问号赖型钩端螺旋体内鞭毛与外膜基因融合DNA疫苗载体的构建

目的为增强问号赖型钩端螺旋体(017株钩体)内鞭毛抗原(flaB)与外膜抗原(ompL1)的免疫保护作用,克服保护性免疫持续时间短的难题,应用DNA重组技术以pcDNA3.1为载体构建-表达flaB与ompL1基因的融合DNA疫苗载体,以期注入肌体后能延长保护期,激发机体长期免疫.在pcDNA3.1载体上,ompL1与flaB前后相连,前者较后者先获得递呈,与钩体天然递呈过程相似,并且双嵌合基因可诱导机体产生针对2个不同抗原表位的抗体,从而增加免疫应答能力.pcDNA3.1载体能表达融合蛋白,并且具有CpGmotifs,因而可发挥佐剂作用.方法提取017株钩体基因组DNA,参照钩体特有的高度保守的flaB与ompL1序列,设计二对四条引物P1、P2、P3、P4.flaB与ompL1已被证实是两个良好的钩体疫苗候选抗原.通过聚合酶链反应(PCR),P1、P2引物扩增017株钩体的ompL1抗原基因;P3、P4引物扩增钩体的flaB抗原基因,分别经双酶切,以pcDNA3.1载体,将ompL1与flaB顺次同时定向嵌入同一pcDNA3.1中,获得重组质粒(ompL1与flaB),并将其转入JM109宿主菌中.在设计引物时,分别在P2、P3引物中,采用多个结构简单又不易形成折叠的甘氨酸作为接头,以维持其空间构象,不影响自然折叠,保持天然活性.结果经酶切鉴定证实有一1.8kb片段插入载体,进一步经酶切证实这一1.8kb可被酶切为9.6kb及8.5kb的片段,与预期的片段大小一致.以嵌合重组质粒DNA为模板,经PCR证实P1、P2引物扩增出9.6kb片段;P3,P4引物扩增出一8.5kb片段.重组质粒经DNA序列检测,其中ompL1与flaB序列与文献报道的完全一致.结论表达017钩体flaB与ompL1抗原的融合蛋白的DNA疫苗载体构建成功,从而为下一步表达复合功能蛋白,进行钩体免疫保护性研究打下了基础.     

赖型钩端螺旋体及澳洲型钩端螺旋体的ompL1和flaB2抗原基因序列分析

目的：构建棘型钩端螺旋体017及澳洲型钩端螺旋体607株外膜蛋白抗原基因ompL1和内鞭毛抗原基因flaB2的重组质粒，并分别对ompL1及flaB2基因进行序列分析。方法：通过聚合酶链反应扩增ompL1及flaB2，并将其分别克隆到pcDNA3.1/Myc-His(＋）载体T7启动子下游，构建抗原基因表达质粒，进行序列测定分析。结果：序列分析显示赖型钩体017株与澳洲型钩体607株的ompL1相同碱基949个（98．85％），碱基变异11个（1．15％）；flaB2的相同碱基823个（96．94％），碱基变异26个（3．06％），呈很高的保守性。结论：赖型钩体017株与澳洲型钩体607株的ompL1及flaB2分别具有高度同源性。     

赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白新基因ompL17基因靶向敲除及其突变株的构建

目的将外膜蛋白新基因ompL17靶向敲除并构建该基因的突变株。方法提取钩端螺旋体017株基因组DNA，扩增出外膜蛋白新基因ompL17，与打靶载体p2NIL重组，并插入氨苄抗生素抗性基因伽”使外膜蛋白新基因ompL17失活，构建重组的基因打靶质粒p2NIL17A。电穿孔转化入钩体017株中构建突变株，通过豚鼠模型观察该突变株的毒力变化。结果PCR、Dot blot和酶切分析，证实构建了以氨苄青霉素抗性基因DNA为标记探针的基因打靶载体，并构建外膜蛋白新基因ompL17敲除的钩体017株突变株。结论成功将钩体外膜蛋白的新基因ompL17进行靶向敲除，并构建钩体017株突变株，为进一步进行该基因的功能研究和阐明赖型钩体致病的分子机制奠定了基础。     

问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121及其表达产物的初步研究

目的:探讨问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121外源基因及其表达产物23 kDa蛋白的特点。方法:用6种内切酶对pDL121行酶谱分析,用Digoxin标记的pDL121外源基因片段作探针对不同种属的钩体进行杂交,用SDS-PAGE制备23 kDa蛋白,Western blot鉴定其免疫原性。结果:pDL121外源基因没有6种内切酶的酶切位点,重组探针与致病性钩体(serovar lai strain 017,serovar hebdomadis strain56610,serovar pomona strain 56608)有杂交信号,与非致病性钩体(serovar patoc strain Patoc I,serovar illini strain 3055)无杂交信号,亦不识别大肠杆菌。23 kDa兔抗血清可识别pDL121体外表达的23 kDa蛋白带和赖型钩体017株超声抗原成份;其抗体滴度为1/12800;用pDL121细菌裂解液主动免疫豚鼠,可使豚鼠抵抗强毒力株钩体攻击。结论:pDL121外源基因可能是赖型钩体的一个新基因;该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体;23 kDa抗原有良好的免疫原性,可能是赖型钩体017株的保护性抗原。     

中国强毒力赖型钩端螺旋体外膜蛋白基因的克隆表达及对大肠杆菌活力的影响

目的:构建表达致病性赖型 017株钩端螺旋体OmpL1外膜蛋白的真核-原核穿梭表达载体,并在原核细胞中表达出目的蛋白。方法:用PCR方法从 017株钩体基因组中钓出OmpL1蛋白基因,酶切纯化后与质粒pBK-CMV连接,通过电泳、限制性内切酶分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒。重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后提取总蛋白以SDS-PAGE检测表达情况,同时监测目的蛋白表达前后各时段宿主菌OD600值的变化。结果:筛选出 5株带重组质粒菌,其中有 4株能在大肠杆菌中表达 37kD的特异蛋白,而且随着该外源蛋白的表达,宿主菌生长各时段的OD600值下降。结论:成功地构建了钩体OmpL1蛋白的穿梭表达质粒,并在大肠杆菌中表达出OmpL1融合蛋白,该异源蛋白的表达导致宿主菌的活力降低。本工作为OmpL1蛋白用于钩体病诊断、疫苗研制和致病机制的研究奠定了基础.     

赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础.方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32.脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot检测目的基因的表达.结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达.结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据.     

赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的真核表达及基因免疫

目的 在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的重组质粒,并检测其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果.方法 以赖型钩端螺旋体全基因组为模板,PCR扩增出目的基因HlyX,以质粒pcDNA3.1为载体,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒.将构建成功的重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达.将重组质粒免疫BALB/c小鼠,每两周1次,共3次,ELISA法检测小鼠的体液免疫应答水平.结果 扩增出全长约1100 bp的HlyX基因,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定表明重组质粒构建成功.RT-PCR检测显示重组质粒转染组能扩增出约1100 bp的目的基因片段,Western blot分析可见在相对分子质量(Mr)40×103左右出现特异性的目的条带.DNA免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平(1∶6561～1∶19 683).结论 赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体,为其作为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础.     

赖型钩体毒力相关基因ompL17的重组表达以及体外不同温度下的表达研究

目的:观察ompL17基因表达产物的免疫原性以及该表达蛋白在动物模型中的分布情况.方法:提取钩端螺旋体017株基因组DNA,扩增出ompL17基因,与表达栽体pGEX-4T-1重组,诱导表达OMPLl7蛋白,分析该基因在017株中体外不同温度的表达情况.结果:PCR和酶切分析证实构建成功了表达栽体,SDS-PAGE分析证实诱导表达出OmpL17蛋白;体外不同温度下发现该基因不表达蛋白.结论:成功表达出ompL17基因的蛋白,体外不同温度未发现该蛋白的表达,为赖型钩体的分子机制的阐明奠定了基础.     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫微线体蛋白MIC3基因。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,反转成cDNA.根据MIC3基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应（PCR）方法从弓形虫cDNA中扩增MIC3基因片段,插入pGEM-T载体,并转化大肠杆菌Top10,经PCR、双酶切、测序验证后,将MIC3基因片段定向亚克隆到载体pET-28a中构建原核表达重组质粒pET-28a-MIC3,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出792bp大小的MIC3基因片段并诱导表达27 300 Mr的重组MIC3蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pET-28a-MIC3重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

问号状赖型钩端螺旋体LAg42膜蛋白基因的克隆及真核表达研究

目的:构建赖型钩端螺旋体lag42基因真核表达载体并转染哺乳动物细胞,为进一步研究奠定基础。方法:分别以问号状赖型钩体017株,56601株及双曲钩体PatocI株基因组为模板PCR扩增目的基因。构建lag42基因与质粒pcDNA3.1A 的重组真核表达质粒,克隆筛选并测序;通过脂质体介导将重组质粒转染入COS7细胞,用RT-PCR检测转染结果。结果:不同毒力赖型钩体均能扩增出约1100 bp的片段,而PatocI株则未能扩增出目的片段;PCR、双酶切及测序证实pcDNA3.1A -lag42构建成功;经RT-PCR检测证实重组质粒转染成功。结论:赖型钩体具有编码LAg42膜蛋白的基因,构建完成真核表达载体pcD-NA3.1A -lag42,并成功转染COS7细胞。     

缺失IFN-γ受体基因的天坛株减毒重组痘苗病毒载体的构建

目的 构建缺失WN-7受体基因的天坛株重组痘苗病毒载体，初步研究其毒力的改变及B8R缺失区插入外源基因表达的稳定性。为研制表达多价抗原重组痘苗病毒载体、提高痘苗病毒载体安全性进行探索。方法 采用PCR技术、多步克隆构建带有天坛株痘苗病毒B8R基因外左右侧同源臂、痘苗病毒启动子序列pE/L、p7．5及下游LacZ序列的转移质粒pSKB8R、pSKB8RLacZ。将痘苗病毒VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因(IFN-7受体基因同源序列)缺失为LacZ所取代的重组病毒vIT△B8RLaeZ。结果经酶切、测序鉴定转移质粒构建正确，核酸水平、外源基因生物学活性检测表明VIT△B8RLacZ在CEF细胞连续培养传代中B8R基因的缺失和插入外源基因LacZ表达均很稳定。VTTΔB8RLacZ在细胞中的繁殖复制水平与VTT相当。兔皮内毒力实验表明B8R基因缺失显著降低VTT的毒力。结论 本研究表明B8R基因缺失可显著降低痘苗病毒天坛株的毒力并可作为外源基因的插入区，缺失B8R基因的重组痘苗病毒可能作为新一代的表达多价抗原痘苗病毒载体。     

恙虫病东方体Karp株47kD蛋白基因的表达及DNA免疫初步研究

目的　观察恙虫病东方体Karp株相对分子质量 (Mr)为 47× 10 3 蛋白基因的DNA免疫效果。方法　将恙虫病东方体Karp株Mr 为 47× 10 3 的蛋白基因插入真核表达载体pcDNA3.1( +) ,构建重组质粒pcDNA3.1 47。在证明该重组质粒可在哺乳动物COS7细胞中表达的基础上 ,单独和将其与Mr 为 40× 10 3 重组蛋白联合免疫小鼠。在每次加强免疫之后 10d ,检测小鼠体液和细胞免疫反应。结果　质粒DNA和蛋白联合免疫组所诱导的抗体水平和脾淋巴细胞增殖反应均高于重组质粒DNA和蛋白单独免疫组 ,而第二次加强免疫后重组质粒诱导脾淋巴细胞的增殖情况则显著弱于其它免疫组 (P <0 .0 5 )。结论　重组质粒pcDNA3 .1 47和重组Mr 为 47× 10 3 蛋白在刺激小鼠免疫反应上具有相互加强作用。     

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因与质粒DNA表达载体中CpG特定核苷酸序列及其在DNA疫苗中的作用

目的对赖型钩体DNA疫苗包括内鞭毛蛋白基因和质粒DNA表达载体的CpG特定结构进行分析,为DNA疫苗免疫机制的阐明和提高DNA疫苗的效能奠定基础.方法以flaB2与VR1012构建重组DNA的免疫原,对内鞭毛蛋白基因(flaB2)及质粒DNA表达载体(VR1012)全核苷酸序列进行计算机分析.以flaB2与VR1012构建重组DNA进行NZW兔免疫原实验及豚鼠保护实验.结果flaB2共846bp,G+C%为47.9%;赖型钩体全基因组G+C%为36.8%,内鞭毛的G+C%比基因组高;CG特定核苷酸序列共51个,平均16.59%个bp有1个;flaB2中CpG的"C”的侧翼为两个嘌呤,"G”的侧翼为两个嘧啶共3个,分别为GACGCT1个,GACGTC1个,GACGCC1个;质粒DNA表达载体VR1012共4914bp,G+C%为49.4%,CG特定核苷酸序列共250个,平均19.66个bp有1个,VR1012中CpG的"C”的侧翼为两个嘌呤,"G”的侧翼为两个嘧啶共16个,分别为GACGTC5个,GACGCT2个,GACGCC1个,GACGTT1个,GGCGTT2个,GGCGCT2个,GGCGCC1个,AACGCT1个,AACGCC1个和特别重要的TGACGTCA4个和TAACGCCA有1个,位于5′端456-463;509-516;592-599;778-785,486-493;4个TGACGTCA和1个TAACGCCA均位于5′端且相对集中.TCG分散共53个,TCGTCG共1个,位于1873-1878,NZW兔免疫原实验及豚鼠保护实验的结果表明,加强注射接种后3周"VR1012+flaB2”组动物抗体效价增高(16倍),试验组存活率为90%.结论研究结果表明赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因及其质粒DNA表达载体构成的DNA疫苗具有明显的免疫原性和免疫保护作用,经DNA分析表明DNA疫苗中特别是质粒表达载体含有TGACGTCA等特定结构,是提高DNA疫苗免疫效能,减少疫苗免疫接种剂量一种行之有效的措施.     

赖型钩端螺旋体毒力株新基因差异片段筛选和核苷酸序列分析

目的:筛选致病钩端螺旋体赖型017株毒力相关基因DNA差异片段,并进行核苷酸及基因信息学分析。方法:提取钩端螺旋体017株基因组DNA,根据抑制消减杂交(SSH)筛选的017株特有的153bp核苷酸短片段,采用盒式连接半巢式PCR技术,扩增相邻未知序列,进行序列测定、分析及同源性检索,并进行蛋白二级结构预测。结果:克隆获得580bp核苷酸长度的基因片段,包含4个重叠开放阅读框架(ORF),在氨基酸水平上与A型化脓性链球菌,肺炎链球菌保守的假想蛋白高度同源。被GenBank收录,收录号为AF495587。结论:本研究筛选并分析了可能是钩体毒力相关的基因片段,为进一步探讨该基因的生物学功能及阐明赖型钩端螺旋体致病分子机制打下了基础。     

实时定量PCR方法监测重组痘苗外源基因传代稳定性

目的 建立实时定量PCR方法 以监测外源基因在不同重组痘苗代次中的稳定性.方法 裂解法提取8个代次插入有HIV基因的重组痘苗DNA,用实时定量PCR的绝对和相对定量方法 ,研究不同代次基因组中插入的外源基因与痘苗基因组的数量关系.结果 绝对和相对定量方法 均证明,在传代过程中,重组痘苗中的外源基因有缺失现象.结论 建立的实时定量PCR方法 可以特异、定量地分析外源基因在重组痘苗中的稳定性.     

采用基因打靶技术构建结核分枝杆菌新基因Rv0901缺失株的研究

目的：利用基因打靶技术构建基因打靶载体和基因缺失株，用于结核分枝杆菌基因Rv0901功能的研究。方法：结核分枝杆菌标准株H37Rv体外培养，对其Rv0901基因及两侧序列进行体外扩增，连接载体及目的片段，切除目的基因，再引入筛选标志构建重组自杀质粒，分别用酶切及PCR鉴定；用电穿孔法将重组自杀质粒转入结核杆菌H37Rv株，用PCR鉴定。结果：经鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符，且为所需目的基因片段，成功切除靶片段；蓝白斑筛选证实标记基因插入片段插入方向正确；Rv0901基因缺失株用PCR鉴定成功缺失了目的基因片段2.5 kb。结论：成功构建了用于结核分枝杆菌基因打靶的置换型载体和Rv0901新基因缺失株，为Rv0901基因功能的研究奠定了基础。     

脊髓灰质炎病毒疫苗株Sabin Ⅰ全基因序列克隆的构建及鉴定

目的 构建脊髓灰质炎病毒疫苗株Sabin Ⅰ的全基因序列克隆.方法 利用分子生物学技术,通过分段扩增和酶切连接逐步构建插入脊髓灰质炎病毒疫苗株Sabin Ⅰ全基因序列的质粒,采用单引物二次PCR法引入点突变,并通过酶切、测序等方法进行鉴定.结果 在pWSK29载体中成功插入脊髓灰质炎病毒疫苗株Sabin Ⅰ全基因序列,酶切鉴定正确,序列测定显示有9个核苷酸变异.结论 成功构建脊髓灰质炎病毒疫苗株Sabin Ⅰ的全基因序列克隆,为进一步改造并研究其功能特别是3D聚合酶的功能打下了基础.     

恙虫病东方体山西株56kD蛋白基因DNA疫苗的初步研究

我们构建了恙虫病东方体山西株(Sxh951)56kD蛋白基因DNA疫苗(pc-DNA3．1-Tsa56)，该重组质粒转染的COS7细胞经IFA和WB染色均为阳性，表明该重组质粒能够在哺乳动物细胞中表达。为了探讨该DNA疫苗诱导机体产生体液和细胞免疫应答的效果，将6周龄：BALB／c鼠随机分成5组，每组10只。每只小鼠两只后腿肌肉多点注射0．25％     

我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因免疫原性的研究

目的 构建含有我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因片段的真核表达质粒,观察重组质粒DNA的免疫原性,为登革多价疫苗的研究提供依据。方法 首先将包含我国登革2型病毒43株E蛋白Ⅰ/Ⅱ抗原区和4型病毒B5株E蛋白Ⅲ抗原区的嵌合E基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,通过测定确定嵌合基因序列的正确性。然后将重组质粒以肌肉注射途径,免疫Balb/C小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。结果 构建的含有我国登革2型／4型病毒株嵌合E基因的真核表达质粒pcDNA-D2/4,经序列测定表明,导入的嵌合E基因片段的序列是正确的。将重组质粒DNA免疫小鼠,在初次免疫后的第3周,可同时检测到针对登革2型和4型病毒的特异荧光。结论 所构建的含有不同血清型的我国登革病毒株嵌合E基因片段的真核重组质粒,可诱导小鼠同时产生针对两个血清型病毒的特异抗体,该研究为新型登革多价疫苗的研制提供了依据。     

沙门菌细聚合菌毛作为新型载体表达外源基因片段

目的 用减毒Salmonella typhimurium ST14028-3b菌株的细聚合菌毛（thin angregative funbriae）构建表达HIV-1 2F5抗原表位的载体。方法 通过两步重叠PCR法（two step overlap extension PCR）构建重组体agfA：：2F5，将重组体克隆至具有分离缺陷的温度敏感性低拷贝质粒pHSG415中，构成重组质粒pHSGAgfA2F5，然后经电穿孔法转化人ST14028-3b菌株中，经温度和抗生素选择压力进行等位基因置换，通过PCR筛选出含有外源基因的突变株，测序验证其序列的正确性。最后，用Western blot法检测菌毛蛋白的表达，黏附试验来证明含有外源基因的菌株Bu96的黏附能力。结果 序列分析表明基因置换后的突变株在菌毛基因上含有外源基因2F5，且不含有质粒pHSG415的复制子序列。Westernblot结果显示菌毛蛋白表达，黏附试验表明了菌株Bu96的黏附能力。结论 利用具有分离缺陷的温度敏感性低拷贝质粒pBSG415，在ST14028-3b的细聚合菌毛编码基因agfA上插入表达2F5或其他外源基因的方法可行。本方法的最大优点在于不需要使用专门的菌株或抗生素抗性标记重组基因来进行位点特异性基因置换，同时也避免了在染色体上非目的DNA的出现。