胞浆表达绿色荧光蛋白的伯氏疟原虫的构建和筛选

目的:为了追踪疟原虫发育及侵染的情况,构建及筛选胞浆稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的伯氏疟原虫。方法:构建含有伯氏疟原虫230p基因和GFP基因的重组质粒pL0035-GFP,质粒线性化后通过电转染转入野生型伯氏疟原虫;基于双交换同源重组原理,利用乙胺嘧啶筛选获得在230p基因处插入GFP的重组疟原虫;有限稀释法筛选表达GFP的单克隆重组伯氏疟原虫;PCR鉴定重组疟原虫基因型,荧光显微镜和流式细胞术检测GFP表达情况。结果:PCR及DNA测序结果表明GFP基因成功整合到伯氏疟原虫基因230p;荧光显微镜可观察到重组疟原虫胞浆呈绿色荧光,流式细胞术检测到绿色荧光信号。结论:成功构建胞浆表达绿色荧光蛋白的伯氏疟原虫。     

伯氏疟内质网塑形蛋白SEY1敲除质粒的构建及转染

目的:为了研究重要内质网塑形蛋白SEY1在疟原虫致病性方面的作用,本研究构建敲除伯氏疟原虫PbSEY1的质粒,结合疟原虫转染技术筛选PbSEY1缺失疟原虫突变体。方法:选取PbSEY1编码区中相邻的两个片段作为同源臂进行PCR扩增,并引入特定酶切位点,借助T4 DNA连接酶和In-Fusion无缝克隆的方法将其插入载体pL0034中;利用疟原虫同步化培养及电转染技术将该质粒转入疟原虫,基于基因同源重组原理在疟原虫中敲除PbSEY1并进行药物筛选。结果:（1）获得可用于基因敲除及回复实验的重组质粒pL0034-△PbSey1;（2）在伯式疟原虫中敲除PbSEY1。结论:利用重组质粒pL0034-△PbSey1和疟原虫转染技术初步获得PbSEY1缺失疟原虫突变体,为进一步研究PbSEY1在疟原虫致病性中的作用提供了必要工具。     

转基因伯氏疟原虫的建立及报告基因表达的初步研究

目的:通过转染含有绿色荧光蛋白(GFP)和PbfMSP1片段的重组质粒,建立伯氏疟原虫转染技术和表达恶性疟原虫MSP-1 19 000片段(PfMSP1-19)的转基因伯氏疟原虫.方法:构建重组转染质粒PyrFlu/PbfMSP1.伯氏疟原虫ANKA株经培养和分离后用电转化方法转入重组转染质粒,药物筛选转化原虫后进行PCR检测,并于荧光显微镜下检测报告基因GFP的表达.结果:构建了重组转染质粒PyrFlu/PbfMSP1.荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的伯氏疟原虫.PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在GFP和PbfMSP1基因.结论:重组质粒已成功转染伯氏疟原虫并表达了GFP报告基因,建立了伯氏疟原虫转染技术.     

伯氏疟原虫静息巯基氧化酶表达阶段的确定

目的 观察伯氏疟原虫静息巯基氧化酶(PbQSOX)的表达阶段及表达特点.方法 分别采用SignalP-5.0 Server与TMHMM Server 2.0在线软件对PbQSOX蛋白的信号肽与跨膜区进行预测分析.利用同源重组技术,将PbQSOX-HA标签型打靶质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切使其线性化,将线性化的质粒电转染至伯氏疟原虫株内并感染小鼠.经乙胺嘧啶筛选耐药型疟原虫血症小鼠,取小鼠外周血进行PCR鉴定,获取PbQSOX-HA标签型疟原虫.培养纯化裂殖体、配子体与动合子阶段的PbQSOX-HA标签型疟原虫,采用蛋白质印迹法与间接免疫荧光实验检测PbQSOX蛋白在伯氏疟原虫中的表达阶段与表达特点.结果 生物信息学分析发现PbQSOX蛋白存在信号肽,不存在跨膜区,蛋白均在细胞膜外表达.经PCR鉴定,PbQSOX-HA标签型打靶质粒与伯氏疟原虫同源重组正确,并成功获得了PbQSOX-HA标签型疟原虫及纯化的PbQSOX-HA标签型裂殖体、配子体与动合子.蛋白质印迹法检测显示PbQSOX蛋白主要在配子体与动合子阶段表达,间接免疫荧光实验结果显示PbQSOX表达于配子体、雄配子、合子、retort与动合子表面.结论 PbQSOX是伯氏疟原虫在有性生殖阶段表达的蛋白,主要表达于配子体、雄配子、合子、retort与动合子表面.     

鼠伯氏疟原虫CSP基因真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

目的分别构建携带绿色荧光蛋白报告基因的伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei)环子孢子(CSP)全长基因和去除中央重复序列的CSP的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在Hela细胞中的表达。方法采用PCR技术,从伯氏疟原虫基因组中扩增全长CSP基因,将其定向克隆入pEGFP-N1,构建pEGFP/PbCSP全长基因重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定;同样,采用PCR技术扩增PbCSP的N端和C端两个片段,先将C端片段定向克隆入pEGFP-N1,构建pEGFP/PbCSP-C重组质粒,再将PbCSPN端片段定向克隆入pEGFP/PbCSP-C,构建pEGFP/PbCSP'重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定。将pEGFP/PbCSP和pEGFP/PbCSP′分别用脂质体介导转染体外培养的Hela细胞,荧光显微镜及RT-PCR检测融合蛋白的表达。结果PCR、酶切及测序证实目的基因PbCSP全长和片段分别正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,两种重组质粒转染Hela后,荧光显微镜及RT-PCR均检测到目的蛋白在Hela中表达。结论成功构建了携带绿色荧光蛋白报告基因的伯氏疟原虫CSP全长基因和该基因片段的融合蛋白真核表达质粒,并在Hela细胞中获得表达。     

5种疟原虫红内期可溶性蛋白质图谱比较

目的　比较 5种疟原虫 (间日疟原虫、恶性疟原虫、食蟹猴疟原虫、约氏疟原虫、伯氏疟原虫 )红内期可溶性蛋白电泳图谱。方法　用 1%NP - 40提取 5种疟原虫红内期可溶性蛋白组分。各种蛋白提取物经十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)后氨银染色 ,所得蛋白图谱经光密度扫描进行分析。结果　 5种疟原虫蛋白区带波峰位置和大小各不相同 ,显示较大差异。但有两个区带为 5种疟原虫共有区带 ,其分子量分别为 72KD和6 4KD。在 5种疟原虫中 ,以伯氏疟原虫与约氏疟原虫蛋白区带相似性最高。结论　 5种疟原虫红内期蛋白组分差异较大 ,伯氏疟原虫与约氏疟原虫种间进化关系较接近     

一种简便高效制备伯氏疟原虫蛋白的实验方法

目的：探讨建立简便有效的大量制备鼠伯氏疟原虫蛋白的方法.方法：采集伯氏疟原虫感染晚期的大鼠外周血经肝素抗凝,通过白细胞滤器过滤去除白细胞,再使用30%阿拉伯胶溶液经密度梯度离心法分离含虫红细胞,经皂素溶血,收集纯化的原虫,虫体经超声波破碎后离心,上清液经SDS-PAGE电泳分析.采用蛋白凝胶灰度扫描方法分析蛋白电泳条带的分布.结果：从大鼠含虫外周血可分离制备出大量的可溶性疟原虫蛋白,对大鼠分离的疟原虫可溶性蛋白与小鼠来源的原虫可溶性蛋白比较,两种蛋白的电泳图谱完全相同.结论：利用大鼠模型可简便高效地制备大鼠伯氏疟原虫,结合超声波破碎法可提取足量的可溶性疟原虫蛋白抗原.     

转基因疟原虫的研究进展

疟原虫的转染过程是将克隆有外源基因序列的质粒导入疟原虫细胞中,转化入细胞中的质粒或以游离体的形式存在,或插入到疟原虫的染色体中。随着转基因技术的逐渐成熟,近10年来,已经在恶性疟原虫[1](Plasmodiumfalciparum,P.f)、伯氏疟原虫[2](Plamodium berghei,P.b)、偌氏疟原虫     

重组质粒pcDNA4-FLAG-GLUT1构建及蛋白表达

目的:为探究葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）磷酸化水平对红细胞期疟原虫生长发育的影响，构建必要的分子工 具。方法:以pcDNATM4/TO/myc-His B为载体，构建在GLUT1第一个胞外区插入2×FLAG标签的重组质粒pcDNA4- 2×FLAG-GLUT1。将重组质粒转染到NIH/3T3细胞中，利用Western印迹和流式细胞术分别检测细胞FLAG-GLUT1蛋白总量 和细胞表面FLAG-GLUT1的表达水平。结果:酶切鉴定及DNA测序表明正确构建重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1。通过识 别FLAG标签，利用Western印迹能够检测到FLAG-GLUT1在NIH/3T3细胞中的表达，流式细胞术结果显示，转染重组质粒 的细胞表面可检测到FLAG-GLUT1的表达，阳性群比例为（21.46 ± 2.375）%，明显高于对照组（0.01±0.00）%，差 异有统计学意义（t=9.035，P<0.01）。结论:成功构建重组质粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1，为研究GLUT1蛋白磷酸化在 疟原虫感染红细胞中的作用提供了必要的工具。     

基于CRISPR/Cas9的PALM基因敲除约氏疟原单克隆虫株的构建

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建并鉴定Plasmodium yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆虫株。方法：根据PlasmoDB数据库中的约氏疟原虫P.yoelii 17XNL PALM基因序列信息,设计引物与sgRNA。PCR扩增左、右同源臂,将同源臂和sgRNA与载体pYCm-golden-blue连接,构建用于基因敲除的CRISPR工具质粒pYCm-PALM KO。pYCm-PALM KO CRISPR质粒电转染至P.yoelii 17XNL裂殖体,尾静脉注射感染小鼠,24 h后采血查获疟原虫后,给予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水进行药物压力筛选基因敲除疟原虫。此后每2天鼠尾采血涂片镜检疟原虫,喂药8 d时提取疟原虫基因组DNA进行PCR鉴定,最终经测序确定是否发生PALM基因敲除。将已证实存在PALM基因敲除疟原虫的鼠血采用有限稀释法接种小鼠,8 d后采血镜检疟原虫,PCR鉴定,筛选获取单克隆虫株。将获取的PALM基因敲除的单克隆虫株和P.yoelii 17XNL各接种至6只昆明小鼠体内,每只接种1×10⁵感染疟原虫的红细胞(iRBC)...     

EB病毒LMP2-LMP1Δ融合基因免疫效果的初步研究

目的构建EBV LMP2-LMP1Δ融合基因,初步观察融合基因体内诱导EBV特异性细胞免疫应答的效果。方法 （1）应用PCR方法构建包含EBV-LMP2全长和去除致癌基因的EBV-LMP1Δ融合基因,并将融合基因插入到pcDNA3.1（＋）-his真核表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ,Western blot和免疫荧光方法检测融合蛋白的表达。（2）使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ及携带LMP1Δ和LMP2基因的重组腺病毒单独或联合免疫Balb/c小鼠,末次免疫1周后应用IFN-γELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV特异性CTL水平。结果 （1）真核表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ能够在293细胞中表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,融合蛋白分子量大小正确,具有免疫原性。（2）重组质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ免疫小鼠能够诱导出EBV特异性的CTL,但诱导的CTL水平很低,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数只有12个,远远低于LMP1Δ、LMP2重组腺病毒平均495个斑点数的免疫结果。但使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ和重组腺病毒联合免疫,与只使用重组腺病毒相比,诱导的EBV特异性CTL水平能够显著提高,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数可达1 001个（P〈0.01）。结论构建的EBV LMP2-LMP1Δ融合基因能够有效表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,并能够在小鼠体内诱导出EBV特异性的CTL反应,与重组腺病毒联合使用,可以提高特异性CTL应答水平。     

大鼠TCF4和ΔTCF4重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的：构建腺病毒表达载体Ad-TCF4和Ad-ΔTCF4（缺失了β-catenin结合位点）,并初步鉴定其在间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）中的表达,为进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在MSCs中的功能以及应用MSCs进行干细胞移植和基因治疗奠定基础。方法：以MSCs的cDNA为模板,扩增TCF4和ΔTCF4基因,将基因序列定向克隆至穿梭质粒载体pShuttle-CMV后,转化含pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得重组腺病毒载体Ad-TCF4和Ad-ΔTCF4。PCR以及PacⅠ酶切鉴定后,Ad-TCF4和Ad-ΔTCF4转染QBI-293A进行包装和扩增。检测重组载体的病毒滴度以及感染MSCs的最适病毒复数（multiplicity of infection,MOI）,并探讨Ad-TCF4和Ad-ΔTCF4在MSCs中的表达以及对迁移的影响。结果：成功构建Ad-TCF4和Ad-ΔTCF4,病毒滴度分别为1.1×107pfu/mL和1.3×107pfu/mL,150 MOI病毒感染MSCs的效率达到90%以上;蛋白质印迹和TOPFlash/FOPFlash报告基因检测显示TCF4在MSCs中表达增加,并具有调节下游靶基因转录的活性;Boyden小室迁移实验发现感染Ad-ΔTCF4能显著抑制MSCs向LiCl的迁移能力,而感染Ad-TCF4并不能提高MSCs的迁移能力。结论：成功构建Ad-TCF4和Ad-ΔTCF4,能高效感染MSCs并正确表达。     

恶性疟原虫PfRh5F2片段pTGub21b表达载体的构建及融合蛋白表达鉴定

目的克隆表达恶性疟原虫网状细胞结合蛋白同源体5(PfRh5)F2片段,并评价其抗原性。方法 PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pTGub21b中,构建PfRh5F2/pTGub21b原核表达载体。IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,并用Western blot检测其抗原性。结果成功构建了PfRh5F2/pTGub21b原核表达系统,并在大肠杆菌中可溶性高效表达,表达产物能被恶性疟患者血清识别,而重组抗原免疫鼠血清也能识别恶性疟患者血样中的相应抗原。结论恶性疟原虫PfRh5 F2片段在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性。     

WWOX基因慢病毒载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的：构建及鉴定WWOX基因慢病毒载体,观察WWOX基因在人卵巢癌PEO1细胞株中的表达,为进一步研究WWOX基因的作用机制及其功能奠定基础。方法：采用PCR技术从克隆质粒模板中获得全长WWOX基因,将WWOX基因亚克隆到慢病毒载体PCDH—CMV—MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX,通过双酶切验证后,慢病毒表达质粒与慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG,pPACKH1-REV,Pvsv-G共转染293T细胞,获得携带WWOX基因及EGFP基因的重组慢病毒Lenti WWOX,并转染靶细胞人卵巢癌PEO1细胞株。通过RT—PCR和Western Blot验证Lenti WWOX在PEO1细胞株中的表达。结果：测序结果显示成功构建重组慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX;表达质粒与辅助包装质粒共转染包装细胞293T后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞PEO1,转导效率约为60％,有WWOX基因mRNA和蛋白水平的高表达。结论：本实验成功构建了携带WWOX基因慢病毒表达载体,包装成病毒后能有效感染卵巢癌PEO1细胞。     

HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化及应用研究

目的在原核系统中表达全长HIV-1p24抗原,对其抗原性进行鉴定,探讨其对HIV早期诊断的价值。方法利用PCR技术从含有HIV-1gag基因质粒PTM-1中扩增p24蛋白基因,通过酶切消化后连接到表达载体pET28a上,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,表达p24抗原。通过ELISA和Westernblotting（WB）法检测表达产物的免疫反应活性及特异性。结果PCR产物和构建的重组质粒pET28a—p24经双酶切均显示约690bpDNA片段,与预期p24抗原全基因片段大小-致。SDS—PAGE电泳可见纯化蛋白为1条相对分子量约26x10,Mr的外源表达蛋白带,与预期大小-致。ELISA及WB实验证实表达的p24抗原具有较好的活性及特异性。时间分辨荧光免疫双抗体夹心法显示与市售p24抗原线性-致。结论构建了HIV-1p24／pET28a原核高效表达系统,表达产物与市售的p24抗原具有相似的抗原性。     

shRNA干扰肝癌细胞Kir6.2基因表达对细胞内钙离子浓度的影响

目的研究shRNA干扰肝癌SK-Hep1细胞Kir6.2基因表达及对细胞内钙离子浓度的影响。方法脂质体转染法将shRNA质粒载体pGenesil-3共转染SK-Hep1细胞，实验分为SK组（未转染）、HK组（阴性对照）、K1组（干扰序列1）和K2组（干扰序列2）。经G418筛选出单克隆培养，RT-PCR和Western Blotting分别检测Kir6.2 mRNA和蛋白的表达，筛选出抑制Kir6.2表达的有效序列。Fluo4-AM孵育各组细胞，流式细胞仪检测荧光强度。结果RT-PCR结果显示K1、K2组Kir6.2 mRNA的表达与HK、SK组比较均降低。K1、K2组Kir6.2蛋白的量与HK、SK组比较均降低。K1和K2组钙离子浓度远远低于SK和HK组。结论shRNA抑制了肝癌细胞Kir6.2基因的表达，钙离子浓度显著降低。