氯氧喹通过下调Rho/Rho激酶信号通路抑制乳腺癌细胞转移

目的: 通过观察氯氧喹对乳腺癌细胞系细胞骨架的聚合状态及其对Rho/Rho激酶信号通路相关靶点蛋白磷酸化的作用,明确氯氧喹治疗乳腺癌的作用机制。方法: 以不同浓度氯氧喹处理乳腺癌Bcap37和MDA-MB-453细胞系,划痕试验检测细胞迁移,Transwell试验检测细胞侵袭,罗丹明标记鬼笔环肽染色法观察F肌动蛋白的聚解状态,免疫荧光法观察α微管蛋白的表达,蛋白质印迹法检测Rho/Rho激酶信号通路关键蛋白磷酸化水平。结果: 氯氧喹可剂量依赖性地抑制细胞迁移和侵袭;Bcap37和MDA-MB-453细胞经氯氧喹处理后其细胞形态发生改变,细胞体积减少;F肌动蛋白和α微管蛋白染色形态不规则,荧光染色聚集成团,且呈现剂量依赖性;氯氧喹可下调Rho/Rho激酶信号通路中肌动蛋白解聚因子Cofilin、磷酸化蛋白激酶（Limk）、Rho关联卷曲蛋白激酶2（Rock2）磷酸化表达（均P < 0.01）。结论: 氯氧喹可抑制乳腺癌细胞骨架聚合从而抑制细胞迁移,该作用可能与抑制Rho/Rho激酶信号通路相关。     

癫痫鼠外周血磷酸化S6蛋白检测及意义

目的: 明确癫痫发作后外周血与脑组织中核糖体磷酸化S6蛋白（P-S6）含量变化的相关性。方法: 取出生后5~6周龄的C57BL/6小鼠30只和SD大鼠22只,采用红藻氨酸腹腔注射诱导癫痫发作。建立P-S6蛋白的流式细胞术检测方法用以检测小鼠及大鼠外周血中mTOR信号通路下游P-S6蛋白的变化,同时采用蛋白质印迹法检测其脑组织中P-S6的变化。采用Pearson相关性分析法分析脑组织与外周血中P-S6蛋白表达的相关性,并对大鼠外周血P-S6蛋白的表达与癫痫发作等级进行相关性分析。结果: 癫痫小鼠外周血和脑组织中P-S6的含量明显增高,其表达量分别升高至对照组的（1.49±0.45）倍（P < 0.05）和（2.55±0.66）倍（P < 0.01）;外周血中P-S6的阳性表达率和平均荧光强度均明显升高（均P < 0.01）,与脑组织中P-S6蛋白表达具有一致性（r=0.8474,P < 0.01）。大鼠自身致痫前后外周血中P-S6含量明显增加,由14.89±9.75增加至52.35±21.72（P < 0.01）,与大鼠脑组织P-S6蛋白表达变化一致（r=0.9385,P < 0.01）,且外周血P-S6含量的变化与癫痫发作等级呈正相关。结论: 癫痫鼠外周血mTOR信号通路的变化与脑组织中的变化具有良好的相关性,提示通过检测外周血P-S6的表达水平可准确反映脑组织中mTOR信号通路的变化。     

飞燕草素通过AKT/mTOR通路诱导HER-2+乳腺癌细胞自噬

目的：研究飞燕草素对HER-2+乳腺癌细胞MDA-MB-453自噬的诱导作用及其分子机制。方法：以不同浓 度飞燕草素处理MDA-MB-453细胞,CCK-8检测细胞增殖情况;TdT介导的脱氧尿嘧啶缺口末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)和Western印迹检测细胞凋亡和与凋亡相关蛋白的表达;荧光斑点、免疫荧光和Western 印迹检测自噬的诱导情况和诱导机制。 结果：飞燕草素抑制MDA-MB-453细胞增殖,增加TUNEL阳性细胞数,下调 caspase-3 和caspase-9蛋白活性,上调裂解的caspase-3和裂解的caspase-9蛋白活性。飞燕草素增加GFP-LC3荧光斑点数、 LC3免疫荧光斑点数、LC3-II和ATG5蛋白表达。飞燕草素下调mTOR通路蛋白AKT,mTOR,eIF4E和p70s6k蛋白活 性。结论：飞燕草素诱导HER-2+乳腺癌细胞MDA-MB-453凋亡的同时通过抑制AKT/mTOR通路诱导细胞自噬。     

雷帕霉素对帕金森病小鼠的保护作用

目的: 探索雷帕霉素对帕金森病模型小鼠的保护作用及机制。方法: 60只SPF级成年健康雄性C57/B6小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组。模型组和治疗组采用1-甲基4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶（MPTP）诱导建立帕金森病模型。治疗组在第7天MPTP注射后1 h开始腹腔注射雷帕霉素（3 mg/kg,1次/d,共7 d）,模型组和对照组均予腹腔注射等体积的溶剂。CatWalk步态分析系统分析小鼠运动功能;免疫荧光法检测小鼠脑黑质部酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元数量;蛋白质印迹法检测mTOR信号通路相关蛋白及自噬相关蛋白的表达;试剂盒测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛和超氧化物歧化酶（SOD）等氧化应激产物的浓度。结果: 与对照组比较,模型组小鼠行走速度和步频变慢,速度变化率增加（P < 0.05或P < 0.01）,被系统识别的落脚模式减少;小鼠脑黑质中TH阳性染色神经元数量减少,Akt、S6K、S6及UNC-51样激酶（ULK）磷酸化水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低,氧化应激相关的SOD和GSH-Px含量减少而丙二醛含量增加（均P < 0.01）。与模型组比较,治疗组步态规律性恢复,落脚模式被系统识别的数量增加,行走速度和步频加快,速度变化率减小（P < 0.05或P < 0.01）;小鼠脑黑质中TH阳性染色神经元数量增加,mTOR信号通路相关蛋白及ULK磷酸化水平降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高,SOD、GSH-Px含量增加而丙二醛含量减少（P < 0.05或P < 0.01）。结论: 雷帕霉素可以抑制帕金森病小鼠mTOR信号通路活性,通过增强大脑黑质部自噬活性和降低氧化应激水平来减轻多巴胺能神经元损伤,改善帕金森病小鼠行为学异常。     

基于PI3K/Akt通路研究山莴苣苦素对三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

目的 研究山莴苣苦素对三阴性乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖和迁移的影响。方法 采用CellTiter-Glo发光法测定山莴苣苦素对三阴性乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖的影响；通过Transwell细胞迁移实验观察山莴苣苦素对三阴性乳腺癌MDA-MB-453细胞迁移的影响；以蛋白质印迹法测定乳腺癌细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平。结果 山莴苣苦素对三阴性乳腺癌MDA-MB-453细胞的IC₅₀为2.879μmol/L。与对照组比较，随着山莴苣苦素浓度的升高，其对三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移能力的抑制作用明显增强，经山莴苣苦素处理的MDA-MB-453乳腺癌细胞的p-Akt随着山莴苣苦素处理浓度的升高，其表达水平明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 山莴苣苦素通过抑制PI3K/Akt信号通路，达到抑制MDA-MB-453乳腺癌细胞增殖和迁移的作用。     

HPK1过表达对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的：构建造血祖细胞激酶1（HPK1）慢病毒载体,探讨HPK1过表达对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的作用,阐明其可能的机制。方法：通过过表达HPK1的慢病毒感染细胞,获得稳定表达HPK1的细胞系（MCF-7-HPK1和MDA-MB-231-HPK1）,将2个细胞系分别分为3组,即空白组、对照组（空载体组）和过表达组;分别采用RT-PCR法和Western blotting法检测乳腺癌细胞中HPK1 mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期和凋亡率,Transwell法分析细胞的迁移能力,Western blotting法检测caspase 3、PTEN、MMP-9、MMP-2、Ki-67和HPK1蛋白表达水平。结果：与空白组和对照组比较,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞过表达组中HPK1 mRNA和蛋白表达水平升高（P < 0.05）,细胞增殖率明显降低（P < 0.05）,细胞凋亡率明显升高（P < 0.05）,穿越Matrigel的细胞数明显减少（P < 0.05）,MCF-7细胞周期阻断在G₁期;过表达组细胞中caspase 3、PTEN蛋白表达水平上调（P < 0.05）,MMP-9、MMP-2、Ki-67蛋白表达水平降低（P < 0.05）。结论：HPK1过表达可抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖及迁移并诱导凋亡,其可能与caspase 3、PTEN蛋白的表达上调及MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白的表达降低有关。     

抗菌肽LL-37对结肠癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及其机制

目的：探讨抗菌肽LL-37对结肠癌小鼠肿瘤生长和细胞凋亡的影响,阐明其抗肿瘤作用的可能分子机制。方法：构建LL-37过表达结肠癌HT-29细胞,采用qRT-PCR和Western blotting法检测HT-29细胞中LL-37 mRNA和蛋白表达水平。30只BALB/c小鼠随机分为对照组（给予未经感染的HT-29细胞）、空载组（给予感染空载质粒的HT-29细胞）、LL-37过表达组（给予感染LL-37过表达载体的HT-29细胞）、AMPK抑制剂组[给予感染空载体的HT-29细胞后,立刻尾静脉注射2 mg·kg^-1（Dorsomorphin,Dor）]和联合组（给予感染LL-37过表达载体的HT-29细胞后,立刻尾静脉注射2 mg·kg^-1 Dor）,每组6只。采用结肠癌HT-29细胞复制结肠癌小鼠模型,观察各组小鼠肿瘤体积并绘制生长曲线,感染24 d后剥离肿瘤测量质量并计算抑瘤率,TUNEL染色检测各组小鼠肿瘤细胞凋亡情况,Western blotting法检测各组小鼠肿瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ及AMPK/mTOR通路相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR及p-mTOR表达水平。结果：与对照组和空载组比较,LL-37过表达组小鼠结肠癌HT-29细胞中LL-37 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,肿瘤质量和体积明显降低（P<0.05）,抑瘤率升高（P<0.05）,肿瘤细胞凋亡数减少,肿瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值均明显升高（P<0.05）,p-mTOR/mTOR比值明显降低（P<0.05）;与空载组比较,AMPK抑制剂组小鼠肿瘤质量和体积明显升高（P<0.05）、抑瘤率降低（P<0.05）,肿瘤细胞凋亡数减少,自噬相关蛋白Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值明显降低（P<0.05）,p-mTOR/mTOR比值明显升高（P<0.05）;与LL-37过表达组比较,联合组小鼠肿瘤组织中Beclin1和Atg5表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及p-AMPK/AMPK比值明显降低（P<0.05或P<0.01）,p-mTOR/mTOR比值明显升高（P<0.01）。结论：抗菌肽LL-37能激活AMPK/mTOR信号通路促进细胞自噬,进而抑制结肠癌HT-29荷瘤小鼠的肿瘤生长。     

二苯乙烯苷可抑制中波紫外线诱导的人皮肤成纤维细胞光老化

目的: 研究二苯乙烯苷（TSG）对紫外线B（UVB）诱导的人皮肤成纤维细胞（HSF）应激性提早衰老的作用及可能的机制。方法: UVB小剂量、多次照射HSF,每次照射完毕后分别用0.02、0.10、0.50 mmol/L浓度的TSG处理。实验分为6组：空白对照组、模型对照组、UVB+0.02 mmol/L TSG组、UVB+0.10 mmol/L TSG组、UVB+0.50 mmol/L TSG组、TSG对照组。采用细胞计数法（CCK-8）检测细胞增殖活性;细胞化学染色法检测衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）表达;TBA法、WST-1法测定细胞丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性;ELISA法测定细胞上清液中基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的含量变化。结果: 与空白对照组比较,模型对照组细胞增殖活性减弱（P < 0.05）,SA-β-gal染色呈强阳性,细胞裂解液中SOD活性减弱、MDA含量增加,MMP-1浓度升高（P < 0.05或P < 0.01）。与模型对照组比较,UVB+各浓度TSG组细胞增殖活性改善（均P < 0.05）,SA-β-gal染色阳性率下降,细胞裂解液中SOD活性增强、MDA含量减少,MMP-1浓度减小（P < 0.05或P < 0.01）。结论: TSG可以在一定程度上抑制UVB诱导的HSF应激性提早衰老,该作用可能与改善氧化应激、抑制MMP-1高表达有关。     

类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中c-FLIP与外源性凋亡途径的相关性分析

目的: 分析类风湿关节炎患者外周血单个核细胞（PBMC）中Fas相关死亡区样白介素1转换酶抑制蛋白（c-FLIP）与外源性凋亡途径相关蛋白死亡结构域蛋白（FADD）、caspase-8表达水平变化的相关性。方法: 选择2014年1月至2015年6月福建医科大学附属漳州市医院类风湿关节炎患者60例,按照类风湿关节炎疾病活动指数将患者分为低、中、高活动度组（分别为22、20和18例）。同时选择健康体检者25名作为健康对照组。采用实时定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测PBMC中c-FLIP、FADD和caspase-8的mRNA和蛋白表达水平,并采用Pearson检验对c-FLIP与FADD、caspase-8表达的相关性进行分析。结果: 类风湿关节炎患者PBMC中c-FLIP、FADD和caspase-8的mRNA表达量均高于健康对照组（均P < 0.05）。其中,中活动度组PBMC中FADD和caspase-8的mRNA表达量高于低活动度组（均P < 0.05）,c-FLIP的mRNA表达量与低活动度组相近（P>0.05）;高活动度组PBMC中c-FLIP的mRNA表达量高于中、低活动度组（均P < 0.05）,caspase-8的mRNA表达量低于中、低活动度组（均P < 0.05）,FADD的mRNA表达量高于低活动度组（P < 0.05）。类风湿关节炎患者PBMC中c-FLIP mRNA水平与FADD mRNA水平呈正相关（r=0.323,P < 0.05）,与caspase-8 mRNA水平呈负相关（r=-1.104,P < 0.05）。中活动度组c-FLIP和FADD蛋白表达量高于健康对照组、低活动度组和高活动度组（P < 0.05或P < 0.01）;中、高活动度组caspase-8蛋白表达量高于健康对照组和低活动度组（P < 0.05或P < 0.01）,且高活动度组caspase-8蛋白表达量高于中活动度组（P < 0.05）。结论: 类风湿关节炎患者PBMC中凋亡相关蛋白c-FLIP可能参与了外源性凋亡途径,并可为类风湿关节炎病情评估提供参考。     

雷帕霉素脑靶向制剂对大鼠癫痫的治疗作用

目的: 比较雷帕霉素靶向制剂与雷帕霉素普通制剂治疗癫痫的差异。方法: 制备脑靶向的雷帕霉素纳米粒。采用毛果芸香碱诱发大鼠癫痫发作。脑电描记术监测自发性癫痫的发作;蛋白质印迹法检测不同剂型雷帕霉素对mTOR信号通路的影响;Fluoro-Jade B染色观察海马区神经元活性;Timm染色观察海马区苔藓纤维出芽情况。结果: 脑靶向制剂可降低大鼠自发性癫痫发作频率,作用效果较普通制剂明显（P < 0.05）;以磷酸化S6K和S6为指征,脑靶向制剂比普通制剂雷帕霉素对mTOR信号通路异常激活的抑制作用更强（均P < 0.05）;脑靶向制剂可显著改善神经元凋亡,但与普通制剂无差异（P > 0.05）;脑靶向制剂可减少海马区苔藓纤维出芽,作用效果较普通制剂明显（P < 0.05）;脑靶向制剂对大鼠体质量增长的抑制作用较普通制剂减弱（P < 0.05）。结论: 雷帕霉素脑靶向制剂对癫痫的治疗作用优于普通制剂,且其不良反应小于普通制剂。     

JNK酶活性下调对人前列腺癌、肝细胞癌和乳腺癌细胞生长的抑制作用

目的：通过c-Jun氨基末端激酶（JNK）抑制剂SP600125和脂质纳米粒子包裹的JNK-siRNA 2种方法在体内和体外分别对JNK基因的表达进行干扰,探讨下调JNK酶活性在肿瘤治疗中的作用。方法：体外实验,将实验分为siRNA组和抑制剂SP600125组。在siRNA组中,使用JNK-siRNA及其对照NC-siRNA分别转染人前列腺癌细胞（PC细胞）、人肝细胞癌细胞（SMMC-7721细胞）和人乳腺癌细胞（MCF-7细胞）;在抑制剂SP600125组中将SP600125导入肝细胞癌细胞中,采用Western blotting法检测转染JNK-siRNA和SP600125后人前列腺癌、肝细胞癌和乳腺癌细胞中JNK或磷酸化JNK（p-JNK）蛋白表达水平;采用WST-1增殖实验检测各组肿瘤细胞的细胞活力。体内实验,通过皮下注射SMMC-7721细胞建立小鼠皮下肝细胞癌移植瘤动物模型,将8只小鼠饲养至肿瘤生长至3 mm×3 mm,再将模型小鼠随机分为抑制剂SP600125组和阴性对照组,JNK-siRNA组和NC-siRNA对照组,共4组,各组小鼠分别瘤内注射5 nmol SP600125、阴性对照溶液、脂质纳米粒子包裹的JNK-siRNA和NC-siRNA阴性对照,观察各组小鼠肿瘤体积;采用免疫组织化学染色检测肿瘤组织中JNK或p-JNK蛋白表达。结果：体外实验,与NC-siRNA对照组比较,JNK-siRNA组人前列腺癌、肝细胞癌和乳腺癌细胞中JNK蛋白表达水平降低（P<0.01）,抑制剂SP600125组肝细胞癌细胞中p-JNK蛋白表达水平较其阴性对照组明显降低（P<0.01）。体内实验,以肝细胞癌细胞为例,抑制剂SP600125组小鼠肿瘤体积较阴性对照组明显减小,而JNK-siRNA组与其阴性对照组比较肿瘤体积变化不明显。免疫组织化学染色,抑制剂SP600125组小鼠移植瘤组织中p-JNK蛋白表达量和JNK-siRNA组小鼠移植瘤组织中JNK蛋白表达量较各自阴性对照组降低（P<0.01）。结论：在体外和体内实验中下调JNK酶活性在体内和体外均能降低JNK基因的表达水平,进而抑制肿瘤细胞的生长。     

DRD2启动子低甲基化通过ERK通路调控乳腺癌细胞增殖

目的 研究肿瘤干细胞标志物多巴胺受体D2（dopamine receptor D2,DRD2）对乳腺癌细胞增殖的影响。方法 采用850K芯片对乳腺癌组织进行检测,并分析DRD2甲基化状态。采用基因筛选、基因敲除和甲基化抑制等技术和方法,进行体外和体内实验,筛选和验证可能存在的分子信号通路。结果 DRD2启动子区在乳腺癌组织中相较于正常组织表现为低甲基化。上调DRD2的表达后,乳腺癌细胞增殖增强,而下调DRD2的表达,乳腺癌细胞增殖显著降低。裸鼠实验发现,过表达DRD2可促进肿瘤生长和Ki67、CD31表达,下调DRD2可抑制肿瘤生长。体内外实验表明,细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）的表达受DRD2表达水平的影响,提示DRD2通过ERK信号通路发挥作用。甲基化抑制剂5-aza-2-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine,5-AzadC）在小鼠体内部分逆转了DRD2表达的下调,失去了对肿瘤细胞增殖的抑制作用,提示抑制DRD2甲基化促进了肿瘤的发展。结论 乳腺癌中DRD2启动子区发生低甲基化。DRD2通过ERK通路在乳腺癌细胞的增殖和迁移中发挥作用。     

非天然氨基酸定点偶联抗人类表皮生长因子受体2-抗体偶联药物的药理学活性

目的:考察用非天然氨基酸定点偶联技术获得的均一性良好的抗人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)-抗体偶联药物(antibody drug conjugate, ADC), 对9种不同HER2表达量的肿瘤细胞的增殖抑制活性,以及对5种异体移植的肿瘤小鼠模型的肿瘤生长抑制效果。方法:用QIFI试剂盒通过流式细胞仪检测HER2在BT-474、Calu-3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3、SK-OV-3、HCC1954、NCI-N87共9种肿瘤细胞中的表达。对9种肿瘤细胞进行培养,铺板过夜后分别加入梯度稀释的抗HER2-ADC、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、AS269、pAF-AS269、紫杉醇5种药物,然后培养72 h或96 h,检测这5种药物对肿瘤细胞的增殖抑制活性。选择HER2阳性肿瘤细胞HCC1954、BT-474、SK-OV-3、NCI-N87和HER2阴性肿瘤细胞MDA-MB-468,分别接种到5~6周龄的BALB/c裸小鼠身上,待肿瘤长到一定体积后,分别注射抗HER2-ADC、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、曲妥珠单抗、紫杉醇4种药物和空白对照磷酸盐缓冲液,考察药物的抑瘤效果。结果:流式细胞仪检测结果显示,SK-OV-3、NCI-N87、SK-BR-3、Calu-3、HCC1954、BT-474这6株肿瘤细胞的HER2表达量较高,每个细胞表面HER2受体数在43~80万个,比另外3株MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-468肿瘤细胞的HER2表达水平高50倍以上。药物对9种肿瘤细胞的增殖抑制活性结果显示,抗HER2-ADC对HER2高表达的细胞有很强的抑制细胞生长活性,对SK-OV-3、NCI-N87、SK-BR-3、Calu-3、HCC1954、BT-474的半数抑制浓度分别为46、17、17、161、125、50 pmol/L。在动物体内药效试验中,抗HER2-ADC在所有HER2阳性表达的肿瘤模型中都表现了较强的呈剂量依赖的抗肿瘤活性,在NCI-N87异种移植肿瘤模型中,与曲妥珠单抗及曲妥珠单抗-美坦新偶联物相比,相同剂量的抗HER2-ADC表现出更好的抗肿瘤活性,其相对肿瘤增殖率约为二者的1/30至1/20,在HCC1954模型中表现出肿瘤的完全消退和治愈效果;抗HER2-ADC对HER2低表达MDA-MB-468肿瘤细胞移植瘤模型没有效果。与曲妥珠单抗-美坦新偶联物相比,抗HER2-ADC表现出相同或更好的抗肿瘤活性。结论:用非天然氨基酸定点偶联技术获得的抗HER2-ADC在细胞体外和动物体内实验中对HER2高表达的肿瘤具有明显的抑制效果。     

人皮下和髌下脂肪垫干细胞治疗大鼠骨关节炎的疗效比较

 目的 比较人皮下和髌下脂肪垫干细胞体外增殖、成软骨分化潜能以及体内治疗大鼠骨关节炎的疗效差异。方法 获取上海市东方医院未患代谢性相关疾病患者的皮下和髌下脂肪垫组织,从髌下脂肪垫中分离原代脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）,体外诱导成脂、成骨、成软骨方向分化。EdU检测人皮下脂肪干细胞（subcutaneous ASCs,Sc-ASCs）和髌下脂肪垫干细胞（infrapatellar fat pad derived stem cells,IPFP-ASCs）体外增殖能力,流式细胞术检测干细胞表面标记蛋白CD34、血管相关标记蛋白CD31的表达。阿尔新蓝染色及Western blot检测Sc-ASCs和IPFP-ASCs体外成软骨潜能。体内实验采用8周SD大鼠随机分为对照（control,CON）组、内侧半月板不稳术（destabilisation of the medial meniscus,DMM）组和DMM手术后Sc-ASCs治疗组,DMM手术后IPFP-ASCs治疗组,通过大体观察、番红固绿染色及OARSI评分比较体内治疗效果。结果 人髌下脂肪垫组织中分离获得ASCs,形态呈长梭形,在体外具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。Sc-ASCs和IPFP-ASCs表面标记蛋白CD34和血管相关标记蛋白CD31表达无显著性差异,但人IPFP-ASCs体外增殖能力较强。阿尔新蓝染色及Western blot显示IPFP-ASCs体外成软骨能力较强。体内大鼠实验大体形态学观察显示DMM组骨赘增多,软骨表面缺损,Sc-ASCs治疗组骨赘减少,IPFP-ASCs治疗组表面较光滑,无明显骨赘生成;番红固绿染色显示DMM组软骨层出现垂直裂缝且到达钙化软骨,Sc-ASCs治疗组关节面纤维化且软骨浅表层存在垂直裂隙,IPFP-ASCs治疗组软骨层较为连续,仅存在轻微纤维化;OARSI评分显示IPFP-ASCs治疗骨关节炎疗效更好。结论 人IPFP-ASCs体外增殖能力、成软骨分化潜能以及体内治疗大鼠骨关节炎的效果优于Sc-ASCs。     

紫杉醇和吉西他滨对激素非依赖性前列腺癌的作用

目的 观察紫杉醇(PA)协同吉西他滨(GE)对前列腺癌细胞系PC-3的体内外作用,并探讨其可能的作用机制。方法 应用光镜形态学、噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪和免疫细胞化学法观察了10^-6、10^-7、10^-8 mol/L浓度PA和10^-7、10^-8、10-9 mol/L浓度GE在体外单药或协同对前列腺癌细胞系PC-3的作用、对细胞DNA含量及cyclin D1表达的影响。观察PC-3细胞荷瘤裸鼠单独及协同使用PA和GE前后的体质量、肿瘤质量、血清PSA和肿瘤PSA免疫组化的变化。结果 10^-8 mol/L以上浓度GE作用48 h,可增强10^-7 mol/L以上浓度PA对前列腺癌PC-3细胞系的生长抑制[抑制率≥(50.8±4.2)%,P<0.05],增强诱导凋亡作用[凋亡率≥(22.9±2.3)%,P<0.05],下调Cyclin D1的表达[表达率≤(9.6±1.6)%],与阳性对照组cyclin D1表达率(25.5±4.1)%相比差异有显著性(P<0.01)。GE使PA所致的G₂/M期细胞周期阻滞比例由(70.3±9.7)%减至(38.2±4.2)%,部分地逆转了其G₂/M期细胞周期阻滞(P<0.01)。协同治疗前后裸鼠体质量无明显变化,但肿瘤质量(3.2.±0.5 g)、血清PSA[(51±14) ng/ml]和肿瘤PSA免疫组化的表达率[(30±3.7)%]在协同治疗组显著低于其他组(P<0.05或0.01)。结论 PA和GE可以在体内外协同增强对前列腺癌细胞系PC-3的生长抑制和诱导凋亡作用,显示了PA和GE协同用于治疗激素非依赖性前列腺癌的可能性,并部分地解释了其作用机制。     

复层猪小肠黏膜下层可吸收膜的降解性能

目的 通过体内外实验研究复层猪小肠黏膜下层(multi-laminated small intestinal submucosa,mSIS)可吸收膜的降解性能,并与应用最为广泛的Bio-Gide可吸收生物膜进行比较,为其进一步应用于临床提供实验依据。方法 体外模拟降解采用胶原酶配制降解液,对mSIS膜和Bio-Gide膜进行降解,分别于不同时间点观察二者在降解液中的形态并取出称重,计算降解率。体内皮下埋植采用9只新西兰兔,每只动物背部皮下制备6个皮囊,分别埋入mSIS膜和Bio-Gide膜。于术后4、8、12周取材,通过肉眼观察及HE染色观察不同时间二者的降解程度及组织相容性。结果 体外降解实验显示mSIS膜在第12天降解完全,而Bio-Gide膜在第7天降解完全,且mSIS在降解液中维持形状的时间更长。皮下埋植4周时,mSIS膜和Bio-Gide膜形态相对完整,镜下观二者胶原纤维连续,膜周围少许炎症细胞浸润,Bio-Gide膜部分胶原纤维与周围组织融合。术后8周,mSIS膜形态基本完整,镜下观部分区域与结缔组织融合;肉眼观Bio-Gide膜已破碎,镜下仅可见部分残留纤维与周围组织结合,无完整膜的形态。术后12周时肉眼仅见少量mSIS膜残留碎片,镜下可见mSIS膜残留纤维,与周围结缔组织基本融合;肉眼及镜下观Bio-Gide膜均已消失。结论 mSIS膜皮下埋植降解时间约为12周,Bio-Gide膜约为8周,植入体内生物相容性良好。体外降解mSIS比Bio-Gide膜降解时间延长,且空间维持能力更佳。     

复层猪小肠黏膜下层可吸收膜的降解性能

目的 通过体内外实验研究复层猪小肠黏膜下层(multi-laminated small intestinal submucosa,mSIS)可吸收膜的降解性能,并与应用最为广泛的Bio-Gide可吸收生物膜进行比较,为其进一步应用于临床提供实验依据。方法 体外模拟降解采用胶原酶配制降解液,对mSIS膜和Bio-Gide膜进行降解,分别于不同时间点观察二者在降解液中的形态并取出称重,计算降解率。体内皮下埋植采用9只新西兰兔,每只动物背部皮下制备6个皮囊,分别埋入mSIS膜和Bio-Gide膜。于术后4、8、12周取材,通过肉眼观察及HE染色观察不同时间二者的降解程度及组织相容性。结果 体外降解实验显示mSIS膜在第12天降解完全,而Bio-Gide膜在第7天降解完全,且mSIS在降解液中维持形状的时间更长。皮下埋植4周时,mSIS膜和Bio-Gide膜形态相对完整,镜下观二者胶原纤维连续,膜周围少许炎症细胞浸润,Bio-Gide膜部分胶原纤维与周围组织融合。术后8周,mSIS膜形态基本完整,镜下观部分区域与结缔组织融合;肉眼观Bio-Gide膜已破碎,镜下仅可见部分残留纤维与周围组织结合,无完整膜的形态。术后12周时肉眼仅见少量mSIS膜残留碎片,镜下可见mSIS膜残留纤维,与周围结缔组织基本融合;肉眼及镜下观Bio-Gide膜均已消失。结论 mSIS膜皮下埋植降解时间约为12周,Bio-Gide膜约为8周,植入体内生物相容性良好。体外降解mSIS比Bio-Gide膜降解时间延长,且空间维持能力更佳。     

脱细胞猪心包膜生物相容性及成骨性能的体内外评价

目的: 体外检测作为引导性骨再生术(guided bone regeneration, GBR)屏障膜的脱细胞猪心包膜(acellular porcine pericardium,APP)的形貌特性及生物相容性。建立动物模型,检测其体内屏障软组织长入骨缺损的作用及对促成骨的影响。方法: 扫描电镜检测APP膜的超微结构。细胞增殖检测(cell counting kit-8,CCK-8)实验检测人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell, hBMSCs)接种于APP膜后第1、3、7天细胞增殖情况;接种后第5天,通过鬼笔环肽+DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)对细胞骨架及细胞核进行染色,观察hBMSCs的增殖及黏附情况。体内实验建立3只比格犬、18个实验位点的牙槽嵴保存动物实验模型,随机分入APP组(拔牙窝内植入Bio-Oss^®骨粉并覆盖APP膜)、BG组(拔牙窝内植入Bio-Oss^®骨粉并覆盖Bio-Gide^®膜)和空白组(自然愈合),术后4周和12周进行Micro-CT扫描检测各组成骨情况,脱钙后进行HE染色,组织学观察各组愈合情况。结果: 扫描电镜下APP膜具有致密及疏松双层非对称及三维多孔超微结构。体外实验证实APP膜可以促进hBMSCs的增殖及黏附,在接种后第7天APP组细胞数量显著高于BG组(P<0.05)。体内实验拔牙窝整体成骨情况:术后4周,3组新生骨比例差异无统计学意义(P>0.05);术后12周,APP组、BG组间新生骨比例差异无统计学意义(P>0.05),但均高于空白组(P<0.05)。冠方成骨情况:术后4周,APP组及BG组膜下方成骨显著高于空白组(P<0.05),组间差异无统计学意义(P>0.05);术后12周,APP组及BG组膜下方成骨显著高于空白组(P<0.05),组间差异有统计学意义(P<0.05)。颊侧骨嵴顶相对吸收量表明:术后4周,APP组显著低于空白组(P<0.05),BG组低于空白组,差异无统计学意义(P>0.05);术后12周,各组颊侧骨嵴顶继续降低,APP组相对吸收量仍显著低于空白组(P<0.05),BG组低于空白组,差异无统计学意义(P>0.05)。结论: APP膜具有良好的三维结构及细胞相容性,其在GBR中起到良好屏障软组织效果的同时,能够显著促进膜下方成骨及减少颊侧牙槽嵴顶吸收,推测其具有潜在的骨诱导能力。     

黄芩素通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路诱导膀胱癌细胞凋亡

目的 研究黄芩素对膀胱癌细胞的作用及机制。 方法 膀胱癌细胞T24和5637经黄芩素(处理组)或二甲基亚砜(对照组)处理后,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)以及胸腺嘧啶核苷类似物(EdU)插入实验检测细胞增殖和DNA复制速率;划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力;流式细胞技术检测细胞周期和细胞凋亡水平;Western blotting检测PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)等蛋白的表达水平;裸鼠成瘤实验检测黄芩素对于体内膀胱癌细胞增殖能力的影响。 结果 黄芩素可以在体内和体外抑制膀胱癌细胞的增殖速率,高浓度黄芩素体外抑制率可达80%以上,体内抑制率约50%。黄芩素可以减缓DNA复制并降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,诱导细胞停滞在G₀/G₁期,发生细胞凋亡,与对照组相比差异有统计学意义。黄芩素处理后,PI3K的表达以及AKT和mTOR的磷酸化水平降低,Bax/Bcl-2的比值升高。 结论 黄芩素通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制膀胱癌细胞增殖,发生周期阻滞,诱导细胞凋亡。