miRNA-140在早期骨关节炎软骨细胞中的表达规律及功能

目的 观察早期骨关节炎（osteoarthritis,OA）软骨细胞中miRNA-140的表达规律以及转染ds-miRNA-140对软骨细胞功能的影响。 方法 建立兔OA模型,获得正常软骨细胞（A组）和4周（B组）、8周（C组）OA软骨细胞,应用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测各组miRNA-140相对表达量以及Ⅱ型胶原蛋白（Col2a1）和金属蛋白酶13（MMP-13）的表达情况。各组软骨细胞转染ds-miRNA-140后,观察细胞Col2a1、MMP-13的表达情况。 结果 B组、C组软骨细胞miRNA-140的表达和A组相比分别下降到63%和57%（P<0.01）,而B组和C组软骨细胞miRNA-140的表达差异无统计学意义（P>0.05）;B、C两组细胞Col2a1 mRNA的表达和A组相比分别减少了52%和63%（P<0.01）,B、C两组软骨细胞MMP-13 mRNA的表达和A组相比分别升高了3.01倍和4.15倍（P<0.01）。转染ds-miRNA-140后,B、C两组细胞Col2a1 mRNA的表达分别增加了60%和127%（P<0.01）,B、C两组MMP-13 mRNA的表达在转染后是转染前的54.53%和42.61%（P<0.01）。Col2a1和MMP-13蛋白表达水平变化趋势与mRNA一致。 结论 OA早期关节软骨miRNA-140的表达显著减少;转染ds-miRNA-140可增加软骨细胞Col2a1表达,同时降低MMP-13的表达。     

黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达的影响

目的:观察黄芪甲苷对原代培养骨关节炎患者的膝关节软骨细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达影响,初步探讨黄芪甲苷防治膝骨关节软骨退变的作用机制。方法:原代培养骨关节炎患者的膝关节软骨细胞,用第三代细胞进行试验。将5个不同浓度的黄芪甲苷,分别作用于关节软骨细胞4、8、24、48、72h后,采用Real Time-PCR法检测细胞中Ⅱ型胶原(Col Ⅱ)、蛋白多糖基因(ACAN)的mRNA表达。结果:黄芪甲苷浓度为25~75mmol/L,作用于退变关节软骨细胞24~72h时,软骨细胞Col Ⅱ和ACAN mRNA的表达量均较对照组显著增加。结论:黄芪甲苷可延缓膝骨关节炎关节软骨细胞的退变,促进软骨细胞ColⅡ及ACAN mRNA的表达可能是其作用机制之一。     

骨关节炎Ⅰ号预防氢化可的松所致兔软骨细胞损伤作用

目的：探讨骨关节炎Ⅰ号预防氢化可的松对软骨细胞的损伤作用。方法：用3—4周兔关节软骨,经胶原酶Ⅱ消化,建立软骨细胞体外培养体系,经阿尔辛蓝、甲苯胺蓝染色鉴定后,在软骨细胞培养体系中分别加入不同浓度的骨关节炎Ⅰ号与氢化可的松的混合液,通过倒置显微镜观察软骨细胞形态变化,用MTT比色法观察软骨细胞OD值的变化。结果：1．25,2．5mg／ml氢化可的松培养24h的软骨细胞严重损伤或死亡。1．25mg／ml氢化可的松与150mg／ml骨关节炎Ⅰ号混合液培养的软骨细胞,以及2．5mg／ml氢化可的松与300mg／ml骨关节炎Ⅰ号混合液培养的软骨细胞生长均良好。MTT检测结果与软骨细胞形态观察一致。结论：骨关节炎Ⅰ号具有预防氢化可的松对软骨细胞的损伤作用。     

骨关节炎软骨细胞凋亡的研究进展

近年来研究表明,软骨细胞过度凋亡在OA的发病中具有重要作用.在OA中,软骨细胞凋亡多通过NO途径和Fas途径发生,并且受相关癌基因表达的影响.阐明软骨细胞凋亡在OA的发病机制中的作用,将有助于OA的防治.     

不同针刺时间对兔骨关节炎软骨细胞MMP-13的影响

目的研究不同针刺时间对兔骨关节炎模型膝软骨细胞中MMP-13表达的影响。方法取44只新西兰大耳兔随机分为4组,分别为正常对照组,模型组及电针1组、电针2组。正常对照组不造模,模型组和电针治疗组均采用左膝关节伸直位管型石膏固定,建立OA模型。取兔左股骨内侧髁软骨,采用免疫组化法观察软骨细胞中MMP-13的变化。结果 MMP-13检出率随针刺时间延长较模型组下降。按Mankin’s评分比较,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论不同疗程电针治疗可促使兔骨关节炎模型软骨细胞重排,减少软骨细胞中MMP-13表达,对OA治疗有一定作用。     

骨碎补对兔膝骨关节炎关节软骨细胞凋亡相关因子作用实验研究

目的：采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测方法,观察骨碎补对实验性兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡的影响并进行理论分析。方法：将24只成年新西兰大耳白兔,随机分为6组,空白组6只。模型组6只,治疗组（骨碎补组）6只,对照组（维固力组）6只。兔左后肢伸直位管型石膏固定6周得到兔膝OA的模型。用药4周后,以耳缘静脉空气栓塞法处死各组动物取下每只家兔左后肢股骨髁,取下的关节软骨用于RT—PCR检测。采用SPSS13．0软件包对RT-PCR结果进行方差分析和Pearson相关分析,P〈0．05有统计学意义。结果：MMP3mRNA、BAXmRNA：模型组较空白组的表达水平明显上升,差异有显著性（P〈0．05）;对照组较模型组的表达水平有所下降,差异有显著性（P〈0．05）;治疗组较模型组的表达水平明显下降,差异有显著性（P〈0．05）;治疗组较对照组的表达差异无显著性。bcl-2mRNA：模型组较空白组的表达水平明显下降,差异有显著性（P〈0．05）;对照组较模型组的表达水平有所上升,差异有显著性（P〈0．05）;治疗组较模型组的表达水平明显上升,差异有显著性（P〈0．05）;治疗组较对照组的表达差异无显著性。结论：单味中药骨碎补对防治OA有重要作用。     

腺病毒介导的碱性成纤维细胞生长因子对人骨关节炎软骨细胞的作用

目的:探讨腺病毒介导的人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养的人骨关节炎(OA)软骨细胞的转染及其作用。方法:人OA软骨细胞分为3组:OA对照组、绿色荧光蛋白(EGFP)对照组及bFGF转染组。采用含bFGF的腺病毒载体转染人OA软骨细胞,48 h后通过流式细胞术分析腺病毒转染软骨细胞的效率,绘制转染效率曲线。6 d后检测培养基中bFGF的浓度及软骨细胞增殖;观察软骨细胞蛋白多糖及Ⅱ型胶原的表达。结果:腺病毒介导的bFGF可高效转染人OA软骨细胞并在细胞外表达。与OA对照组相比,bFGF转染后可明显促进软骨细胞的增殖(P<0.05);同时增加了软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成(P<0.05)。结论:腺病毒介导的bFGF可促进OA软骨细增殖,增强细胞基质的合成,对软骨细胞表型的维持具有重要作用。     

医用臭氧对骨关节炎病理过程中软骨细胞的影响

目的   观察不同浓度医用臭氧(O3)对白介素-1β(IL-1β)损伤关节软骨细胞的影响,探讨临床使用O3的浓度范围。方法   在无菌环境下消化得到7月龄新西兰白兔膝关节软骨细胞,培养并传代,用传代软骨细胞作为实验用细胞。随机分为8组：正常软骨细胞组(N组),模型细胞组即软骨细胞加IL-1β(M组),对照组即软骨细胞加不同浓度O3(20、40、60μg/mL)组,实验组即IL-1β(10ng/mL)干预的软骨细胞加不同浓度O3(20、40、60μg/mL)组,共同孵育24h后观察细胞形态。酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 测定软骨细胞培养液上清液中丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的含量。结果   20、40μg/mL浓度医用臭氧干预软骨细胞后,对照组和实验组细胞的形态与正常软骨细胞相似,有少量核固缩,MDA、TNF-α、MMP-3的含量比模型细胞组降低(P＜0.05);60μg/mL医用臭氧干预软骨细胞后,细胞损伤严重,呈凋亡形态,且MDA、TNF-α、MMP 3的含量比模型细胞组增高(P＜0.05)。结论   20、40μg/mL浓度医用臭氧通过降低细胞培养液中炎症因子的浓度对骨关节炎软骨细胞有保护作用,60μg/mL医用臭氧对正常软骨细胞和骨关节炎病理过程中的软骨细胞均有损伤作用。     

Ⅱ型胶原与骨关节炎的免疫学关系初探

回顾原发性骨关节炎的免疫学发病机制的研究文献、Ⅱ型胶原在原发性骨关节炎中的分布的研究文献及Ⅱ型胶原应用的相关文献,综述了Ⅱ型胶原在原发性骨关节炎的免疫学发病机制的作用,并提出Ⅱ型胶原在原发性关节炎的预防、诊断、治疗方面的应用前景.     

人骨关节炎软骨细胞的体外培养

目的:对人骨关节炎软骨细胞的分离、消化和培养进行初步研究,并就其生物学活性同人正常软骨细胞进行比较和评价。方法:以含血清培养液配制的0.05%和0.2%Ⅱ型胶原酶顺序消化关节软骨分离细胞,检测细胞存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长、增殖和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化,以及用流式细胞仪检测有或无IL-1β诱导的细胞凋亡和周期变化。结果:①消化后骨关节炎组原代细胞活力平均为82%,少于正常组的95%(P<0.01)。②MTT检测骨关节炎组细胞增殖低于正常组(P<0.01),Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝O异染反应均较弱,传至第4代软骨细胞生物学特性基本消失。③骨关节炎组细胞凋亡率为6.9%,而正常组为0.5%,IL-1β诱导后凋亡率增加了27.4%,正常组只有12.7%。结论:酶二步消化法具有较高细胞存活率、低污染率和操作简便等特点,分离培养的骨关节炎软骨细胞符合人患骨关节炎时软骨细胞退变的表现,能很好的为骨关节炎细胞水平的研究提供最佳实验对象。     

尼古丁抑制MIA诱导的骨关节炎软骨细胞凋亡

目的探讨尼古丁抑制碘乙酸钠(MIA)诱导的骨关节炎软骨细胞凋亡。方法酶消化法分离大鼠原代软骨细胞,并用10-8,10-7,10-6,10-5mol/L尼古丁处理细胞48 h,随后实验分为5组,除正常组外,其余4组皆用4μM MIA处理24 h,并给予尼古丁。MTT法检测各组软骨细胞活力;Annexin V-FITC/PI流式双染细胞术检测各组软骨细胞凋亡;分光光度法检测各组软骨细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase 3)活性;Western blot分析磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)激活状况及下游靶分子Bax,Bcl-2的表达情况。结果 10-7,10-6mol/L尼古丁显著促进大鼠软骨细胞活力(P0.05),10-5mol/L尼古丁显著降低大鼠软骨细胞活力(P0.05),10-8mol/L尼古丁对大鼠软骨细胞活力无影响(P0.05)。10-8,10-7,10-6mol/L尼古丁能剂量依赖性的提高MIA诱导的大鼠软骨细胞活力,并抑制MIA诱导的大鼠软骨细胞凋亡及Caspase 3活性(P0.05);10-7,10-6mol/L尼古丁能提高PI3K表达及AKT磷酸化水平,并下调促Bax表达,上调Bcl-2表达(P0.05)。结论一定剂量尼古丁能显著的抑制MIA诱导的大鼠软骨细胞凋亡,可能与PI3K/AKT信号通路有关。     

Ⅱ型胶原羧基端端肽对骨关节炎早期诊断和病情评估的实验研究

目的:定量检测骨关节炎(OA)大鼠模型血清、关节软骨蛋白提取液中Ⅱ型胶原羧基端端肽(CTX-Ⅱ)的变化,探讨其作为OA早期诊断及病情评估指标的价值和意义。方法:SD大鼠行前交叉韧带切断术诱导OA模型,将大鼠随机分为模型组和假手术组。于造模后不同时间点分批取血并处死取关节标本,检测血清及软骨蛋白提取液中CTX-Ⅱ水平,观察病理变化。结果:模型组术后2周开始出现OA特征性病理变化且逐渐加重,CTX-Ⅱ水平在术后3天开始不断升高。两组血清及软骨蛋白提取液中CTX-Ⅱ水平在造模后各时间点均有统计学差异,血清和软骨蛋白提取液中CTX-Ⅱ水平变化具有相关性。结论:在大鼠OA模型中,血清CTX-Ⅱ水平在未出现明显病理变化时即已开始增高,并与病灶区软骨中CTX-Ⅱ表达一致,可作为OA早期诊断和病情评估的参考指标。     

氟浓度对体外培养大鼠软骨细胞糖胺多糖和Ⅱ型胶原分泌的影响

目的 探讨氟浓度对体外培养软骨细胞糖胺多糖（GAG）和Ⅱ型胶原分泌的影响.方法 取2月龄雌性SD大鼠下肢髋关节及膝关节软骨,分离、培养出软骨细胞后,接种于细胞培养瓶,经鉴定后,分为空白对照组和NaF受试组（6.25 μmol/ml、12.50μmol/ml、25.00 tmol/ml、50.00 μmol/ml和100.00 μmol/ml）,孵育6d后,分别进行GAG含量测定、阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果 NaF受试6d后,大鼠软骨细胞培养液GAG含量各组无显著性差异（P＞0.05）;阿利新蓝染色显示,大鼠软骨细胞内的糖原异染颗粒亦无明显差异;Ⅱ型胶原免疫组化染色则显示,不同剂量NaF可引起对软骨细胞外Ⅱ型胶原染色积分随剂量的升高逐渐上升（P＜0.05）.结论 NaF对大鼠软骨细胞GAG分泌可能无影响,但可能影响Ⅱ型胶原的分泌.     

机械应力联合维拉帕米对骨关节炎软骨细胞-琼脂糖三维模型蛋白聚糖代谢的作用

 目的  通过对骨关节炎软骨细胞-琼脂糖施压模型机械施压及联合维拉帕米干预,研究软骨细胞聚集蛋白聚糖(aggrecan,AGC)代谢的变化。方法 选取膝关节炎患者关节置换术后胫骨平台软骨,分离软骨细胞,制作软骨细胞-琼脂糖三维模型,设置空白对照组、施压组和施压联合维拉帕米组。采用Flexcell FX-5000TM细胞加力仪施压(24 kPa,0.33 Hz,2 h),维拉帕米干预浓度设定为40 μmol/L。采用RT-PCR法和ELISA法分别检测AGC、ADAMTS-4、ADAMTS-5 mRNA和蛋白质水平。结果 与空白对照组比较,施压组AGC mRNA水平显著升高(P=0.000),ADAMTS-5 mRNA水平显著降低(P=0.000),施压联合维拉帕米组AGC mRNA水平显著升高(P=0.012),ADAMTS-4和ADAMTS-5 mRNA水平均显著降低(P=0.000)。与空白对照组比较,施压组AGC mRNA水平显著增高(P=0.000)、ADAMTS-5水平显著降低(P=0.000);与施压组比较,施压联合维拉帕米组AGC水平显著增高(P=0.008),ADAMTS-4 和ADAMTS-5 水平均显著降低(P=0.000)。结论 机械应力可促进骨关节炎软骨细胞AGC合成,维拉帕米可以加强机械应力的作用。     

骨关节炎软骨细胞caveolin-1表达增高机制的探讨

目的 了解骨关节炎患者关节软骨内caveolin-1的表达情况,以及软骨降解因子自细胞介素(IL)-1β是否促进软骨细胞表达caveolin-1.方法 对8例骨关节炎患者膝关节软骨内caveolin-1基因表达的定量分析采用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),caveolin-1蛋白的表达采用免疫组化分析.选用12周龄的雄性SD大鼠20只,通过切断膝前交叉韧带和内侧副韧带制备骨关节炎模型,术后动态观察关节软骨的病理学变化和caveolin-1的表达情况.离体培养的骨关节炎软骨细胞内caveolin-1基因表达量分别采用RT-PCR和实时RT-PCR分析,caveolin-1蛋白表达量采用Western印迹分析.结果 与关节软骨轻微损害部位相比,8例骨关节炎患者中有6例患者的关节软骨严重损害部位内caveolin-1 mRNA表达增高约2倍,另外2例无明显差异.免疫组化分析显示,上述6例患者关节软骨严重损害部位内caveolin-1蛋白的表达也增高.随着术后时间延长,大鼠骨关节炎关节的软骨逐渐出现损害,且caveolin-1的表达也持续增高.IL-1β(10 ng/ml)可以上调培养的骨关节炎软骨细胞内caveolin-1基因和蛋白表达,并可持续至少48 h.结论 骨关节炎软骨损害程度与caveolin-1的表达水平具有相关性,IL-1β可以刺激软骨细胞表达caveolin-1.提示IL-1β可能通过诱导caveolin-1表达而促进骨关节炎进展.     

首乌延寿丹对家兔骨关节炎的防治作用及其可能机制

目的观察首乌延寿丹对兔骨关节炎（Osteoarthritis,OA）的防治作用。方法将24只日本大耳白兔随机分成空白对照组、模型组、首乌延寿丹组。ACLT术[1]制作OA模型。于第12周末观察软骨病理形态学改变;免疫组化法测定软骨Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的表达。结果以ACLT术成功建立了OA模型。首乌延寿丹组病变明显减轻,Ⅱ型胶原的蛋白表达明显升高（P〈0.01）;MMP-1表达明显降低（P〈0.01）。结论首乌延寿丹可明显抑制OA发展,这一作用可能是通过增加Ⅱ型胶原的蛋白表达、下调MMP-1表达来实现的。     

软骨细胞三种凋亡模型的建立

为了观察药物对骨关节炎中软骨细胞凋亡的影响，建立了软骨细胞三种凋亡模型。将硝普钠(SNP)、全反式维甲酸(ATRA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分别加入软骨细胞培养体系，建立三种不同药物诱导的软骨细胞凋亡模型，采用Annexin v／PI双参数法以及透射电镜对软骨细胞凋亡进行定量、定性检测。在兔软骨细胞培养体系中分别加入2mmol／L SNP，10^-4mol／L ATRA24h后，在人胚胎软骨细胞培养体系中加入30μg／L人TNF-α24h后，均可成功建立软骨细胞凋亡模型。提示硝普钠、全反式维甲酸、肿瘤坏死因子-α加入软骨细胞培养体系中，可建立软骨细胞凋亡模型。     

骨关节炎软骨细胞凋亡率的实验研究

目的检测和分析髋关节骨关节炎中软骨损伤轻重部位的软骨细胞凋亡率。方法关节软骨组织切片分别进行HE染色，番红O-固绿染色，Mankin评分评价软骨损伤程度，TUNEL方法检测软骨细胞凋亡率。结果关节软骨损伤重的部位的Mankin评分值及软骨细胞凋亡率均高于软骨损伤轻的部位。结论软骨细胞凋亡率与骨关节炎软骨损伤程度相一致，说明细胞凋亡可能是骨关节炎软骨损伤的机制之一。     

Ⅱ型胶原体外促进大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化

目的 探讨Ⅱ型胶原(collagen Ⅱ)在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)向软骨细胞的定向分化作用.方法 体外培养BMSCs,分不同collagen Ⅱ接种浓度组(25、50、100、200 μg/mL)和空白对照组,分别作用于BMSCs 7、14、21 d,采用CCK-8法检测各不同浓度组对BMSCs活性的影响;qPCR法和免疫荧光法检测不同浓度组处理BMSCs后,各浓度组与空白对照组相比,collagen Ⅱ、SOX9及aggrecan mRNA及蛋白表达量的差异.结果 ①CCK-8检测结果显示各浓度组在7、14、21 d D(450)值差异无统计学意义(P＞0.05);②qPCR检测结果显示21 d后,不同浓度组与空白对照组比较,collagen Ⅱ、SOX9及aggrecan mRNA表达量均升高(P＜0.05),以100 μg/mL组最高(P＜0.01);14 d时,各浓度组collagen Ⅱ、SOX9及aggreean mRNA以100 μg/mL组上调最明显(P＜0.05),而在7d时,各组之间三者mRNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05);③各浓度组21 d时免疫荧光结果显示:在100 μg/mL Ⅱ组collagen Ⅱ、SOX9及aggrecan mRNA蛋白的表达量较其他各组均明显上调(P＜0.05).结论 collagen Ⅱ可在体外促进大鼠BMSCs向软骨细胞分化,其中以100 μg/mL组促进作用最为明显.