记忆相关基因KIBRA 抑制Aβ 诱导的神经元凋亡研究

目的：为了明确记忆相关基因KIBRA 在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）转基因动物模型中是否存在表达改变及及其对神经元凋亡的影响,进而探讨KIBRA 如何参与Aβ诱导的神经元凋亡及其相关机制。方法：本研究首先通过免疫组织染色及免疫蛋白印迹的方法,观察在不同月龄APP/PS1 小鼠中是否存在KIBRA 的表达改变。其次,通过TUNEL 免疫荧光染色,观察在KIBRA 基因敲除小鼠中是否存在神经元凋亡。最后,我们使用CRISPR/CAS9 慢病毒及过表达慢病毒分别转染HT22 细胞,建立KIBRA 基因敲除和KIBRA 过表达细胞模型,进而探讨KIBRA 对Aβ诱导的神经元凋亡及其相关机制的研究。结果：①KIBRA 在APP/PS1 转基因小鼠脑内特异性表达：选用9 月龄及12 月龄APP/PS1 小鼠作为AD 研究模型,通过KIBRA 免疫组织染色分析,无论整个海马,还是海马亚区CA1 区和CA3 区,9 月龄和12 月龄APP/PS1 小鼠KIBRA 阳性细胞数量均明显低于对照组,其中12 月龄尤为显著（P<0.01,P<0.001）。免疫蛋白印迹结果同样证实12 月龄APP/PS1 小鼠海马区KIBRA 的表达明显低于野生型小鼠（P<0.001）。随着月龄的增加,KIBRA在APP/PS1 转基因小鼠海马区的表达逐渐减少,提示KIBRA 在AD 小鼠海马区的特异性降低,与学习记忆障碍密切相关。②KIBRA 在神经元凋亡中的重要作用：通过TUNEL 荧光染色发现,与野生型小鼠相比,12 月龄APP/PS1 小鼠海马神经元凋亡比例明显增多（P<0.01,P<0.01）。4 月龄KIBRA 基因敲除小鼠海马神经元凋亡比例比野生型小鼠明显增加（P<0.05）,提示KIBRA 在神经元凋亡的发生中扮演不可或缺的角色。③KIBRA 对Aβ诱导的神经元凋亡的保护作用：CCK8及免疫蛋白印迹结果显示,与空病毒组相比,经1 μmol·L-1 的Aβ1-42 寡聚体处理后的KIBRA 敲除组细胞活力明显降低（P<0.01）;凋亡相关蛋白（剪切的PARP、活化的caspase3）的表达量明显增高（P<0.05,P<0.01）。KIBRA 过表达组细胞存活率明显优于空病毒组（P<0.05）,凋亡相关蛋白较空病毒组显著减少（P<0.05）,进一步提示KIBRA 参与抑制Aβ诱导的神经元凋亡,促进细胞增殖和存活。4. KIBRA 通过激活Akt 信号通路抑制Aβ诱导的神经元凋亡：本实验筛选凋亡相关信号通路,结果显示,在1 μmol·L-1 Aβ1-42 寡聚体处理1 min 后,KIBRA 敲除组Akt Ser473 位点磷酸化水平比空病毒组显著降低（P<0.05）。在Aβ1-42 寡聚体处理1 分钟后,KIBRA 过表达组Akt Ser473 位点磷酸化明显被激活,Akt Ser473 位点磷酸化水平比空病毒组显著增高（P<0.01）。此外,与Aβ1-42 寡聚体干预组相比,Akt 特异性抑制剂（MK2206）预处理组KIBRA 过表达细胞存活率明显降低（P<0.05）;剪切的PARP 表达量明显增高（P<0.05）。以上结果表明KIBRA 通过激活Akt Ser473 位点的磷酸化水平,抑制Aβ诱导的神经元凋亡。结论：KIBRA 作为一种神经保护因子,通过激活Akt 信号通路抑制Aβ诱导的神经元凋亡,促进细胞增殖及存活,为AD 发病机制及治疗药物的研究提供了新的靶点。     

异氟醚对缺锌APP/PS1转基因阿尔茨海默病模型小鼠海马神经元凋亡的影响

目的：研究吸入麻醉药异氟醚对缺锌APP/PS1转基因小鼠海马神经元凋亡的影响,探讨其相关作用机制。方法：8和9月龄APP/PS1转基因小鼠随机分为常锌组、常锌+异氟醚组、缺锌组和缺锌+异氟醚组,每组24只。常锌组小鼠给予正常锌含量饮食2个月;常锌+异氟醚组小鼠给予正常锌含量饮食2个月后接受1.4%异氟醚麻醉2 h;缺锌组小鼠给予低锌饮食1个月;缺锌+异氟醚组小鼠给予低锌饮食1个月后接受1.4%异氟醚麻醉2 h。分别在麻醉后6和24 h杀鼠取海马组织,采用免疫荧光双染法检测海马神经元凋亡率,Western blotting法检测海马β淀粉样蛋白（Aβ）、活化型半胱氨酸天门冬氨酸特异性蛋白酶3（Cleaved caspase-3）表达水平和Bax/Bcl-2比值。结果：与常锌组比较,常锌+异氟醚组小鼠麻醉后6 h海马神经元凋亡率、Cleaved caspase-3表达水平和Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05或P<0.01）,麻醉后24 h海马神经元凋亡率总Aβ、Aβ40和Aβ42表达水平无明显改变（P>0.05）;缺锌组和缺锌+异氟醚组小鼠麻醉后6和24 h海马神经元凋亡率、Aβ42表达水平、Cleaved caspase-3表达水平和Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05或P<0.01）。与缺锌组比较,缺锌+异氟醚组小鼠麻醉后6和24 h海马神经元凋亡率、Aβ42和Cleaved caspase-3表达水平及Bax/Bcl-2比值进一步升高（P<0.05或P<0.01）。结论：10月龄常锌APP/PS1转基因小鼠给予1.4%异氟醚麻醉2 h能够短暂加重其海马神经元凋亡;1.4%异氟醚麻醉2 h能够明显加重缺锌APP/PS1转基因小鼠海马神经元凋亡,其作用机制可能与促进海马Aβ42聚集、增强Bax表达、抑制Bcl-2表达和激活Caspase-3有关。     

复方丹参片对老年痴呆症合并焦虑障碍的研究

目的：探讨复方丹参片对老年痴呆症合并焦虑障碍的作用及机制。方法：4 月龄野生型小鼠和APP/PS1 转基因小鼠分别灌胃给予溶剂或复方丹参片60 天后,采用Morris 水迷宫实验、新物体识别实验、新奇抑制摄食实验和高架十字迷宫实验评价复方丹参片对APP/PS1 转基因小鼠学习记忆功能和焦虑样行为的影响;应用ELISA 检测小鼠海马淀粉样蛋白Aβ40、Aβ42、γ- 氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）和脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）的含量;Real time PCR 和Western Blot 分别检测IDE/NEP 的mRNA 和蛋白水平变化。结果：复方丹参片720 mg·kg-1 明显短缩小鼠在水迷宫实验中找到平台的潜伏期,360 mg·kg-1 和720 mg·kg-1 明显增加小鼠原有平台象限的探索时间;复方丹参片720 mg·kg-1 可显著性增加APP/PS1 转基因小鼠对新物体的识别指数;复方丹参片360 mg·kg-1、720 mg·kg-1 显著性增加APP/PS1 转基因小鼠在高架十字迷宫中开臂的时间百分比和进入开臂的次数;复方丹参片360 mg·kg-1、720 mg·kg-1 显著性缩短APP/PS1 转基因小鼠摄食潜伏期;复方丹参片360 mg·kg-1、720 mg·kg-1 显著性降低APP/PS1 转基因小鼠海马Aβ40、Aβ42 的浓度和增加GABA 和BDNF 含量;复方丹参片720 mg·kg-1 显著性上调APP/PS1 转基因小鼠海马IDE、NEP mRNA 的表达;复方丹参片720 mg·kg-1 显著性增加小鼠海马IDE 蛋白表达。结论：复方丹参片改善APP/PS1 转基因小鼠的学习记忆损伤和焦虑样行为,可能与增加脑组织GABA 和BDNF 含量、IDE 的蛋白表达及降低Aβ40、Aβ42 水平有关。     

新型小分子化合物OAB-14 改善AD 模型动物认知障碍作用及机制研究

目的：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）发病机制复杂，相关假说众多。尽管存在争议，Aβ毒性假说仍是最为公认的主要致病机制之一。据报道，抗肿瘤药贝沙罗汀能够快速清除AD 模型小鼠脑内Aβ并改善学习记忆障碍，但其不良反应严重。我们参考贝沙罗汀合成了一系列化合物，并从中筛选出一个新型小分子化合物OAB-14。本研究旨在考察OAB-14 对AD 模型小鼠学习记忆障碍的改善作用及对神经元和突触可塑性的影响，并从Aβ生成、清除两个方面考察OAB-14 对Aβ的作用。方法：采用8 月龄APP/PS1 双转基因小鼠，灌胃给予OAB-14（50、100 和200 mg·kg-1）、贝沙罗汀（100 mg·kg-1）或溶剂，连续给药15 天。给药第6 天开始依次进行新物体辨别、Y 迷宫、Morris 水迷宫实验。采用Western Blot 方法考察OAB-14 对Aβ生成相关蛋白、Aβ降解酶、突触相关蛋白、M1/M2 型小胶质细胞标志物、神经炎症因子、ApoE 通路相关蛋白及ApoE亚型的影响；采用非变性凝胶电泳考察酯化ApoE 的水平；采用免疫组化和Thio-S 检测Aβ沉积；ELISA 法测定可溶和不溶性Aβ1-40、Aβ1-42 含量；采用免疫荧光对小胶质细胞和Aβ进行共定位；透射电镜检测海马CA1 区神经元细胞核、线粒体、突触超微结构。结果：模型组小鼠在新物体辨别、Y 迷宫、Morris 水迷宫实验中表现出显著的形象辨别记忆、工作记忆和空间学习记忆障碍；社会交往实验中主动接触时间缩短，社会交往能力下降；筑巢实验中生活自理能力也显著下降。与模型组相比，OAB-14 能剂量依赖性地改善APP/PS1 小鼠形象辨别记忆、工作记忆、空间学习记忆障碍，提高小鼠社会交往能力及生活自理能力。OAB-14 200 mg·kg-1 连续给药15 d，对Aβ生成相关蛋白APP、ADAM10、BACE-1、PS1 的表达没有显著影响，提示OAB-14 可能不影响Aβ的生成。OAB-14 显著增加Aβ降解酶NEP、IDE 的表达；增加ApoE、ABCA1、ABCG1 的表达，提高酯化ApoE 水平，增加小胶质细胞吞噬Aβ。提示OAB-14 可能通过活化ApoE 通路，并提高Aβ降解酶的表达，增加脑内可溶性Aβ的清除。OAB-14 还能显著提高小胶质细胞表面受体CD36 的表达，从而促进对纤维化Aβ的清除。OAB-14 促进小胶质细胞由促炎的M1 型向抗炎、吞噬的M2 型转换，在增加其对Aβ清除的同时，减少炎症因子的表达。透射电镜结果显示，OAB-14 能促进APP/PS1 小鼠海马神经元细胞损伤的修复，改善突触超微结构，增加NeuN 标记的神经元细胞数及NeuN 蛋白表达。OAB-14 可显著增加ApoE3 的表达，降低ApoE4 的表达，增加H3 的乙酰化水平，活化BDNF通路，提高突触相关蛋白SYP、GAP43、PSD95 的表达。结论：OAB-14 能显著改善APP/PS1 双转基因小鼠的学习记忆障碍，减少脑内Aβ沉积，其机制可能与增加Aβ降解酶表达，活化ApoE 通路，提高小胶质细胞对Aβ的清除有关。同时，OAB-14 能减少海马神经元丢失及提高突触可塑性，这可能与减少Aβ对神经元的毒性以及活化BDNF/TrkB/raf/ERK 信号通路有关。本课题的研究为将OAB-14 开发为抗AD 新药提供了药效学依据。     

金钗石斛生物碱抗老年痴呆基础研究

研究目的：探究金钗石斛生物碱（Dendrobium nobil Lindl Alkaloids,DNLA）抗老年痴呆作用及作用机制。方法：采用右侧脑室注射脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）或Aβ25-35 制备大鼠学习记忆功能减退模型、APP/PS1 转基因阿尔茨海默病模式小鼠动物模型,以及Aβ25-35 或氧糖剥夺诱导的大鼠原代神经元损伤细胞模型,通过行为学、组织形态学、免疫荧光、PCR、Western blot等技术手段,围绕学习记忆改变、炎症、tau 蛋白磷酸化、Aβ清除、自噬等评价DNLA 的抗老年痴呆作用及作用机制。结果：在LPS 诱导的大鼠学习记忆减退模型,预防性给予DNLA（20,40,80 mg·kg-1）,大鼠逃避潜伏期和搜索距离缩短,神经元坏死凋亡显著改善,其机制可能与降低海马caspase3/8 mRNA 表达、减少Aβ1 -42 产生、减轻海马Tau 蛋白磷酸化有关,值得注意的是DNLA
（80 mg·kg-1）的作用与甾体类抗炎药布洛芬相似,提示DNLA 的改善记忆作用与抗炎作用有关,后续研究发现DNLA 可抑制p-p38 MAPK 和NF-κB 通路降低炎症因子TNF-α及其受体TNFR1 的表达。在Aβ25-35 诱导的大鼠痴呆模型,给予DNLA 后可改善大鼠空间学习成绩,明显减少海马组织Aβ1-42 的含量,降低β- 淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）和BACE1 蛋白在海马组织的表达,另外,DNLA 可预防Aβ25-35 诱导的小鼠海马神经元及其突触缺失,该效应至少与增加其海马与皮质脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子及睫状神经营养因子等有关。在APP/PS1 转基因阿尔茨海默病模式小鼠,DNLA 可通过诱导神经元自噬改善模式小鼠空间学习记忆能力。离体细胞实验发现DNLA 抑制氧糖剥夺诱导的大鼠神经元细胞活力降低,减轻细胞凋亡,降低细胞膜通透性,改Aβ25-35 诱导的神经元轴突变性,作用机制与降低［Ca2+］i、增高MMP水平、下调caspase-3/12 基因表达、诱导自噬有关。结论：DNLA 可改善LPS 或Aβ25-35 诱导的大鼠学习记忆功能减退模型、APP/PS1 转基因阿尔茨海默病模式小鼠的学习记忆功能,作用机制与抗炎、抗凋亡、诱导自噬,减少Aβ沉积和tau 蛋白磷酸化等有关。     

APP/PS1转基因小鼠大脑内锌转运蛋白3的表达

目的研究锌转运蛋白3(ZnT-3)在APP/PS1转基因小鼠大脑皮质及海马内的分布和表达变化。方法应用免疫组织化学技术检测ZnT-3在APP/PS1转基因小鼠脑内的分布,并应用Western blot方法分析ZnT-3在大脑皮质及海马的表达水平。结果ZnT-3主要分布于APP/PS1转基因小鼠脑内的老年斑中,且主要定位于老年斑周围变性的神经元及其突起内;ZnT-3在APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马的表达均明显高于野生型小鼠。结论ZnT-3在APP/PS1转基因小鼠大脑内的高表达以及在老年斑内的定位,提示ZnT-3可能在老年斑内锌离子的聚集过程中起着重要的调节作用,进而参与了APP/PS1转基因小鼠大脑内Aβ老年斑的形成。     

史他汀类药物对抗β- 淀粉样肽神经毒性的非胆固醇依赖性作用机制实验研究

目的：研究史他汀类药物通过其非胆固醇依赖性作用对抗β- 淀粉样蛋白（Aβ）的 过程中β- 淀粉样肽前体蛋白（APP）代谢、尼古丁型乙酰胆碱受体（nAChRs）表达以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路的相互作用关系，探讨史他汀类药物对阿尔茨海默氏病（AD）的可能性干预途径。方法：选择原代培养神经细胞及过表达APP670/671 的SHSY-5Y 细胞，用史他汀类药物（包括洛伐他汀、阿托伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀）、Aβ、nAChR 拮抗剂或细胞外信号调节白白激酶（ERK）抑制剂分别或合并处理。用生化方法测定细胞存活率、胆固醇含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量；用蛋白印迹法检测nAChR 多种亚单位蛋白表达水平，APP 代谢途径中α分泌型淀粉样前体蛋白（αAPP）、β分泌型淀粉样前体蛋白（βAPP）、β淀粉样前体蛋白裂解酶1（BACE1）、β淀粉样前体蛋白裂解酶2（BACE2）及解聚素金属蛋白酶结构域蛋白10 （ADAM10）等的蛋白表达水平，MAPK 通路中ERK、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）及p38 磷酸化水平；实时荧光定量PCR 测定nAChR 亚单位mRNA 表达水平。结果：用Aβ或Aβ寡聚体处理体外培养神经细胞48 小时后见细胞存活率下降、SOD 的活性降低和MDA含量增高等毒性作用，用史他汀类药物预处理细胞24 小时，均能减轻Aβ引起的神经毒性作用。用洛伐他汀处理培养细胞24 小时后，发现α7 nAChR 蛋白及mRNA 表达水平均升高，而α4、α3 和bβ2 未见明显改变；洛伐他汀处理引起αAPP 分泌增加、βAPP减少、BACE1 蛋白表达水平降低、而BACE2 和ADAM10 增高。洛伐他汀处理亦导致phospho-ERK1/2 蛋白表达水平升高，而phospho-JNK 和phospho-p38 未见明显改变。联合应用洛伐他汀与MAPK/ERK1/2 抑制剂U0126 或α7 nAChR 拮抗剂MLA 处理培养细胞，结果显示U0126 可以抑制细胞phospho-ERK1/2 的磷酸化，降低α7 nAChR 蛋白表达水平，减少αAPP 的分泌，同时阻断洛伐他汀引起的MAPK/ERK1/2 信号转导通路活化、α7 nAChR 蛋白表达水平升高以及αAPP 分泌增加等作用；MLA 处理神经细胞仅能减少αAPP 的分泌，对其自身的蛋白表达及phospho-ERK1/2 的磷酸化均无明显影响，MLA 与洛伐他汀共同处理细胞后仅见洛伐他汀诱导的αAPP 分泌增加作用被减弱，而MAPK/ERK1/2 的活化以及α7 nAChR 蛋白表达水平的上调均未被减弱。结论：采用不引起细胞胆固醇水平改变的史他汀类药物剂量处理培养细胞，能减轻Aβ引起神经细胞毒性作用，引起MAPK/ERK1/2 信号转导通路活化、α7 nAChR 蛋白表达水平升高以及αAPP 分泌增加；其作用机制可能是首先活化phosphor-ERK1/2 信号转导通路，该通路的活化刺激α7 nAChR 的表达，最终增强APP 的非淀粉样代谢过程，活化α- 分泌酶，从而促进αAPP 的分泌，产生对抗Aβ的神经保护作用。     

药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀对阿尔茨海默病的治疗作用研究

目的：观察吲哚美辛与阿托伐他汀组合对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的治疗作用。方法：在口服给予APP/PS1 转基因小鼠药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀90 d 后进行Morris水迷宫和穿梭箱实验,并应用免疫荧光染色技术,观察小鼠脑中的Aβ沉积;应用AlphaLISA 技术检测小鼠中枢以及外周血中的Aβ含量;应用液相蛋白芯片技术和流式细胞术,检测小鼠外周血中细胞因子和脾细胞上清液中淋巴细胞亚型;应用放射免疫和化学发光技术,检测小鼠下丘脑- 垂体- 肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA）和下丘脑- 垂体- 性腺轴（hypothalamicpituitary-gonadal,HPG）中的相关激素水平。结果：药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀能够显著改善APP/PS1 转基因小鼠的空间学习记忆能力和主动回避反应能力,降低海马中的Aβ沉积以及Aβ1–42 水平,显著抑制外周血中促炎因子IL-1β、IL-23、GM-CSF、TNF-α、NF-β和eotaxin 的分泌,并促进抑炎因子IL-4 和G-CSF 的分泌。同时,药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀能够增加CD4+,CD28+ T 细胞的数量,降低CD4+,CD25+,Foxp3+ T 细胞的数量,显著降低HPA 轴中ACTH、HPG 轴中GnRH 和LH 的水平。结论：药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀合用能够改善APP/PS1 转基因小鼠紊乱的免疫系统,调节神经内分泌系统的失衡,进而改善APP/PS1 转基因小鼠的学习记忆能力和病理损伤,提示吲哚美辛与阿托伐他汀的组合有可能成为防治AD 的潜在药物。     

胰岛素抵抗大鼠脑组织APP代谢及其相关酶的表达及吡格列酮的干预效果

目的观察胰岛素抵抗（IR）大鼠脑组织β 淀粉样蛋白（Aβ）、淀粉样前体蛋白（APP）及其代谢相关酶的表达及吡格列酮(PIO)的干预效果。方法从45只Wistar大鼠中随机选取10只作为对照组（NC组）,35只给予10%果糖水诱发胰岛素抵抗,4周后根据胰岛素抵抗指数（IRI）,将制作成功的胰岛素抵抗模型26只大鼠随机分为IR组、PIO组。PIO组灌服吡格列酮（10?mg·kg-1·d-1）12周,IR组和NC组给予相同体积的生理盐水。免疫组化法观察大鼠海马Aβ42的表达;免疫印迹法检测大鼠脑APP、β 分泌酶( BACE1)、γ 分泌酶（PS1）的变化。结果IR组和PIO组大鼠海马Aβ42的表达明显高于NC组,与IR组相比,PIO组表达明显减低（P<0.01）;与NC组相比,IR组和PIO组大鼠脑组织APP、BACE1及PS1的表达增高,PIO组表达较IR组减少(P<0.05)。 结论胰岛素抵抗大鼠脑组织通过上调BACE1、PS1活性,使Aβ42生成增加;吡格列酮能抑制BACE1、PS1的表达,减少Aβ42生成。     

APPswe/PS1dE9/TAU三转基因阿尔兹海默病大鼠模型的建立

目的大鼠的大脑比小鼠更大,是研究神经系统的重要模型。建立APPswe/PS1dE9/TAU三转基因大鼠,发展能更全面表现人类阿尔兹海默病表型的动物模型。方法构建人PrP-hAPP695 K595N/M596L、PrPhPS1dE9和PDGF-TAU转基因表达载体,显微注射法制备转基因大鼠。PCR法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。Western blot检测转基因大鼠脑组织中人APP、PS1和TAU蛋白的表达。Morris水迷宫检测6月龄三转基因大鼠学习记忆能力改变。APP、PHF-TAU免疫组织化学染色观察三转基因大鼠脑组织APP及TAU的表达。结果得到1个同时高表达人APP、PS1和TAU三个基因的转基因大鼠品系。转基因大鼠6月龄已经出现显著的行为学改变:学习记忆能力下降,病理学改变表现为过度磷酸化TAU增多和神经元胞浆内Aβ表达异常增加。结论成功建立了APPswe/PS1dE9/TAU三转AD大鼠,可做为新一代工具动物模型用于基础医学和AD转化医学研究。     

异氟醚对转APP基因小鼠脑内海马神经元蛋白质损伤和蛋白聚集的影响

目的：观察吸入麻醉药异氟醚对转APP基因小鼠脑内海马神经元蛋白质损伤和蛋白聚集的影响,并探讨海藻糖对异氟醚诱导的神经毒性的干预作用。方法：60只12月龄转APP基因小鼠随机分为对照组、异氟醚组（Iso组）和海藻糖组（Tre组）,每组20只。对照组小鼠不给予任何药物,将其置于持续通入2 L·min^-1氧气的麻醉箱中2h;Iso组和Tre组小鼠于麻醉前30 min分别经腹腔注射2 mL生理盐水或海藻糖（400 μg·kg^-1）稀释液,然后给予1.4%异氟醚吸入麻醉2 h。麻醉后6 h 取小鼠海马组织制备脑组织匀浆,应用 DCFH-DA荧光法检测小鼠海马组织中活性氧（ROS）水平;麻醉后24 h应用免疫组织化学法和Western blotting法检测小鼠海马组织中蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸和β-淀粉样蛋白（Aβ）_1-42蛋白表达水平,应用透射电镜检测海马神经元中蛋白聚集物的形成,应用TUNEL染色法观察小鼠海马组织中神经元凋亡率。结果：与对照组比较,Iso组小鼠海马组织中ROS水平、氧化蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸、Aβ_1-42蛋白表达水平和神经元凋亡率均明显增加（P < 0.05）;与Iso组比较,Tre组小鼠海马组织中ROS水平、氧化蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸、Aβ_1-42蛋白表达水平和神经元凋亡率均明显降低（P < 0.05）。结论：异氟醚能诱导转APP基因小鼠海马神经元蛋白质损伤和蛋白聚集,加剧氧化应激反应,增加脑内海马神经元凋亡,海藻糖能够拮抗异氟醚诱导的神经毒性。     

链脲佐菌素对APP/PS1转基因小鼠学习记忆及JNK信号通路的影响

目的 观察链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)对APP/PS1转基因小鼠学习记忆和海马组织MKK4、JNK、c-Jun磷酸化水平的影响.方法 3月龄APP/PS1转基因小鼠腹腔内注射STZ,采用Morris水迷宫实验观测学习记忆功能,应用尼氏染色观察海马神经元细胞形态,应用免疫印迹法检测海马组织内MKK4、JNK和c-Jun的表达水平.结果 水迷宫隐蔽平台实验中,从第2天到第5天,给予STZ后APP/PS1转基因小鼠逃避潜伏期和目标路径均明显长于对照组(P＜0.05或P＜0.01);Nissl染色显示STZ组小鼠海马神经元损伤明显;与对照组比,STZ组海马组织中磷酸化JNK和c-Jun的表达水平明显增高,分别增高到217.78 ±23.49和189.27±17.80(P＜0.01).结论 STZ可使APP/PS1转基因小鼠学习记忆功能减退,神经元损伤,其机制可能与JNK信号转导通路有着密切的关系.     

二苯乙烯苷对APP 可变剪接的调节和干预作用

目的：β淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）聚集形成的老年斑是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的重要病理特征之一,由淀粉样前体蛋白（amyloid precusor protein,APP）经成淀粉途径多次水解形成。人APP 基因表达受可变剪接调控,人脑内有三种APP 可变剪接异构体产物。根据这些APP 可变剪接异构体是否表达外显子7,可分为APP-KPI+ 和APP-KPI- 两种类型。据报道,APP-KPI+ 在脑内的表达水平与Aβ的产生呈正相关。GSK3β是脑内和AD 相关的最主要的激酶之一,它的活性在AD 脑内增加,是AD 治疗中的一个潜在的重要靶点。我们的前期研究发现,二苯乙烯苷（stibene glucoside,TSG）能够减少APP 转基因小鼠脑内Aβ含量和淀粉样斑块数量,改善学习记忆功能,但TSG 对APP 可变剪接和GSK3β的影响尚不清楚。方法：构建包含APP 外显子7、8 可变剪接的微型基因（mini-gene）。人胚胎肾细胞（HEK-293FT）、小鼠神经母细胞瘤细胞（Neuro-2a,N2a）内转染APP mini-gene 来模拟APP 外显子7、8 在体内的剪接。在神经细胞N2a 内过表达GSK3β或下调其表达,用RT-PCR 和qPCR 观察GSK3β对APP 可变剪接的影响。在HEK-293FT 细胞内共表达剪接因子ASF 和磷酸激酶GSK3β,用HA 抗体免疫共沉淀ASF,GSK3β抗体检测ASF 与GSK3β之间是否存在相互作用。将ASF、GSK3β单独或者共转染至HeLa 细胞中,用荧光二抗进行染色,观察ASF 和GSK3β的细胞定位。APP/PS1 转基因鼠TSG（50 mg·kg-1·day-1）灌胃处理12 个月,用Western blot 或qPCR 观察鼠脑内相关蛋白在mRNA 和蛋白水平发生的改变。结果：APP mini-gene 在HEK-293FT 和N2a 细胞系内进行表达,RT-PCR 结果可见三个条带,经测序分别是APP770,APP751 和APP695。过表达GSK-3β促进APP 微型基因产物APP-KPI+ 在N2a 细胞内的表达,siGSK3β则抑制APP-KPI+ 表达量;不同浓度LiCl 处理SH-SY5Y 细胞,内源性APP-KPI 表达量随LiCl 浓度增高而降低。SR 蛋白ASF 对APP-KPI+ 的表达影响最大,是最为重要的APP 可变剪接调控因子。GSK3β可以被ASF 免疫共沉淀,存在生理上的相互作用,并且免疫共定位实验显示ASF 与GSK3β有很好的细胞内共定位。TSG 抑制细胞内APP-KPI+ 的表达量,同时发现细胞内AKT-GSK3β信号通路可被TSG 激活。在体内实验中,5 月龄APP/PS1 转基因小鼠灌胃给药TSG12 个月后,脑内AKT 和GSK3β磷酸化水平增加,APPKPI+表达水平降低。结论：成功构建了研究APP-KPI 表达的微型基因。TSG 可以激活神经细胞和APP/PS1 转基因鼠脑内的AKT-GSK3β通路;GSK3β通过与剪接因子ASF 相互作用,从而抑制其促进APP-KPI+ 生成的能力;在体内长期喂食TSG 可降低APP-KPI+ 表达。     

培哚普利通过调控脑锌代谢改善APP/PS1转基因小鼠认知功能

 目的 探讨培哚普利对APP/PS1转基因小鼠认知功能和大脑皮层锌、铁、锰、铜、镁、钙水平,以及锌转运体家族成员（ZnT1、ZnT2、ZnT3、ZnT4、ZnT5、ZnT6、ZnT7） mRNA表达水平的影响。方法 10只APP/PS1转基因小鼠随机分为对照组和培哚普利治疗组（各5只）。应用水迷宫实验检测小鼠认知功能;应用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）检测小鼠大脑皮层6种金属微量元素的含量;应用real-time PCR检测小鼠大脑皮层锌转运体家族成员mRNA表达水平。结果 培哚普利降低了APP/PS1转基因小鼠逃避潜伏期,增加了小鼠穿越平台次数;培哚普利增加了APP/PS1转基因小鼠大脑皮层锌水平,而铁、锰、铜、镁、钙水平在培哚普利应用前后未见显著性差异;培哚普利降低了锌转运体家族成员中ZnT1的mRNA表达水平,而ZnT2、ZnT3、ZnT4、ZnT5、ZnT6、ZnT7 的表达水平在培哚普利应用前后未见显著性差异。结论 培哚普利可以通过下调大脑皮层ZnT1表达,调控脑锌代谢,进而改善APP/PS1转基因小鼠认知功能,提示调控脑内锌稳态是培哚普利改善阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）认知水平的重要机制之一。     

姜黄素对APP/PS1转基因鼠TNF-α、IL-6的影响

目的 探讨APP/PS1转基因鼠体内细胞因子TNF-α和IL-6的变化规律以及不同药量的姜黄素对其变化规律的影响.方法 6月龄雌性小鼠分为:野生型小鼠(对照组,n=9),APP/PS1转基因鼠(模型组,n=9)和APP/PS1转基因鼠+姜黄素(用药组,n=27).对照组和模型组自由摄食和饮水;用药组,姜黄素按60,160,600 mg·kg-1加入小鼠饲料,各组小鼠每次取3只分别于9,12,18月龄时处死,应用ELISA检测其大脑、血清中的细胞因子TNF-α和IL-6.结果 (1)与野生型小鼠相比,APP/PS1转基因鼠脑组织、血清中的TNF-α和IL-6于9月龄时开始升高,12月龄时差异显著(P＜0.05),18月龄时差异更加显著(P＜0.01);(2)应用姜黄素60mg·kg-1治疗后,APP/PS1转基因鼠脑组织、血清中的TNF-α和IL-6表达水平降低,姜黄素160mg·kg-1出现显著性差异(P＜0.05),姜黄素600 mg·kg-1差异更加显著(P＜0.01).结论 APP/PS1转基因鼠随着病情发展脑组织、血清中TNF-α和IL-6水平逐渐升高,应用姜黄素治疗后细胞因子TNF-α和IL-6逐渐降低,并呈剂量依赖性.     

不同月龄APP/PS1双转基因AD小鼠海马神经元线粒体的动态变化

目的:检测不同月龄APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠海马神经元中线粒体自噬的动态变化,并探讨其意义.方法:选取20只雄性APP/PS1双转基因AD小鼠为研究对象,分为3月龄组、6月龄组、9月龄组和12月龄组,以C57小鼠为对照组.获取海马组织,通过电镜观察海马区神经元中线粒体的形态变化,用Western blot检测自噬相关蛋白LC3和P62的表达水平;线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin和Miro1的表达水平;线粒体外膜蛋白Tom20的表达水平.结果:电镜观察结果显示:随着月龄增大,APP/PS1双转基因AD小鼠海马区神经元中线粒体损伤的病理变化呈逐渐加重的过程,即线粒体明显水肿、透明,嵴排列不规则,断裂,甚至消失.Western blot结果显示,与野生小鼠组比较,LC3、P62、PINK1和Parkin蛋白表达水平在6月龄组、9月龄组和12月龄组小鼠中明显增高(P＜0.05),而Miro1蛋白却明显降低(P＜0.05),Tom20的表达水平无明显差异(P＞0.05).结论:随着APP/PS1双转基因AD小鼠月龄的增加,其海马区神经元线粒体病理改变呈动态,线粒体自噬呈动态增强但伴随线粒体清除障碍.     

APP转基因小鼠脑组织中4.1B蛋白的表达研究

目的检测4.1B蛋白在阿尔茨海默病模型APP转基因小鼠脑组织中的表达。方法 PCR鉴定APP转基因阳性[APP（＋）]小鼠和APP转基因阴性[APP（﹣）]小鼠,分别取不同脑区用免疫组织化学法和免疫印迹法检测4.1B蛋白的表达。结果免疫组织化学法显示在APP（＋）鼠和APP（-）鼠的大脑皮层和海马均可见4.1B阳性细胞,APP（＋）组小鼠的4.1B蛋白表达明显高于APP（-）组小鼠。免疫印迹法检测APP（＋）组和APP（-）组小鼠脑组织海马、皮层和小脑中均有4.1B蛋白的表达,APP（＋）组各脑区4.1B蛋白表达均明显高于APP（-）组。结论 APP高表达引起脑组织内4.1B蛋白的表达增高。     

早老素增强子-2在APP/PS1双转基因小鼠脑内的分布及表达

目的 研究γ-分泌酶组件早老素增强子-2(presenilin enhancer-2,Pen-2)在APP/PS1双转基因小鼠脑内的表达及分布,以进一步明确Pen-2与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的关系.方法 对APP/PS1双转基因小鼠交配后产下的子代进行基因分型,用免疫组化方法检测Pen-2和老年斑在APP/PS1双转基因AD模型小鼠和同窝野生型正常小鼠脑内的分布和表达情况.结果 Pen-2广泛分布于APP/PS1双转基因小鼠脑内各区域,包括大脑皮质、海马、基底核、小脑、嗅脑、脑室脉络丛等,而老年斑则选择性地出现在大脑皮质、海马、嗅脑等区域,并且Pen-2的分布范围广于老年斑的分布.AD模型小鼠大脑新皮质内Pen-2阳性神经元的着色程度(2.09±0.33)显著高于正常小鼠(1.29±0.31,P ＜0.05),且AD模型小鼠大脑新皮质内Pen-2免疫阳性物质主要分布于细胞膜和细胞质,而正常小鼠大脑新皮质内的Pen-2阳性神经元仅细胞膜周围染色较深,而细胞质染色极浅甚至不着色.结论 Pen-2在AD模型小鼠和正常小鼠脑内的表达存在差异,这种差异可能与老年斑的形成和AD的发生相关.     

文冠果壳苷对APP/PS1 转基因小鼠突触可塑性的作用及其机制研究

目的：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）被认为是突触相关的一类疾病,因此又把它叫做突触失效,最终导致中枢神经系统网络联系受损,认知功能及记忆能力的下降。神经元的损伤和异常信号转导是神经退行性疾病的关键性指标。因此,改善突触结构和功能障碍是改善认知缺陷和防止AD 发展的一个重要目标。文冠果壳苷是从文冠果果壳中提取的一种三萜皂苷类单体化合物,前期研究结果证实其对多种AD 模型动物的学习记忆障碍具有显著的改善作用,并可增加海马突触素及PSD95 的蛋白表达,提示文冠果壳苷可能具有保护突触或提高突触可塑性的作用。方法：本实验通过行为学、透射电镜、Golgi-Cox 染色、免疫组化、电生理和突触相关蛋白表达的考察,验证文冠果壳苷对APP/PS1 转基因小鼠学习记忆障碍的改善作用及对突触结构和功能可塑性的影响。结果：Morris 水迷宫结果表明,与APP/PS1 小鼠相比,文冠果壳苷可以显著缩短逃避潜伏期,提高穿台次数;Y 迷宫结果表明,文冠果壳苷可以显著提高APP/PS1 小鼠的自发交替反应率;提示文冠果壳苷可以改善APP/PS1 小鼠的空间记忆和工作记忆障碍。透射电镜结果表明,与APP/PS1 小鼠相比,给予文冠果壳苷后CA1 区突触间隙清晰可见,突触前区内有较多的突触小泡,突触前后膜清晰均匀;Golgi-Cox 染色结果表明,文冠果壳苷可以显著改善APP/PS1 小鼠海马树突棘密度降低;文冠果壳苷可以对抗Aβ25-35 导致的原代海马神经元树突长度降低及多级树突分枝减少;提高APP/PS1 小鼠突触结构可塑性相关蛋白（BDNF-TrkB 通路相关蛋白）的表达;提示文冠果壳苷对突触结构具有保护作用。电生理实验结果表明,文冠果壳苷可以显著改善APP/PS1 小鼠LTP 降低;CamKⅡ和GluR1 蛋白的表达对于LTP 的维持至关重要,Western blot 结果表明,文冠果壳苷可以显著提高APP/PS1 小鼠海马突触上和突触外p-CamKⅡ蛋白的表达,促进突触上GluR1蛋白的磷酸化;提示文冠果壳苷对APP/PS1 小鼠突触功能可塑性具有保护作用。结论：文冠果壳苷对APP/PS1 小鼠的学习记忆障碍具有显著改善作用。其机制可能与调节突触结构相关蛋白BDNF-TrkB 及功能维持相关蛋白CamKⅡ-GluR1,进而提高海马突触结构和功能可塑性有关。     

APP/PS1/LC3三转基因小鼠的构建及其自噬流水平研究

目的：研究APP/PS1/LC3三转基因小鼠的构建及自噬流情况。方法：将CAG-mRFP-eGFP-LC3转基因自噬流模型小鼠与APP/PS1双转基因阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）模型小鼠交配繁殖,对产下的子代进行基因分型鉴定,选出同时含有 CAG-mRFP-eGFP-LC3基因和APP/PS1的小鼠为APP/PS1/LC3三转基因小鼠,Morris水迷宫实验检测小鼠行为学变化。取6月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠和同窝CAG-mRFP-eGFP-LC3 单转基因小鼠各6只,断头取脑后在透射电镜及荧光显微镜下观察自噬流的变化,采用免疫组织化学法检测老年斑的形成,用Western blot检测自噬标志物。结果：基因分型证实APP/PS1/LC3三转基因小鼠构建成功。Morris水迷宫显示,6月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠找到平台的平均潜伏期和路程均明显增加（F=87.096,P=0.000;F=41.583,P=0.000）,穿越平台的次数明显减少（2.000±0.707 vs. 4.800±0.800,t=2.622,P=0.031）。透射电镜下观察,6月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠脑神经元内出现更多的自噬小泡。荧光显微镜下观察,与同窝CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠比较,6月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠海马区自噬体及自噬溶酶体数量均明显增高（5.894±0.742 vs. 14.820±3.350,t=0.017,P=0.000;1.204±0.420 vs. 1.840±0.559,t=3.156,P=0.005）,大脑皮质内自噬体数量亦明显升高（1.943±0.415 vs. 10.030±4.382,t=6.364,P=0.000）,但自噬溶酶体数量比较,差异未见统计学意义（0.562±0.207 vs. 0.686±0.195,t=0.156,P=0.878）。免疫组化染色结果显6月龄APP/PS1/LC3三转基因大脑皮质及海马区域出现明显老年斑,而同窝CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠脑内未见老年斑。Western blot结果显示：与同窝CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠比较,APP/PS1/LC3三转基因小鼠脑内APP蛋白明显升高（0.294±0.070 vs. 0.690±0.275,t=3.423,P=0.007）,自噬相关蛋白LC3、 Beclin1、P62水平均增高（0.241±0.004 vs. 0.534±0.019,t=37.170,P=0.000;0.479±0.020 vs. 1.180±0.255,t=6.820,P=0.000;0.188±0.007 vs. 0.356±0.021,t=18.850,P=0.000）,但溶酶体膜蛋白LAMP1表达水平降低（1.450±0.065 vs. 0.773±0.043,t=8.705,P=0.000）。结论：APP/PS1/LC3三转基因小鼠自噬被激活,但自噬溶酶体降解受阻,是研究AD自噬流水平的理想动物模型。