UBQLN1诱导上皮-间质转化促进食管鳞癌细胞的迁移和侵袭

目的分析泛醌蛋白1（UBQLN1）及上皮-间质转化（EMT）标志分子在食管鳞癌（ESCC）组织中的表达及其相关性,探讨UBQLN1对ESCC细胞迁移和侵袭的影响。方法 RT-qPCR和western blot检测ESCC癌组织及对应癌旁组织中UBQLN1的mRNA和蛋白表达;RT-qPCR检测ESCC癌组织及对应癌旁组织中EMT标志分子（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）的mRNA表达;构建UBQLN1 siRNA和过表达重组质粒,分别转染ESCC细胞系EC9706、HET-1A和TE-1;采用划痕试验和Transwell试验检测各细胞的迁移和侵袭能力;RT-qPCR和western blot检测各组EC9706细胞中EMT标志分子的mRNA和蛋白表达。结果 ESCC癌组织中UBQLN1的mRNA和蛋白表达均高于癌旁组织（均P<0.05）;ESCC癌组织中E-cadherin mRNA的表达低于癌旁组织（P<0.05）,而N-cadherin和Vimentin mRNA的表达均高于癌旁组织（均P<0.05）;ESCC组织中UBQLN1与E-cadherin的mRNA表达呈负相关（r=-0.517 3,P<0.001）,而与N-cadherin和Vimentin的mRNA表达呈正相关（r=0.780 3、0.685 6,P<0.001）。下调UBQLN1表达增加EC9706、HET-1A和TE-1细胞中E-cadherin的表达,降低N-cadherin和Vimentin的表达,抑制其迁移和侵袭,而过表达UBQLN1下调E-cadherin的表达,上调N-cadherin和Vimentin的表达,促进细胞迁移和侵袭。结论 UBQLN1能诱导EMT,促进ESCC细胞的迁移和侵袭。     

Talin1在输卵管妊娠患者的输卵管和绒毛中高表达并促进妊娠滋养细胞的侵袭

目的 验证Talin1在妊娠输卵管组织及输卵管妊娠绒毛中的表达差异及对HTR-8/SVneo细胞侵袭、迁移的影响,探讨其作用机制。方法 采用免疫组化及Western blot检测Talin1在妊娠输卵管组织及输卵管妊娠绒毛中的表达定位及蛋白表达差异;HTR-8/SVneo细胞内转染Talin1 siRNA,划痕实验及Transwell实验检测Talin1对HTR-8/SVneo细胞侵袭、迁移的影响;qRTPCR及Western blot检测HTR-8/SVneo细胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Snail的表达。结果 正常输卵管组织及妊娠输卵管组织中均可检测到Talin1的阳性表达,主要表达于纤毛细胞的细胞质中;妊娠输卵管组织中Talin1的蛋白表达高于正常输卵管组织（P<0.01）;输卵管妊娠绒毛中Talin1表达高于宫内妊娠绒毛（P<0.01）;沉默Talin1抑制HTR-8/SVneo细胞的侵袭（P<0.01）和迁移（P<0.05）;Talin1下调HTR-8/SVneo细胞中N-cadherin、MMP-2、Snail的表达（P<0.05）,上调MMP-9的表达（P<0.05）。结论 输卵管妊娠患者的输卵管组织及绒毛中Talin1的表达显著升高,输卵管妊娠的发生可能和Talin1调控妊娠滋养细胞的侵袭相关。     

siRNA干扰PDLIM1表达抑制胶质瘤细胞U87迁移与侵袭

目的 研究人PDZ和LIM域蛋白1(PDLIM1)特异性siRNA对人胶质母细胞瘤U87细胞系迁移、侵袭能力的影响,并对其相关机制进行初步探讨.方法 用小RNA干扰技术下调U87细胞PDLIM1,用荧光实时定量Real-time PCR技术验证siRNA干扰效率;采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力,采用Transwell实验检测细胞侵袭能力;用Western blot法检测细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达情况,并探讨相关机制.结果 经PD-LIM1-siRNA干扰后,胶质瘤U87细胞中PDLIM1在mRNA水平显著下调(P<0.001);与对照组相比,迁移和侵袭能力被显著抑制(P<0.001);PDLIM1基因表达下调后,U87细胞中EMT相关蛋白N-cadherin、β-catenin、Slug下调.结论 PDLIM1通过EMT相关转录因子Slug调节N-cadherin、β-catenin蛋白表达,是其调节胶质瘤U87细胞迁移及侵袭能力的可能机制之一.     

长链非编码RNA-MALAT1调控miR-22/snail轴对胃癌增殖、迁移及侵袭的影响

目的：探讨长链非编码RNA MALAT1（long non-coding RNA MALAT1,lnc RNA MALAT1）调控miR-22/snail轴对胃癌增殖、迁移及侵袭的影响。方法：采用siRNA干扰技术抑制MALAT1表达,同时过表达miR-22和Snail;采用RT-PCR检测MALAT1,miR-22和snail在胃癌细胞系中的表达水平（n=3）;采用Western blot检测NC组、si-MALAT1组中snail蛋白的表达水平（n=3）;采用CCK-8法在12、24、48、72 h检测NC组、si-MALAT1组、miR-22组、miR-22+snail组、si-MALAT1+miR-22组中细胞吸光度值（n=3）;采用划痕实验检测NC组、si-MALAT1组、miR-22组迁移速度（n=3）;采用Transwell检测NC组、si-MALAT1组、miR-22组、miR-22+snail组、si-MALAT1+miR-22组穿过膜细胞的个数（n=3）;采用双荧光素酶检测NC+pMIR-MALAT1-WT组、NC+pMIR-MALAT1-MUT组、miR-22+pMIR-MALAT1-WT组、miR-22+pMIR- MALAT1-MUT、NC+ pMIR-Snail-WT组、NC+pMIR-Snail-MUT组、miR-22+pMIR-Snail-WT组、miR-22+pMIR-Snail-MUT组的荧光活性（n=3）。两独立样本间的比较采用t检验,多组数据之间的比较采用单因素方差进行分析,涉及时间因素时采用重复测量方差分析。结果：MALAT1在胃癌细胞系中的表达水平明显高于正常胃黏膜上皮细胞（均P=0.000）;低表达MALAT1后,AGS和SGC-7901增殖能力（P1=0.001,P2=0.005）,迁移能力（P1=0.018,P2=0.007）,侵袭能力（P1=0.024,P2=0.015）均降低;同时双荧光素酶结果显示MALAT1能够靶向结合miR-22（P=0.001）,miR-22能够靶向结合snail（P=0.001）;miR-22在胃癌细胞中的表达水平明显低于正常胃黏膜上皮细胞（均P<0.05）;过表达miR-22后,AGS和SGC-7901增殖能力（P1=0.004,P2=0.009）,迁移能力（P1=0.034,P2=0.005）,侵袭能力（P1=0.037,P2=0.011）均降低;在低表达MALAT1和过表达miR-22后能够更进一步增加低表达MALAT1后对AGS和SGC-7901的增殖（P1=0.022,P2=0.006）和侵袭（P1=0.024,P2=0.015）的抑制作用;同时过表达miR-22和snail后能够反转miR-22对AGS和SGC-7901的增殖（P1=0.003,P2=0.004）和侵袭（P1=0.015,P2=0.01）的抑制作用。结论：MALAT1在胃癌细胞中明显高表达,并能通过调控miR-22/snail轴促进胃癌增殖、迁移及侵袭。     

SHOX2体外增强膀胱癌细胞的迁移、侵袭和干细胞特性

目的 探讨人矮小同源盒基因2（SHOX2）对人膀胱癌细胞迁移、侵袭能力和干细胞特性的影响及其可能机制。方法 分析TCGA肿瘤数据库中SHOX2基因在膀胱癌标本和癌旁对照标本的表达情况,利用GEPIA网站对TCGA膀胱数据中的SHOX2基因表达量进行单因素生存分析,并利用GSEA软件预测其可能的生物学功能。选取对数生长期的人膀胱癌细胞T24,采用SHOX2 shRNA及SHOX2过表达质粒分别敲低、过表达SHOX2基因,用Western blot检测SHOX2蛋白表达量,通过划痕实验、Transwell侵袭实验检测细胞的迁移、侵袭能力,悬浮成球、克隆形成实验检测细胞的干细胞特性。在光镜下观察细胞形态变化,并用Western blot检测细胞上皮间充质转化（EMT）标志分子E-cadherin、Vimentin蛋白表达量的变化和TGF-β信号通路重要组件TβR-I蛋白表达量的变化。结果 与癌旁膀胱组织相比,SHOX2基因在TCGA膀胱癌组织中表达升高（P=0.01）,在配对的膀胱癌组织中明显升高（P=0.001）,SHOX2基因表达与总生存率呈负相关（P=0.01）;GSEA显示SHOX2基因表达与EMT（P=0.002,P=0.03）及干细胞特性（P=0.006,P=0.008）呈正相关。在膀胱癌细胞 T24 中,两种不同的 SHOX2 shRNA 均能降低SHOX2的蛋白表达水平（shSHOX2-1,P=0.004;shSHOX2-2,P=0.03）,SHOX2过表达质粒则能提高SHOX2的蛋白表达水平（P=0.007）。划痕实验、Transwell侵袭实验结果显示,抑制SHOX2表达后膀胱癌细胞的迁移（P<0.001,P=0.02）、侵袭（P=0.002,P=0.003）能力明显降低,而SHOX2过表达则提高膀胱癌细胞的迁移（P<0.001）、侵袭（P=0.004）能力。悬浮成球、克隆形成实验结果显示,抑制SHOX2表达后明显减弱膀胱癌细胞的干细胞特性（P=0.002,P=0.007,P<0.001）;而SHOX2过表达则增强膀胱癌细胞的干细胞特性（P=0.002,P<0.001）。此外,抑制SHOX2表达可使细胞发生上皮样形态改变,而SHOX2过表达可使细胞发生间充质样形态改变;Western blot结果显示,抑制SHOX2表达可使膀胱癌细胞中的E-cadherin蛋白表达水平升高（P<0.00）,Vimentin（P<0.001,P=0.01）、TβR- I（P=0.03,P=0.02）蛋白表达水平降低;而 SHOX2 过表达可使膀胱癌细胞中的Vimentin（P=0.04）、TβR-I（P=0.003）蛋白表达水平升高。结论 SHOX2在膀胱癌中扮演致癌基因：SHOX2增强膀胱癌细胞的迁移、侵袭能力和干细胞特性,其作用机制可能与TGF-β信号通路参与调控的EMT有关。     

CD155依赖m6A修饰调控宫颈癌细胞的恶性行为

目的:探究CD155在宫颈癌中的作用和依赖m6A修饰的调控机制。方法:应用数据库预测宫颈癌细胞中CD155（PVR）的表达情况，CD155对患者预后的影响，运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法测定宫颈癌细胞HeLa和宫颈永生细胞S12中CD155的表达水平。分别运用MTT、平板克隆、迁移侵袭等实验评估CD155对宫颈癌细胞HeLa生长、增殖、迁移和侵袭的影响。应用Western印迹法测定E-钙黏蛋白（E-cad）和波形蛋白（Vimentin）的表达水平并评价CD155对EMT的影响。MeRIP-RT-qPCR检测CD155是否受m6A 调控，Western印迹法和qRT-PCR测定METTL3是否影响CD155蛋白和RNA的表达水平。放线菌素D处理细胞后检测METTL3对CD155RNA半衰期的作用，利用预测网站m6ATaget预测CD155RNA甲基化位点的识别者（Reader），运用Western印迹法和qRT-PCR分析YTHDF1是否影响CD155蛋白和RNA的表达水平，放线菌素D处理细胞后检测YTHDF1对CD155RNA半衰期的作用，RIP-RT-qPCR实验进一步确定YTHDF1和YTHDF1-mut对CD155RNA下拉能力。结果: CD155在宫颈癌组织和细胞中表达较高，体内高表达CD155的患者生存率较低。相比S12细胞，HeLa细胞中CD155的表达增加（t=3.749，P<0.05）。CD155的高表达促进了体外宫颈癌细胞的生长（t=3.152，P<0.05）、增殖（t=3.706，P<0.05）、迁移（t=5.422，P<0.01）和侵袭（t=3.599，P<0.05），抑制E-cad的表达促进了Vimentin的表达。MeRIP-RT-qPCR结果显示CD155RNA受m6A调控，METTL3促进了CD155蛋白和RNA（t=6.725，P<0.05）的表达，敲降METTL3之后CD155RNA半衰期降低（t=5.622、6.063、5.857，均P<0.05）。敲降YTHDF1之后CD155的蛋白水平降低，CD155RNA半衰期降低（t=10.93、5.602、4.359，均P<0.05）。在YTHDF1高表达的细胞中，CD155RNA被有效免疫沉淀（t=4.686，P<0.01），但在YTHDF1-mut转染的细胞中，免疫沉淀结果显示下拉的CD155RNA水平明显降低（t=4.462，P<0.05）。结论:CD155RNA在m6A修饰的情况下，被YTHDF1特异性识别，进而稳定性增强和翻译增加，CD155表达增加促进了宫颈癌细胞的恶性行为。     

沉默YAP1可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力

目的探究沉默Yes 相关蛋白1（YAP1）对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法采用实时荧光定量PCR和 Western blot方法检测YAP1在鼻咽癌细胞系中的表达水平;在鼻咽癌细胞S26和S18中转染3条合成的小干扰RNA：si-NC, si- YAP1#1和si-YAP1#2,以转染阴性对照si-NC的细胞作为对照组,转染si-YAP1#1和si-YAP1#2的细胞作为实验组,实时荧光定 量PCR和Western blot检测转染后的干扰效率;通过细胞计数、平板克隆形成等方法评估转染si-YAP1#1和si-YAP1#2后的实验 组和转染si-NC的对照组对鼻咽癌细胞增殖能力的影响;用划痕和Transwell 方法分析各组细胞迁移与侵袭能力的变化; Western blot检测各组细胞中c-myc、上皮性钙黏蛋白（E-cadherin）、神经性钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）等与细 胞增殖和上皮间质转化相关蛋白的表达变化。结果YAP1在鼻咽癌细胞系中高表达;与阴性对照组相比,转染si-YAP1#1和si- YAP1#2的实验组细胞中YAP1的mRNA及蛋白水平均显著降低（P<0.05）;生长计数、平板克隆、划痕及Transwell等实验结果 均显示转染si-YAP1#1和si-YAP1#2的实验组细胞的生长和克隆能力、划痕愈合能力及侵袭能力较阴性对照组细胞明显下降 （P<0.01）;且相较阴性对照组,实验组细胞中c-myc、N-cadherin和Vimentin等蛋白的表达水平降低,E-cadherin的表达量增加。 结论YAP1在鼻咽癌细胞系中高表达,在鼻咽癌细胞中利用siRNA靶向敲低YAP1的表达后可以抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移 及侵袭能力,提示YAP1可以作为一个潜在的鼻咽癌临床治疗干预靶点。     

miR-let-7c-5p通过靶向HMGA2抑制膀胱癌细胞侵袭和迁移

目的 探讨miR-let-7c-5p能否调控HMGA2抑制膀胱癌细胞侵袭和迁移。方法 生物信息学方法确定miR-let-7c-5p的关键基因;RT-qPCR和Western blot检测膀胱癌和癌旁组织中miR-let-7c-5p mRNA和HMGA2 蛋白相对表达量。以人正常膀胱细胞SV-HUC-1作为对照,RT-qPCR和Western blot检测膀胱癌细胞系T24,UM-UC-3,5637细胞中miR-let-7c-5p mRNA和HMGA2蛋白的相对表达量。对UM-UC-3细胞中miR-let-7c-5p分别进行上调和下调,上调实验设模拟物阴性对照组（mimic-NC）、miR-let-7c-5p模拟物组（mimicmiR-let-7c-5p）、下调实验设阴性对照组（inhibitor NC）及miR-let-7c-5p抑制剂组（si-miR-let-7c-5p）,双荧光素酶实验、RT-qPCR和Western blot法共同验证miR-let-7c-5p和HMGA2的靶向关系;Transwell小室检测单独上调或下调miR-let-7c-5p表达及同时下调miR-let-7c-5p和HMGA2表达UM-UC-3细胞侵袭和迁移的变化;Western blot检测上皮间质转化（EMT）相关蛋白（E-cadherin, N-cadherin, vimentin, Snail）相对表达量。结果 HMGA2为miR-let-7c-5p的靶基因之一;与癌旁组织相比,膀胱癌组织中miR-let-7c-5pmRNA相对表达量降低（P<0.05）,HMGA2蛋白相对表达量增加（P< 0.05）;与SV-HUC-1细胞相比,UM-UC-3细胞中miR-let-7c-5p相对表达量显著降低,HMGA2显著增加（P=0.01）。上调miR-let-7c-5p表达,UM-UC-3细胞侵袭和迁移能力均显著下降（P<0.05）;下调miR-let-7c-5p表达,UM-UC-3细胞侵袭和迁移能力均显著增加（P<0.05）;当同时下调miR-let-7c-5p和HMGA2表达UM-UC-3细胞侵袭和迁移能力显著下降（P<0.05）。Western blot结果显示,上调miR-let-7c-5p表达,E-cadherin表达增加,N-cadherin,vimentin,Snail蛋白表达下降;下调miR-let-7c-5p表达,E-cadherin表达下降,N-cadherin,vimentin,Snail蛋白表达增加;同时下调miR-let-7c-5p和HMGA2表达能够抑制UM-UC-3细胞EMT（P<0.05）。结论 miR-let-7c-5p通过靶向HMGA2抑制EMT进而抑制UM-UC-3细胞侵袭和迁移。     

siRNA干扰相互作用蛋白1表达抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移

目的探讨小干扰RNA（siRNA）干扰降低PC4和SFRS1相互作用蛋白1（PSIP1）的表达对人胶质瘤U87细胞侵袭和迁移 的影响并初步探讨其机制。方法采用化学合成靶向PSIP1的siRNA,脂质体法转染U87细胞,用Real-time PCR检测RNA干 扰效率;Transwell侵袭实验测细胞侵袭能力;划痕实验检测其迁移能力;干扰PSIP1表达后,Western blot 检测间质细胞来源的 N-cadherin、β-catenin蛋白和转录因子Slug的表达。结果PSIP1-siRNA 转染胶质瘤U87细胞后,PSIP1的mRNA水平及蛋白 水平明显下降（P<0.001）,U87 细胞侵袭和迁移能力下降,与阴性转染组及未转染组相比差异有统计学意义（P<0.001,P< 0.001）,Western blot 显示,间质细胞来源的N-cadherin、β-catenin 蛋白表达量降低,同时与上皮间质转化（EMT）相关的转录因 子Slug 的表达降低。结论在胶质瘤中,抑制PSIP1 的表达可抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移,N-cadherin、β-catenin 蛋白和转录 因子Slug的表达量降低,提示PSIP1 可通过调控经典Wnt/β-catenin 信号通路来调节Slug 的表达,进而调控EMT,从而参与胶 质瘤U87 细胞的侵袭及迁移。     

Mmp-2重组真核表达载体的构建及MMP-2蛋白对肝癌细胞的作用机制探讨

目的：构建人基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP-2）基因重组真核表达载体,探讨MMP-2蛋白对肝癌细胞迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法：以肝癌SMMC-7721细胞为研究模型,以基因重组技术构建pEYFP-Mmp-2重组真核表达载体,pEYFP-Mmp-2一过性转染模型细胞过表达MMP-2-YFP,siRNA转染沉默模型细胞内源性MMP-2表达,设立空白对照、MMP-2沉默对照组、MMP-2沉默组、过表达MMP-2融合蛋白对照组、过表达MMP-2融合蛋白组,划痕实验检测细胞迁移能力,侵袭小室实验检测细胞侵袭能力,钙蛋白酶（calcium-activated neutral protease,Calpain）特异性抑制剂Calpeptin抑制Calpain活性,蛋白印记实验检测MMP-2、MMP-2-YFP、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vi－mentin）表达变化。结果：成功构建人Mmp-2重组真核表达载体pEYFP-Mmp-2。pEYFP-Mmp-2转染过表达MMP-2融合蛋白组细胞高表达MMP-2-YFP。与MMP-2沉默对照组相比,MMP-2沉默组内源性MMP-2表达明显下调（P=0.000）,细胞12 h、24 h及48 h迁移率明显降低（P=0.000或P=0.001）,48 h侵袭率明显降低（P=0.004）,E-cadherin表达明显上调,N-cadherin及Vimentin表达明显下调（P=0.000）。与过表达MMP-2融合蛋白对照组相比,过表达MMP-2融合蛋白组12 h、24 h及48 h迁移率明显增强（P=0.015或P=0.001）,48 h侵袭率明显升高（P=0.011）,细胞E-cadherin表达明显下调,N-cadherin及Vimentin表达明显上调（P=0.003或P=0.001）。Calpeptin预处理明显降低过表达MMP-2融合蛋白组细胞迁移率和侵袭率（P=0.000）,上调E-cadherin,下调N-cadherin及Vimentin蛋白表达水平（P=0.000）。结论：本实验通过基因重组技术成功构建人Mmp-2重组真核表达载体pEYFP-Mmp-2,成功表达MMP-2-YFP 融合蛋白;并发现MMP-2通过调节Calpain介导肝癌SMMC-7721细胞迁移、侵袭及EMT。     

LATS2对恶性周围神经鞘瘤细胞的调控作用及分子机制探讨

目的:探讨大肿瘤抑制激酶2（LATS2）对恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞增殖和迁移的影响及机制。方法:LATS2过表达慢病毒感染ST88-14、STS26T细胞,实验分为阴性对照组及LATS2过表达组,利用CCK-8、细胞划痕实验检测过表达LATS2对细胞增殖、迁移的影响。实时荧光定量RT-PCR和免疫印迹实验检测细胞中LATS2、多梳抑制复合物2（PRC2）核心组分、Yes相关蛋白（YAP）、含有PDZ结合位点的转录共激活因子（TAZ）的mRNA和蛋白表达,以及组蛋白H3第27位赖氨酸上的三甲基化（H3K27me3）水平。结果:与对照组相比,LATS2过表达抑制ST88-14、STS26T细胞增殖（t=4.219、14.66、11.5,均P<0.05;t=5.674、7.118、10.77,均P<0.01）、迁移（t=4.838、4.736,均P<0.01）。与对照组相比,LATS2过表达不影响ST88-14、STS26T细胞中YAP/TAZ的mRNA和总蛋白水平,但升高其蛋白磷酸化水平（t=6.233、3.759,均P<0.01;t=3.44、2.947,均P<0.05）。与对照组相比,LATS2过表达不影响ST88-14、STS26T细胞中PRC2核心组分SUZ12、EZH2、EED的mRNA和蛋白水平,但H3K27me3水平明显升高（t=6.569、16.68,均P<0.01）。结论:LATS2在MPNST细胞系中表达下降,过表达LATS2升高H3K27me3表达水平,同时促进YAP/TAZ的磷酸化,从而抑制MPNST细胞的增殖、迁移,在MPNST中发挥肿瘤抑制因子的作用。     

MST1与YAP1在食管疾病中的表达及意义

目的 探讨哺乳动物绝育20样激酶1（MST 1）、Yes相关蛋白1（Y AP1）在不同类型食管疾病中的表达、临床意义及两者之间的关系。方法 应用免疫组织化学染色方法,检测MST1、YAP1在食管炎、BARRETT食管、食管不典型增生及食管癌组织中的表达。结果 MST1、YAP1在食管炎、BARRETT食管、食管不典型增生及食管癌组织中的表达差异有显著性（V2=41 9.38、60.255,P〈0.05）。MST1、YA P1在食管癌中表达与病人性别、年龄无关（P〉0 0.5）,而与组织分化程度及淋巴结转移有关（V2=5 6.83～9.038,P〈0 0.5）。MS T1与Y AP1在食管癌组织的表达呈负相关（r=-0.451,P〈0 0.5）。结论 MST1、YAP1可能在食管炎到食管癌的发病过程中起关键作用,可为食管癌的预防、治疗和预后判断提供新的靶点。     

膀胱移行细胞癌尿沉渣RASSF1A基因启动子的甲基化状况及意义

目的 探讨膀胱癌患者尿沉渣细胞中RASSF1A基因启动子CpG岛的甲基化状况及其临床意义.方法 选取病理确诊的39例膀胱癌标本,采用甲基化特异PCR方法检测膀胱癌肿瘤组织和配对的尿沉渣RASSF1A基因启动子CpG岛的甲基化异常频率,同时以45例非肿瘤性泌尿系疾病患者及14例健康志愿者的相关检测情况作为对照,分析膀胱肿瘤患者RASSF1A基因异常甲基化的情况.结果 膀胱癌组RASSF1A基因启动子甲基化阳性率（61.5%,24/39）显著高于非肿瘤组（4.4%,2/45）（P〈0.01）,非肿瘤组与志愿组间（阳性率为0）并无明显差异（P＞0.05）;尿沉渣RASSF1A基因甲基化对膀胱癌诊断的敏感性为61.5%（24/39）,特异性为95.6%（43/45）.性别、年龄、病理分级及临床分期与RASSF1A基因甲基化均无明显相关性（均P＞0.05）.膀胱癌肿瘤组织RASSF1A基因启动子甲基化阳性率为69.2%（27/39）.膀胱癌肿瘤组织和配对的尿沉渣同时出现RASSF1A基因甲基化为20例,同时仅出现非甲基化为8例,两者明显相关（P〈0.05）.结论 RASSF1A基因异常甲基化可能是膀胱癌的早期事件,其异常甲基化状态可能成为非侵入性诊断膀胱癌的分子标志物之一.     

吉非替尼通过促进H3K27甲基化水平抑制恶性周围神经鞘瘤细胞的增殖

目的:研究表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂吉非替尼（gefitinib）对恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞增殖、迁移的影响。方法:选择STS26T细胞、ST88-14细胞,分为对照组和给药组（10 μmol/L）,其中药物IC50实验、蛋白印迹实验给药组浓度分为5、10、15 μmol/L。CCK-8法检测吉非替尼对STS26T、ST88-14的半数抑制浓度并绘制药物IC50曲线;平板克隆形成实验检测吉非替尼对细胞增殖能力的影响;划痕实验检测吉非替尼对细胞迁移能力的影响;实时荧光定量PCR检测加药后各组细胞Kras、SUZ12、EED、EZH2 mRNA的表达情况;蛋白印迹实验检测加药后Kras、组蛋白H327位赖氨酸三甲基化蛋白（H3K27me3）的表达。结果:STS26T、ST88-14细胞的药物IC50曲线显示半数抑制浓度均为10 μmol/L（t=11.42、16.51,均P＜0.05）;与对照组比较,吉非替尼给药组（10 μmol/L）STS26T、ST88-14细胞增殖能力显著降低（t=5.48,P＜0.05;t=4.89,P＜0.01）、细胞迁移能力显著降低（t=4.94,P＜0.01;t=4.75,P＜0.01）;与对照组比较,吉非替尼给药组（10 μmol/L）STS26T细胞中Kras mRNA表达显著降低（t=4.87,P<0.01）,SUZ12、EED、EZH2表达显著升高（t=11.36、15.54、13.19,均P＜0.05）;与对照组比较,吉非替尼给药组（10 μmol/L）ST88-14细胞中Kras mRNA表达显著降低（t=13.75,P<0.05）,SUZ12、EED、EZH2表达水平显著升高（t=12.56、7.48,16.33,均P＜0.05）;与对照组比较,吉非替尼给药组（5、10、15 μmol/L）STS26T、ST88-14细胞Kras蛋白表达显著降低（t=13.70、15.21,均P<0.05）;与对照组比较,吉非替尼给药组（5、10、15 μmol/L）STS26T、ST88-14细胞H3K27me3蛋白表达显著增加（t=14.31、12.40,均P<0.05）。结论:EGFR抑制剂吉非替尼通过促进MPNST中PRC2的表达,提高表观遗传学标志物H3K27me3的表达,降低MPNST细胞株增殖、迁移的能力。     

NFATc1对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和上皮间质转化的影响

目的:检测活化T细胞c1核因子(NFATc1)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移和上皮间充质转化(EMT)的影响.方法:qRT-PCR检测NSCLC细胞H1650、H460、H1299及正常人支气管上皮细胞BEAS-2B中NFATc1表达水平,将si-NFATc质粒转染至H1650细胞中,通过CCK-8增殖及集...     

Axin1调节骨骼肌GLUT4蛋白表达的作用研究

目的：探讨体轴发育抑制因子（Axin1）调节骨骼肌葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)蛋白表达的作用及其机制。方法：利用RNAi干扰的Axin1腺病毒（Ad-siAxin1）感染C2C12小鼠骨骼肌细胞敲低Axin1,荧光显微镜和MTS实验明确Ad-siAxin1最佳感染浓度和时间。分别用携带绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-GFP）、Ad-siAxin1、载体质粒（vector）和Axin1质粒转染C2C12小鼠骨骼肌细胞敲低或过表达Axin1蛋白,Western印迹检测Axin1、端锚聚合酶蛋白（TNKS）和GLUT4蛋白水平。结果：荧光显微镜和MTS实验结果显示,在C2C12小鼠骨骼肌细胞中Ad-siAxin1作用的最佳浓度和时间分别为160μL和48 h。Western印迹结果显示,与Ad-GFP组相比,Ad-siAxin1组中Axin1蛋白降低（t=6.746,P<0.01）。Ad-siAxin1组TNKS蛋白水平降低（t=4.019,P<0.05）,GLUT4蛋白水平下调（t=3.248,P<0.05）。与vector组相比,转染Axin1质粒后,Axin1蛋白水平上...     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589抑制基底样乳腺癌生长和转移

目的：探究组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对基底样乳腺癌（BLBC）生长和转移的抑制作用。方法：通过MTT法和平板克隆实验检测LBH589对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞系4T1增殖能力的影响;Transwell实验检测LBH589对细胞迁移和侵袭能力的影响;实时荧光定量PCR和免疫印迹实验检测LBH589对细胞上皮-间质转化的作用;构建4T1乳腺癌细胞Balb/c小鼠脂肪垫成瘤模型,腹腔注射LBH589,观察4T1细胞成瘤和转移能力。结果：体外实验结果显示,与对照组相比,LBH589显著抑制MDA-MB-231和4T1细胞的增殖能力（t=11.37,P<0.05;t=18.18,P<0.05）、克隆形成能力（t=7.76,P<0.05;t=15.22,P<0.05）、迁移（t=8.8,P<0.05;t=18.0,P<0.05）和侵袭能力（t=8.24,P<0.05;t=15.99,P<0.05）;与对照组相比,LBH589上调细胞的上皮标志物CDH1的mRNA(t=7.33,P<0.05)表达水平,抑制细胞的...     

白细胞介素4诱导蛋白1促进肾癌进展的实验研究

目的：探讨白细胞介素4诱导蛋白1(IL4I1)在肾透明细胞癌中的表达及在肿瘤发展中的作用。方法：通过数据库分析IL4I1在正常肾组织和肾透明细胞癌组织中的表达及与预后的关系;通过qPCR和FCM比较正常肾细胞HK-2与肾癌细胞系786-O和769-P中IL4I1的表达情况;siRNA干扰786-O细胞系IL4I1表达后通过CFSE增殖实验及细胞划痕实验探究细胞生物学行为的改变;通过GSEA分析和qPCR探究潜在机制。结果：IL4I1在肾透明细胞癌组织中过表达（P<0.001）,提示更短的总生存期（P<0.001）。IL4I1在肾癌细胞系786-O中mRNA及蛋白水平均过表达（t=16.83、280.40,均P<0.001）。干扰IL4I1表达后,786-O细胞增殖速度减慢,迁移能力下降（F=97.45,P<0.001）,并伴随细胞间黏附分子-1(ICAM1)、血管内皮生长因子A(VEGFa)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、程序性细胞死亡蛋白-1(PD-L1)表达水平降低（t=9.031、8.613、9.066、12.66,均P<0.05）。GSEA分析显示...     

宫颈癌细胞PAX1基因甲基化的CRISPR靶向调控系统的构建

目的:建立PAX1基因甲基化的CRISPR靶向调控系统。方法:首先,通过甲基化特异性PCR（MSP）测定宫颈癌细胞系（CaSki,SiHa）及正常细胞（人胚肾细胞HEK293T）中 PAX1基因启动子的DNA甲基化水平;通过荧光定量PCR（RT-PCR）和免疫印迹（Western blotting）分别检测上述细胞系的mRNA及蛋白表达。然后,在PAX1高甲基化的宫颈癌细胞共转染sgRNA（single guide RNA）和dCas9-Tet1质粒,采用焦磷酸测序（Pyrosequencing）和 RT-PCR分别检测其基因甲基化和表达水平的改变。最后,结合生物信息学预测和RT-PCR评估该CRISPR系统的脱靶效应。结果:与HEK293T细胞相比,宫颈癌细胞的PAX1基因启动子呈现高甲基化,且其mRNA（CaSki:t=9.13;SiHa:t=12.31;P<0.05）和蛋白表达水平（CaSki:t=16.72;SiHa:t=11.81;P<0.05）均降低。在CaSki及SiHa细胞系中,去甲基化sgRNA3（act-sgRNA3）组调控最显著,其PAX1基因的甲基化水平在CaSki和SiHa细胞系中分别下降了22.21%（t=6.65,P<0.05）、19.62%（t=17.00,P<0.05）,其mRNA表达水平均显著上调（P<0.05）。且该系统脱靶效应基因的表达差异均小于2倍。结论:本研究成功建立了PAX1基因甲基化的CRISPR靶向调控系统,可有效的降低其甲基化水平,增强其内源性的表达水平。