藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞

目的观察胎儿关节软骨细胞在藻酸钙微载体培养中的特征,探讨用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞的优缺点。方法用藻酸钙微载体和体外单层培养法培养胎儿关节软骨细胞,观察细胞形态学变化,测定细胞数量变化及其生长曲线,观察细胞增殖;借助免疫组织化学的方法了解细胞II型胶原的合成情况。结果体外单层培养的胎儿关节软骨细胞传至第5代已出现明显的反分化,多数细胞变为成纤维细胞状,合成II型胶原的能力明显减弱;而用藻酸钙微载体培养的软骨细胞3个月后仍保持有旺盛的合成Ⅱ型胶原的能力。结论用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞可较长时间保持其表型及合成基质能力,防止反分化的发生。     

藻酸钙凝胶为载体体外短期培养羊软骨细胞的生物学性状

目的:观察以海藻酸钠为载体的成年羊软骨细胞移植前体外短期培养的生物学性状。方法:实验于2004-07/2005-11在解放军总医院骨科研究所完成。①取成年山羊关节软骨,酶消化法得到原代软骨细胞,体外培养扩增,选用培养的第2,3代羊关节软骨细胞与12g/L海藻酸钠混合,种植密度为2×109L-1,将102mmol/L氯化钙溶液滴入软骨细胞藻酸钠悬液,形成藻酸钙软骨细胞凝胶,用软骨细胞培养液培养。②3,6,912d,分别取凝胶,测定DNA、蛋白聚糖含量,并行苏木精-伊红、藩红花O染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果:①藻酸钙凝胶中细胞的光镜形态学观察:软骨细胞在藻酸钙中呈丛状或球状生长,细胞在整个培养过程维持球形状态。②复合软骨细胞的藻酸钙凝胶的组织形态学及免疫组化测定结果:木精-伊红染色可见随培养时间的延长,细胞群增多变大;藩红花O染色显示软骨细胞周围存在不断增大的橙红染区,提示软骨细胞分泌蛋白聚糖含量持续增加。Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。③软骨细胞藻酸钙凝胶培养过程中DNA及蛋白聚糖含量的测定:随时间的延长,DNA的量逐渐增加,说明藻酸钙中的软骨细胞在不断增殖。藻酸钙中软骨细胞分泌的特异性基质蛋白聚糖随时间的延长而增多,象征着软骨细胞表型的稳定。结论:成年羊软骨细胞在藻酸钙中短期培养生长增殖良好,藻酸钙能保留羊软骨细胞表型,具备植入体内的条件。     

藻酸钙凝胶为载体体外短期培养羊软骨细胞的生物学性状

目的：观察以海藻酸钠为载体的成年羊软骨细胞移植前体外短期培养的生物学性状。方法：实验于2004-07／2005-11在解放军总医院骨科研究所完成。①取成年山羊关节软骨，酶消化法得到原代软骨细胞，体外培养扩增，选用培养的第2，3代羊关节软骨细胞与12g／L海藻酸钠混合，种植密度为2&;#215;10^9L^-1，将102mmol／L氯化钙溶液滴入软骨细胞藻酸钠悬液，形成藻酸钙软骨细胞凝胶，用软骨细胞培养液培养。②3，6，9，12d分别取凝胶，测定DNA、蛋白聚糖含量，并行苏木精-伊红、藩红花O染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果：①藻酸钙凝胶中细胞的光镜形态学观察：软骨细胞在藻酸钙中呈丛状或球状生长，细胞在整个培养过程维持球形状态。②复合软骨细胞的藻酸钙凝胶的组织形态学及免疫组化测定结果：木精-伊红染色可见随培养时间的延长，细胞群增多变大；藩红花0染色显示软骨细胞周围存在不断增大的橙红染区，提示软骨细胞分泌蛋白聚糖含量持续增加。Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。③软骨细胞藻酸钙凝胶培养过程中DNA及蛋白聚糖含量的测定：随时间的延长，DNA的量逐渐增加，说明藻酸钙中的软骨细胞在不断增殖。藻酸钙中软骨细胞分泌的特异性基质蛋白聚糖随时间的延长而增多，象征着软骨细胞表型的稳定。结论：成年羊软骨细胞在藻酸钙中短期培养生长增殖良好，藻酸钙能保留羊软骨细胞表型，具备植入体内的条件。     

兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中培养维持其表型稳定的研究

目的:软骨细胞在单层培养时,多次传代后细胞表型发生改变。将兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中作立体培养,以保持其特有表型。方法:用酶消化法获取兔关节软骨细胞,分别在普通培养瓶中作贴壁的单层培养,并传代;或制成细胞/藻酸盐悬液,再进一步制成串珠,使细胞在具有三维立体结构的串珠中生长、繁殖。细胞涂片、石蜡切片,爱尔新蓝染色,采用倒置显微镜、透射电镜观察;以RT-PCR方法检测软骨细胞中II型胶原及凝集聚糖mRNA的表达。结果:单层培养时有较高的细胞增殖率,5代以后渐失去软骨细胞特有的表型。立体培养时细胞分泌的基质大部分位于自身的周围,特有表型可长期保持稳定。3个月后藻酸盐串珠中的软骨细胞仍可测得II型胶原和凝集聚糖的表达。结论:软骨细胞在藻酸盐串珠中培养有助于其合成、分泌基质,维持细胞特有表型的稳定。     

藻酸钙作为可注射骨髓载体的可行性研究

目的探讨藻酸钙水凝胶(CAH)作为自体骨髓(ABM)载体构建可注射骨替代物的可行性.方法在兔背部皮下随机注射藻酸钙自体骨髓复合物(CAH/ABM)、单纯ABM、CAH,术后2、4周取材,通过X线、组织学检查观察其异位诱导成骨能力,并对新生骨进行定量组织学研究和统计学比较.结果X线、组织学检查结果均表明CAH/ABM组有较多新骨形成,ABM组诱导出少量骨,CAH组未见新生骨,诱导骨量统计学上具有显著性差异(P<0.01).结论可注射CAH/ABM复合物具有良好的骨诱导性,CAH是ABM的良好载体之一.     

兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中培养维持其表型稳定的研究

目的：软骨细胞在单层培养时，多次传代后细胞表型发生改变。将兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中作立体培养，以保持其特有表型。方法：用酶消化法获取兔关节软骨细胞，分别在普通培养瓶中作贴壁的单层培养，并传代；或制成细胞/藻酸盐悬液，再进一步制成串珠，使细胞在具有三维立体结构的串珠中生长、繁殖。细胞涂片、石蜡切片，受尔新蓝染色，采用倒置微镜、透射电镜观察；以RT-PCR方法检测软骨细胞中Ⅱ型胶原及凝集聚糖mRNA的表达。结果：单层培养时有较高的细胞增殖率，5代以后渐失去软骨细胞特有的表型。立体培养时细胞分泌的基质大部分位于自身的周围，特有表型可长期保持稳定。3个月后藻酸盐串珠中的软骨细胞仍可测得Ⅱ型胶原和凝集聚糖的表达。结论：软骨细胞在藻酸盐串珠中培养有助于其合成、分泌基质，维持细胞特有表型的稳定。     

藻酸钠凝胶三维培养条件下胰岛素样生长因子Ⅰ对兔关节软骨细胞表型的影响

目的:观察胰岛素样生长因子Ⅰ对藻酸盐凝胶三维培养条件下兔关节软骨细胞表型的影响。方法:实验于2004-10/2006-10在上海长海医院血管外科实验室完成。实验材料:4周龄雄性新西兰兔6只。实验方法:利用机械与酶消化的方法获得均一的兔关节软骨细胞,在单层培养条件下将软骨细胞增殖至P2代;将P2代细胞高密度条件下转入藻酸盐凝胶培养介质,进行三维培养。细胞培养分组:①不含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养。②含50μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养组。③单层培养。实验评估:①三维培养细胞于培养的2,4,6周行冰冻切片苏木精-伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。②单层培养细胞每传代1次行细胞爬片苏木精-伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果:①细胞学外观形态变化:两组藻酸盐凝胶三维培养体系中的软骨细胞在6周的培养过程中始终保持了圆形的细胞外观。单层培养软骨细胞在第5代以前,均保持了星形及多角形的正常软骨细胞外观。②免疫组织化学显示结果:培养6周后,含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养软骨细胞特异性Ⅱ型胶原细胞仍呈强阳性染色,表达水平较转入三维体系前未见降低,培养细胞保持了良好的分化表型。单层培养软骨细胞在第5代以前,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性。第6代以后,大部分细胞呈梭形,向成纤维细胞转化,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性。结论:胰岛素样生长因子Ⅰ对藻酸盐三维培养条件下的关节软骨细胞表型具有维持作用。     

流体剪切力影响人关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的研究

目的检测体外培养的人关节软骨细胞在不同大小的间断剪切力作用下合成Ⅱ型胶原的能力。 方法选取培养的软骨组织,按摇床作用的转速分为：空白对照组和低、中等、高转速组（转速分别为20、40、60转/min）;通过免疫组化法检测关节软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白的表达,RT-PCR法检测Ⅱ型胶原mRNA表达。 结果中等转速组和高转速组Ⅱ型胶原免疫组化平均光密度（OD）值分别为(0.3061±0.0530)和(0.3777±0.0397),均高于低转速组平均OD值(0.2184±0.0135)和空白对照组平均OD值(0.1846±0.0363),差异均有统计学意义（P<0.05）;低、中等、高转速组Ⅱ型胶原mRNA OD比值分别为(0.120±0.003)、(0.150±0.005)、(0.210±0.006),均高于空白对照组OD比值(0.080±0.006),差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论一定强度间断剪切力能够影响人软骨细胞的代谢、增殖活动,使其合成Ⅱ型胶原增多。     

犬关节软骨细胞的体外分离与培养

背景：自1967年Manning等提出的通过胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法分离软骨细胞以来,软骨细胞的体外分离培养研究较多,但目前尚无统一标准。目的：研究犬关节软骨细胞在体外分离以及培养的条件,寻求体外扩增软骨细胞较简便、可行、高效的实验方法。方法：取3周龄幼犬关节软骨组织,应用胰酶、胶原酶制定8种消化方法获取软骨细胞,对比不同方法所获取细胞数量及细胞成活率,分离细胞进行原代及传代培养,观察各代软骨细胞形态。结果与结论：在体外分离犬关节软骨细胞的各种方法中,单纯应用Ⅱ型胶原酶消化法获得的软骨细胞数最多,细胞成活率最高。软骨细胞可以通过体外培养获得扩增,并且维持良好的细胞形态及表型,但仅限于5代以内。     

原代培养小鼠关节软骨细胞的分化与诱导

背景:传统培养方法体外培养的软骨细胞经长时间传代培养后往往去分化为成纤维细胞,导致细胞数量及活性下降.如何避免培养过程中的去分化问题,是模拟体内软骨内成骨软骨发育过程的关键.目的:课题创新性提出以Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶结合消化法体外培养扩增C57BL/6小鼠关节软骨细胞并诱导其向更成熟肥大软骨细胞或终末分化软骨细胞分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察实验,于2008-09/12在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.材料:C57BL/6品系新生小鼠9只.方法:采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶结合消化法分离培养C57BL/6新生小鼠关节软骨细胞,细胞计数法绘制细胞生长曲线,RT-PCR检测Ⅱ型胶原进行鉴定.当细胞90%融合时以含5.5mg/L人转铁蛋白,3×10<'-8> mol/L亚硒酸钠,10mg/L牛胰岛素的ITS诱导培养基进行分化诱导.主要观察指标:诱导0,7 d,阿利新蓝染色检测软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖,von Kossa染色检测软骨细胞钙化结节形成情况,实时定量PCR检测Ⅱ型胶原、X型胶原及基质金属蛋白酶13的表达进行鉴定.结果:原代培养细胞24 h贴壁,呈三角或多角形,培养4～6 d进入快速增殖期,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原的表达,证实获得大量高纯度、高活性的软骨细胞.诱导0 d,细胞单层铺满培养皿底面,无聚集现象;诱导7 d明显可见由软骨细胞聚集形成的软骨小结.与诱导0 d时相比,诱导7 d阿利新蓝染色示软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖染色呈阳性,可见明显的软骨小结,Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶13表达明显增高,且钙化结节明显增多.结论:采用胰蛋白酶和胶原酶结合消化法获得大量高纯度、高活性的软骨细胞.ITS诱导体系有效地促进了软骨细胞成熟及终末分化,较成功模拟了软骨内成骨的软骨发育过程.     

以藻酸钙为载体的可注射性组织工程软骨和骨研究

目的：在裸鼠背部皮下注射软骨细胞／藻酸钙复合物、骨髓基质成骨细胞／藻酸钙复合物，观察体内软骨、骨形成的可行性。方法：分别从兔耳软骨和髂骨获取软骨细胞和骨髓基质干细胞，体外扩增培养，次获得的软骨细胞和骨髓基质成骨细胞与藻酸盐复合，注射于裸鼠背部皮下，以单纯藻酸钙植入作为对照组，6，12周后进行组织学检查和X线检查，观察软骨和骨的形成。结果：注射软骨细胞复合物组，裸鼠背部皮下有软骨样组织形成，软骨细胞位于类似于正常软骨组织的陷窝中，注射骨髓基质成骨细胞复合物组，裸鼠背部皮下有骨样组织形成，具有骨髓腔样结构，而对照组无软骨或骨形成。结论：藻酸钙可用作软骨和骨组织工程的支架材料，以藻酸钙为载体的可注射性组织工程软骨和骨是可行的。     

以藻酸钙为载体的可注射性组织工程软骨和骨研究

目的在裸鼠背部皮下注射软骨细胞/藻酸钙复合物、骨髓基质成骨细胞/藻酸钙复合物,观察体内软骨、骨形成的可行性。方法分别从兔耳软骨和髂骨获取软骨细胞和骨髓基质干细胞,体外扩增培养,将获得的软骨细胞和骨髓基质成骨细胞与藻酸盐复合,注射于裸鼠背部皮下,以单纯藻酸钙植入作为对照组,6,12周后进行组织学检查和X线检查,观察软骨和骨的形成。结果注射软骨细胞复合物组,裸鼠背部皮下有软骨样组织形成,软骨细胞位于类似于正常软骨组织的陷窝中,注射骨髓基质成骨细胞复合物组,裸鼠背部皮下有骨样组织形成,具有骨髓腔样结构,而对照组无软骨或骨形成。结论藻酸钙可用作软骨和骨组织工程的支架材料,以藻酸钙为载体的可注射性组织工程软骨和骨是可行的。     

兔软骨细胞与骨髓基质细胞的平面共培养:两者培养比例筛选

背景:骨髓基质细胞一定条件下可以分化为软骨细胞,但目前还缺少将软骨与骨髓基质细胞平面共培养的深入探讨.目的:拟明确骨髓基质细胞与软骨细胞共培养时比例的选择、细胞增殖活性、软骨特异性蛋白表达的规律,用于细胞移植的最佳时间和传代次数.方法:软骨细胞与骨髓基质细胞的分离培养,传代后分为5组:单纯软骨细胞组;共培养组,软骨细胞与骨髓基质细胞7:3,5:5,3:7组;以及单纯骨髓基质细胞组.传代至第4代(G4),倒置相差显微镜观察各组细胞在不同传代时期的细胞形态,MTT实验检测细胞增殖活性,甲苯胺蓝与阿利新蓝染色,细胞免疫化学法检测Ⅱ型胶原的表达.结果与结论:共培养各组在各个时期细胞表型正常.G1～G3代细胞增殖活跃,G4代细胞增殖能力下降.共培养各组甲苯胺蓝与阿利新蓝染色以及Ⅱ型胶原表达在G2和G3代均较高.综合各指标认为,以软骨细胞与骨髓基质细胞的比例为5:5,3:7组为最佳.软骨细胞与骨髓基质细胞平面共培养,保持了软骨细胞的形态和蛋白表达特性,如进行细胞移植,选取软骨细胞与骨髓基质细胞5:5或3:7的比例为最佳.     

Ⅱ型胶原酶消化法可短时间获得大量纯化大鼠关节软骨细胞

背景:建立一种经济、快捷、切实可行的软骨细胞分离培养体系对于软骨体外实验研究有着重要的意义.目的:探讨与改进大鼠关节软骨细胞的培养方法.方法:无菌条件下取新生1周龄SD雄性大鼠双侧髋及膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离软骨细胞并进行原代、传代培养及鉴定.结果与结论:倒置相差显微镜下见原代培养的软骨细胞12 h后开始贴壁,3 d左右可形成单层,4 d左右即可传代.传至第6代后,部分细胞变为梭形;第7代后,绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状,增殖能力减弱.甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞核呈异染性,免疫荧光染色显示培养的软骨细胞Ⅱ型胶原呈阳性表达.说明采用此方法可在短时间内获得大量纯化的大鼠软骨细胞.     

兔膝关节软骨细胞的分离培养及形态学特征

背景:软骨细胞是软骨破坏过程中的靶细胞,也是分泌炎性细胞因子的主要细胞之一,体外分离培养骨关节炎软骨细胞存在难度.目的:对兔膝关节软骨细胞进行分离和培养,观察兔软骨细胞的形态学特性.方法:4周龄新西兰白兔采用机械-酶消化法,通过调整胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶的浓度及消化时间来获得较纯的关节软骨细胞,传代培养.通过倒置相差显微镜下观察细胞形态、绘制生长曲线、苏木精-伊红染色、阿利新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色对细胞进行鉴定.结果与结论:原代培养的软骨细胞以多角形或三角形为主,传代3次后出现反分化.形态学、免疫荧光染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定,90%以上的软骨细胞维持多角形或三角形,核为圆形或椭圆形.苏木精-伊红阳性染色为细胞核呈紫蓝色,软骨细胞基质红染,胞浆及细胞周围有紫红色、阿利新蓝染色可见细胞浆和胞膜呈深蓝色、Ⅱ型胶原免疫荧光染色可见胞浆和胞膜清晰绿色荧光,细胞核区域未见明显绿色荧光.结果提示,实验成功建立了软骨细胞分离、培养体系,且3代以内90%以上的软骨细胞生长良好.     

组织工程研究中关于软骨细胞的培养

软骨创伤后很难修复,因为软骨细胞属于增殖能力极弱的终末分化细胞,‘缺乏再生能力.软骨组织受损后,其周围正常软骨细胞不熊迅速增殖,产生新的基质来修复.对于软骨缺损,以往大多数研究惯向于用食未分化的间充质细胞骨膜、软骨膜或直接细胞移植修复口直接细胞移植由于细胞堆积在一起,缺乏营养和气体交换,无法进行分裂增殖;合成基质,最终难于形成软骨组织.而生物相密性良好和生物可降解性胞载体的应用,能为软骨细胞提供理想的表面支持和稳定的三维空间支架结构,以及足够的孔隙率,供细胞在其中进行物质交换.生长代谢和分泌软骨基质.以三维立体培养为基础的组织工程技术在软骨细胞培养方面已取得突破性进展.甩组织工程技术构建软骨的重要条件之—就是获得一定数量的软骨细胞,体外培养和扩增,并保持一定的功能活性.     

组织工程研究中关于软骨细胞的培养

软骨创伤后很难修复,因为软骨细胞属于增殖能力极弱的终末分化细胞,缺乏再生能力。软骨组织受损后,其周围正常软骨细胞不能迅速增殖,产生新的基质来修复。对于软骨缺损,以往大多数研究倾向于用含未分化的间充质细胞骨膜、软骨膜或直接细胞移植修复。直接细胞移植由于细胞堆积在一起,缺乏营养和气体交换,无法进行分裂、增殖、合成基质,最终难于形成软骨组织。而生物相容性良好和生物可降解性细胞载体的应用,能为软骨细胞提供理想的表面支持和稳定的三维空间支架结构,以及足够的孔隙率,供细胞在其中进行物质交换、生长代谢和分泌软骨基质。以三维立体培养为基础的组织工程技术在软骨细胞培养方面已取得突破性进展。用组织工程技术构建软骨的重要条件之一就是获得一定数量的软骨细胞,体外培养和扩增,并保持一定的功能活性。     

微载体悬浮培养成人骨髓间充质干细胞

本研究采用微载体旋转培养系统和常规静止培养系统对成人骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcell,MSC)的培养进行比较。MSC是贴壁依赖性细胞 ,旋转培养系统采用CultiSpherG大孔微载体 ,浓度为 1g L ,常规静止培养在 12孔培养板中进行。两系统细胞接种密度均为 5× 10 4 cells ml。结果 :旋转培养 7天后达到最大活细胞密度5 .15 0× 10 5cells ml,常规静止培养第 5天就达到最大活细胞密度 1.6 75× 10 5cells ml。在微载体旋转培养中生成乳酸12 .0 6mmol L ,而常规静止培养中生成乳酸 13.10mmol L ,葡萄糖消耗分别为 7.38mmol L和 5 .37mmol L。在微载体旋转培养中平均乳酸产率为 1.6 3,远低于常规静止培养的平均乳酸产率 2 .4 4。这些表明 ,在微载体悬浮培养条件下 ,MSC生长更为旺盛 ,细胞产量更高 ,葡萄糖消耗和能量利用率优于常规静止培养。微载体悬浮培养 12天后 ,MSC依然保持其干细胞特性。结论 :微载体培养系统是扩增组织工程种子细胞的有效方法     

结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型的影响

背景:在关节软骨损伤修复的过程中,由于目前实验室中常用的细胞因子存在半衰期短、价格昂贵等缺点,不能广泛应用于临床.目的:假设结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型有一定的影响,为组织学方法修复关节软骨缺损寻找新的细胞因子.设计、时间及地点:随机区组设计对照实验,于2007-08/2008-02在深圳龙岗中心医院完成.材料:健康1月龄新西兰大白兔2只:结缔组织生长因子为Propetech公司产品.方法:获取兔关节软骨组织,将其剪碎,Ⅱ型胶原酶消化法原代分离培养兔关节软骨细胞,待细胞铺满瓶底80%胰酶消化传代,取其第2代,细胞贴壁后随机分组,实验组分别加入30,50,100,150 μ g/L的结缔组织生长因子,对照组仅加入DMEM培养液进行体外培养.主要观察指标:采用倒置相差显微镜下观察细胞形态及数量改变,采用四唑盐(MTT)法检测不同浓度的结缔组织生长因子对软骨细胞增殖的影响,免疫组织化学法(SABC法)检测Ⅱ型胶原的表达情况.结果:①结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞生长迅速,呈典型的软骨细胞形态,部分细胞聚集成团,形成软骨结节.②结缔组织生长因子能显著促进兔关节软骨细胞增殖,与对照组相比差异具有显著性意义(P<0.01).不同质量浓度的结缔组织生长因子均能促软骨细胞增殖,100μg/L为最佳作用质量浓度(P<0.01).③结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达增多,且始终为阳性.结论:结缔组织生长因子可以刺激体外培养的兔关节软骨细胞增殖,促进软骨特异性Ⅱ型胶原表达,维持软骨表型.结缔组织生长因子可能用来作为组织工程学修复软骨缺损,治疗骨关节炎的新的生长因子.     

胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶消化获取关节软骨细胞

背景:近年来,众多研究欲采用体外分离培养的关节软骨细胞作为修复缺损的关节软骨的种子细胞,然而,获得纯化的具有生物活性的关节软骨细胞较为困难.目的:拟运用胰蛋白酶与Ⅱ型胶原酶联合消化获取关节软骨细胞.方法:从SD大鼠的正常股骨及胫骨关节表面获取关节软骨,先后运用0.25%的胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶消化,显微镜下见大量细胞游离后,弃去大块的未消化的关节软骨碎片,离心,去上清,PBS洗涤2次后,加入软骨细胞原代培养液进行培养、增殖.应用甲苯胺蓝及苏木精-伊红染色方法检验所得细胞是否为关节软骨细胞.结果与结论:在严格掌握酶的浓度及消化时间的前提下,通过0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶联合酶解关节软骨的方法,成功从大鼠股骨及胫骨关节软骨内分离培养出细胞,并经过甲苯胺蓝染色及苏木精-伊红染色证实,所得的细胞为具有生物活性的关节软骨细胞.