫沉淀hnRNPU蛋白。PIM1过表达对hnRNPU的mRNA表达水平没有影响（t=0.295,P=0.783）,但是能抑制hnRNPU蛋白的表达（t=33.85,P<0.001）。与只过表达PIM1细胞相比,同时过表达PIM1和hnRNPU细胞,衰老信号通路关键基因p53、p21和p16的表达下降（p53,t=15.317,P<0.001;p21,t=8.012,P<0.01;p16,t=14.08,P<0.001）,衰老细胞的比例降低（t=10.38,P<0.01）。结论:hnRNPU过表达抑制PIM1诱导的细胞衰老。     

血管紧张素Ⅱ2型受体对宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响

目的：探讨激活血管紧张素Ⅱ（ AngⅡ）2型受体（ AT2 R ）对宫颈癌 Hela 细胞生长的影响。方法体外培养宫颈癌Hela细胞,培养基中加入AngⅡ1型受体阻滞剂氯沙坦及不同浓度的AngⅡ（ A组：1×10-8 mol/L;B组：5×10-8 mol/L;C组：1×10-7 mol/L）激活AT2R,培养12小时、24小时、48小时、72小时;MTS法检测细胞活性,计算不同浓度的AngⅡ的细胞抑制率。实时荧光定量PCR检测B淋巴细胞瘤-2基因（bcl-2）、Bax mRNA水平,Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白表达。结果激活AT2R后各组细胞活性随着培养时间的延长而降低,高剂量的AngⅡ组细胞活性更低。与对照组相比较,B组、C组Bcl-2 mRNA表达水平均明显下降（P〈0.05,P〈0.01）;C组与A组相比较Bcl-2 mRNA表达水平进一步下降（P〈0.01）。与对照组相比较,A组、B组、C组Bax mRNA表达水平均明显升高（P〈0.05,P〈0.01,P〈0.01）;C组与A组相比较Bax mRNA表达水平进一步升高（P〈0.01）。 Western blot结果表明激活AT2R后与对照组相比较,A组、B组、C组Bcl-2蛋白表达水平均明显降低（P〈0.05,P〈0.01,P〈0.01）;与A组相比较B组、C组Bcl-2蛋白表达水平进一步降低（P〈0.05,P〈0.01）。与对照组相比较,A组、B组、C组Bax 蛋白表达水平均明显升高（P〈0.05,P〈0.01,P〈0.01）;与A组相比较B组、C组Bax蛋白表达水平进一步升高（P〈0.05,P〈0.01）。结论宫颈癌细胞激活AT2 R后,上调Bax基因表达,同时下调抑Bcl-2基因表达,最终抑制宫颈癌细胞的生长和增殖,诱导其发生凋亡。     

慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌组织20s蛋白酶体C2亚基的基因及蛋白表达的研究

目的 探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠骨骼肌组织内蛋白降解的信号分子--泛素-蛋白酶体系统中20s蛋白酶体C2亚基的基因和蛋白表达水平及意义.方法 采用单纯熏香烟法复制COPD大鼠动物模型.反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测伸趾长肌内20s蛋白酶体C2亚基的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹(Western blot)法测定大鼠伸趾长肌内20s蛋白酶体C2亚基的蛋白表达.结果 RT-PCR结果显示,伸趾长肌组织中20s蛋白酶体C2亚基的mRNA表达(IOD值)较对照组增加,差异有统计学意义(P＜0.01);Western blot结果显示,伸趾长肌组织中20s蛋白酶体C2亚基的蛋白表达较对照组增强,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 COPD大鼠骨骼肌泛素-蛋白酶体系统中20s蛋白酶体C2亚基的基因和蛋白表达均显著增强,提示骨骼肌内泛素-蛋白酶体途径活性上调,是蛋白降解增强的原因之一.     

血管紧张素Ⅱ和坎地沙坦对小鼠骨骼肌细胞C2C12胰岛素敏感性的影响

目的研究血管紧张素Ⅱ和坎地沙坦对小鼠骨骼肌细胞(C2C12)胰岛素敏感性的影响及其机制。方法 C2C12诱导分化成熟后,分为对照组(C组)、模型组(M组,AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦低剂量组(Can1组,坎地沙坦0.1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦中剂量组(Can2组,坎地沙坦1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦高剂量组(Can3组,坎地沙坦10μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)。各组细胞给予相应药物及胰岛素处理后,使用二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)的生成水平,使用2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)检测细胞对胰岛素的敏感性,并用RT-PCR法和Western印迹法分别检测各组细胞内的核转录因子-2(Nrf2)的m RNA及蛋白表达水平。结果与C组比较,M组ROS生成水平显著升高(P<0.01),摄取2-NBDG量显著降低(P<0.01);与M组比较,Can3组ROS生成水平显著减少(P<0.05),摄取2-NBDG量则显著增加(P<0.05)。M组Nrf2的m RNA及蛋白表达较C组显著降低(P<0.01),Can2组及Can3组Nrf2的m RNA及蛋白表达较M组显著升高(P<0.01或P<0.05)。结论 AngⅡ通过下调C2C12中Nrf2的m RNA及蛋白表达,抑制Nrf2的抗氧化效应,增加ROS生成,引起骨骼肌细胞胰岛素抵抗;而坎地沙坦通过抑制AngⅡ的这种作用改善骨骼肌胰岛素抵抗。     

LATS2对恶性周围神经鞘瘤细胞的调控作用及分子机制探讨

目的:探讨大肿瘤抑制激酶2（LATS2）对恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞增殖和迁移的影响及机制。方法:LATS2过表达慢病毒感染ST88-14、STS26T细胞,实验分为阴性对照组及LATS2过表达组,利用CCK-8、细胞划痕实验检测过表达LATS2对细胞增殖、迁移的影响。实时荧光定量RT-PCR和免疫印迹实验检测细胞中LATS2、多梳抑制复合物2（PRC2）核心组分、Yes相关蛋白（YAP）、含有PDZ结合位点的转录共激活因子（TAZ）的mRNA和蛋白表达,以及组蛋白H3第27位赖氨酸上的三甲基化（H3K27me3）水平。结果:与对照组相比,LATS2过表达抑制ST88-14、STS26T细胞增殖（t=4.219、14.66、11.5,均P<0.05;t=5.674、7.118、10.77,均P<0.01）、迁移（t=4.838、4.736,均P<0.01）。与对照组相比,LATS2过表达不影响ST88-14、STS26T细胞中YAP/TAZ的mRNA和总蛋白水平,但升高其蛋白磷酸化水平（t=6.233、3.759,均P<0.01;t=3.44、2.947,均P<0.05）。与对照组相比,LATS2过表达不影响ST88-14、STS26T细胞中PRC2核心组分SUZ12、EZH2、EED的mRNA和蛋白水平,但H3K27me3水平明显升高（t=6.569、16.68,均P<0.01）。结论:LATS2在MPNST细胞系中表达下降,过表达LATS2升高H3K27me3表达水平,同时促进YAP/TAZ的磷酸化,从而抑制MPNST细胞的增殖、迁移,在MPNST中发挥肿瘤抑制因子的作用。     

慢性电刺激对成肌分化的C2C12细胞肌型转换的影响

目的研究钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)在低频复合生理频率慢性电刺激(chronic electrical stimula-tion with lower physiological frequency,CESLPF)对骨骼肌细胞肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)亚型表达的影响。方法以体外2%马血清诱导小鼠成肌母细胞C2C12成肌分化为模型。实验分3组:对照组、CsA组和KN93组。对照组为正常分化的细胞;CsA组和KN93组在细胞诱导分化3 d后,分别用CaN抑制剂环孢菌素A(CsA,8μmol)、Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶(CaMK)抑制剂KN93(6μmol)单一或联合CESLPF(10+40 Hz,1.5 h/d,共2 d)处理。通过RT-PCR、Western blot检测观察成肌分化过程中肌球蛋白重链亚型的表达水平及其转换情况,采用比色法检测CaN的活性。结果在成功构建的体外成肌分化模型上发现,CsA和KN93能够抑制C2C12细胞MHCⅠ的mRNA及蛋白的表达。与分化对照组MHCⅠmRNA相对表达量(0.79±0.04)相比,CsA组(0.62±0.03)和KN93组(0.69±0.05)能够抑制C2C12细胞MHC I型纤维的表达(与对照组比P<0.05);对照组、CsA和KN93处理组MHC I蛋白相对水平分别是(0.91±0.05)、(0.36±0.01)和(0.66±0.02)。对照组MHCⅡb相对表达量为(0.53±0.01),CsA(0.63±0.02)和KN93(0.75±0.03)促进MHCⅡb型纤维的表达(与对照组比较,P<0.05);CESLPF能够逆转上述改变(与对照组比较,P>0.05)。CsA能够抑制CaN的活性表达;CESLPF能够显著提高CaN活性(P<0.05),但仍显著低于正常水平(P<0.05)。结论 CaN和CaMK是骨骼肌细胞MHCⅡ型向MHCⅠ型转变的重要调控酶,CESLPF可能是经CaN通路和非CaN通路联合作用促进肌型转换,该结果为临床应用CESLPF治疗OSAS提供了实验依据。     

维甲酸诱导腭裂小鼠舌发育异常研究

目的：通过检测生肌决定因子基因家族成员Myf5和MyoD在维甲酸诱导腭裂小鼠舌肌发育中的表达,探究维甲酸是否在舌肌发育早期影响其肌向分化。方法建立维甲酸诱导腭裂小鼠模型,利用免疫组化染色法和实时定量PCR法,检测胚胎13天即舌肌发育早期实验组和对照组小鼠舌肌中Myf5和MyoD的分布和表达水平。结果免疫组化结果显示Myf5和MyoD在舌肌细胞的细胞核中表达,实验组Myf5和MyoD的蛋白表达均低于对照组,且差异有显著性意义（P＜0．01）。实时定量PCR结果显示实验组Myf5和MyoD的mRNA表达水平均低于对照组,且差异有显著性意义（ P ＜0．01）。结论 Myf5和MyoD的异常低表达提示了维甲酸可能直接导致舌肌发育和分化的延迟,进而导致腭裂的发生或使其表型加重。     

热休克蛋白70对骨骼肌细胞纤维类型分化的影响

目的：探讨高表达热休克蛋白70（heat shock protein 70,Hsp70）对骨骼肌细胞（C2C12细胞）纤维类型分化的影响。方法：通过构建重组pTRE2 hyg-Hsp70质粒稳定转染C2 C12细胞系,建立Hsp70高表达的C2C12细胞系。经过诱导分化形成骨骼肌纤维,观察不同时间点（0、3、7 d）C2C12细胞的分化情况,并检测骨骼肌类型标志肌球蛋白重链（ myosin heavy chain ,MHC）的表达情况。结果：与对照组相比,高表达Hsp70的C2C12细胞系分化后的3、7 d,MHCⅠmRNA及蛋白的表达明显增高（P＜0．05）,而在分化后7 d,MHCⅡb mRNA及蛋白的表达明显下降（ P＜0．05）。结论：高表达Hsp70的骨骼肌细胞C2 C12可以诱导MHCⅠ的表达,促进骨骼肌细胞向Ⅰ型肌纤维转化。     

NFATc1对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和上皮间质转化的影响

目的:检测活化T细胞c1核因子(NFATc1)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移和上皮间充质转化(EMT)的影响.方法:qRT-PCR检测NSCLC细胞H1650、H460、H1299及正常人支气管上皮细胞BEAS-2B中NFATc1表达水平,将si-NFATc质粒转染至H1650细胞中,通过CCK-8增殖及集...     

Ang Ⅱ诱导大鼠成肌细胞萎缩模型的构建

  目的  构建Ang Ⅱ诱导大鼠成肌细胞（L6）萎缩模型，为进一步研究心衰合并肌少症提供模型依据。  方法  采用大鼠成肌细胞（L6），用2%马血清诱导分化，镜下观察和MyHC蛋白表达情况判断诱导分化的时间。CCK-8检测不同浓度Ang Ⅱ对L6细胞的影响。为确定细胞萎缩模型的条件，选择不同浓度的Ang Ⅱ作用于L6细胞，并用Western Blot和免疫荧光检测MyHC蛋白的表达情况。  结果  L6细胞在2%马血清下生长6 d，能被成功诱导分化，镜下显示细胞出现融合现象和肌管，MyHC蛋白表达也增加。0.1～10 μM的Ang Ⅱ对L6细胞活性无影响，而Western Blot和免疫荧光检测提示在5 μM和10 μM的Ang Ⅱ作用72 h下，MyHC蛋白表达水平逐渐下降。  结论  诱导分化后的L6细胞经10 μM Ang Ⅱ刺激72 h可形成细胞萎缩模型，为心衰合并肌少症的体外细胞研究提供基础。     

PKG抑制剂KT-5823对宫颈癌HeLa细胞活力、凋亡、自噬的影响

目的:明确宫颈癌HeLa细胞对环鸟苷酸依赖性蛋白激酶（PKG）抑制剂KT-5823的敏感性,探究KT-5823对HeLa细胞活力、凋亡和自噬的影响及机制。方法:使用不同浓度的KT-5823干预HeLa细胞24h,CCK-8、免疫印迹试验分别测定细胞活力、PKG1表达水平,进而确定后续药物刺激浓度。将HeLa细胞分为两组,即DMSO组（对照组）和KT-5823组（实验组）,流式细胞术检测细胞凋亡,GFP-LC3B荧光斑点实验检测自噬斑点形成数量,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测PKG1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3Ⅱ）、Beclin1mRNA的表达水平,免疫印迹试验检测PKG1、自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、自噬相关通路蛋白蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2家族蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）蛋白的表达水平。增加自噬抑制剂SBI-0206965组观察自噬在此过程中的作用。结果:与对照组相比,实验组在3～100μmol/L刺激浓度下均可导致HeLa细胞活力降低（t=10.23～14.83,均P＜0.05）,PKG1蛋白表达水平逐渐降低（t=10.01～14.17,均P＜0.05）。最终选取3μmol/L为刺激浓度,用于后续研究。与对照组相比,细胞凋亡增加（t=10.78,P=0.004）,荧光自噬斑点数量增加（t=10.12,P=0.0005）,PKG1mRNA、蛋白的表达水平降低（t=13.56,P=0.0002;t=5.461,P=0.0055）、LC3Ⅱ、Beclin1mRNA（t=8.359,P=0.0011;t=5.782,P=0.0044）、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白（t=6.924,P=0.0023;t=11.84,P=0.0003）的表达水平增加,p-Akt/Akt（t=5.194,P=0.0065）、p-mTOR/mTOR（t=12.78,P=0.0002）、Bcl-2/Bax（t=13.79,P=0.0002）的比值降低,Caspase3表达增加（t=9.341,P=0.0007）。与实验组相比,30、50、70、100μmol/L自噬抑制剂SBI-0206965组可增加细胞凋亡（t=7.616,P=0.0016;t=15.43,P=0.0001;t=11.01,P=0.0004;t=15.39,P=0.0001）。结论:PKG抑制剂KT-5823可有效抑制HeLa细胞增殖、促进细胞凋亡,同时可抑制Akt-mTOR通路诱导细胞发生自噬,且KT-5823诱导的自噬在此过程中起保护性作用,PKG可成为宫颈癌临床治疗的新靶点。