新生大鼠成纤维细胞原代培养

目的探讨新生sD大鼠成纤维细胞的培养方法。方法采用胰酶消化法和组织块贴壁法原代培养成纤堆细胞。采用HE染色及波形蛋白（Vimentin）免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定。结果两种方法均能培养出成纤维细胞,其中酶消化法一次性可获得较多细胞,但细胞状态较差,贴壁慢,生长慢;组织块贴壁法短时间内可长出大量成纤维细胞,一周即可传代。HE染色后倒置相差显微镜下观察细胞形态典型,免疫细胞化学染色结果显示Vimentin呈阳性反应。结论组织块贴壁培养法是获取成纤维细胞简单,可行,快速的方法。     

新生大鼠视网膜神经元的原代培养与观察

目的：建立新生大鼠视网膜神经元体外培养的有效方法。方法：取出生后1～3?d的Wistar大鼠视网膜,胰蛋白酶+依地(EDTA)消化制成单细胞悬液,接种于置有包被多聚赖氨酸(poly L lysine)玻片的24孔培养板中培养,利用相差显微镜对培养的细胞进行动态观察;并以免疫细胞化学技术对视网膜神经元进行染色。结果：在多聚赖氨酸上培养的视网膜神经元生长良好,部分细胞伸出突起,且有些突起相互连接。免疫细胞化学染色显示,培养的细胞大多数抗神经丝蛋白（NF）抗体反应阳性。胰蛋白酶+EDTA联合消化能使视网膜细胞很好得分离,获得视网膜单细胞悬液。结论：酶消化法原代培养视网膜神经元有较好的视网膜神经元生长率;胰蛋白酶+EDTA联合消化较单独用胰蛋白酶消化效果好。     

一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法

目的:建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的方法. 方法:采用胰蛋白酶/胶原酶(1∶1)混合酶液消化法培养人脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合后用胰蛋白酶消化传代;用形态学、免疫细胞化学法进行鉴定. 结果:种植在培养瓶中的内皮细胞4h贴壁生长,48～96 h生长最快,7～10 d汇合. 内皮细胞呈单层铺路石样外观,Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ:Ag)和内皮细胞生长因子受体2(KDR)鉴定内皮细胞纯度达95%以上. 结论:用混合酶液灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型.     

大鼠心脏微血管内皮细胞的培养

目的 培养大鼠心脏微血管内皮细胞,探讨其对研究血管病变的意义.方法 采用Nishida的方法,在无菌条件下分离Wistar大鼠心脏,用胶原酶、胰酶进行消化,通过离心,收集细胞进行培养.结果 培养的细胞呈单层贴壁生长,细胞初为圆形,贴壁后为短梭形,5～7 d呈"铺路石样"生长,培养的细胞在人工基膜(Matrigel)上形成管腔样结构.Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定为阳性.结论 本方法简单易行,对血管病变的研究有重要意义.     

大鼠肾小球系膜细胞原代培养与鉴定

目的: 原代培养及鉴定大鼠肾小球系膜细胞(GMC),探索分离、培养GMC的最佳条件.方法: 对大鼠双肾灌洗后,筛网滤过分离肾小球,并用Ⅳ型胶原酶消化处理,然后种植法体外培养大鼠肾小球.同时采用免疫细胞化学和免疫荧光技术,检测亚代GMC的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、细胞角蛋白(Cytokeratin)、Ⅷ因子相关抗原抗体的表达,鉴定GMC,并绘制其生长曲线.结果: 种植4 d后,约80%肾小球贴壁,可见卵圆形上皮细胞生长,18 d左右镜下细胞多呈星状或三角形并伴有不规则的突起,21 d后细胞生长密集, 细胞团簇之间形成网络.免疫细胞化学和免疫荧光证实抗α-SMA及抗Vimentin染色阳性,而抗Cytokeratin、抗Ⅷ因子抗体染色为阴性.GMC亚代倍增时间为4 d. 结论: 结果表明,用改良的培养方法成功率高,培养的细胞为大鼠肾小球系膜细胞.     

两种大鼠视网膜Müller细胞培养方法比较

目的比较酶消化法与组织块法培养大鼠视网膜Müller细胞的效果。方法将新生3d的SD大鼠视网膜分离为小组织块,分别采用酶消化法与组织块法进行体外培养,采用换液时机械震荡等方法获得纯化的Müller细胞。从细胞形态学、细胞增殖及免疫细胞化学染色阳性率方面比较两种细胞培养方法的效果。结果酶消化法获得的Müller细胞数量多于组织块法(t=2.264,P<0.05),且用时短。两种方法培养的纯化Müller细胞增殖速度及免疫细胞化学染色阳性率比较差异无显著意义(P>0.05)。结论酶消化法是一种高效的大鼠视网膜Müller细胞培养方法。     

大鼠胸主动脉内皮细胞培养方法的改进

目的：建立一种简单易行的SD大鼠胸主动脉的内皮细胞培养方法。方法：分离大鼠胸主动脉,清除血管外结缔组织,将其剪成厚约1.5mm的血管环,以15-20个血管环密度接种于25 cm^2培养瓶中,以含20%胎牛血清的DMEM液培养,60h后去掉血管环。待细胞生长达单层融合时,消化传代。对P2代细胞应用抗Ⅷ因子抗体进行鉴定。结果：60h后,细胞呈集落样散在分布于瓶底;7-9d细胞汇合成单层,呈铺路石状。经Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定,所培养细胞为内皮细胞。结论：血管环贴壁法培养SD大鼠胸主动脉内皮细胞简易可行。     

人胰腺干细胞的体外分离培养、鉴定和分化特性

目的：体外分离培养人胰腺干细胞，进行鉴定并初步观察其分化为胰岛内分泌细胞的能力。方法：用酶消化法从人胎儿胰腺分离胰腺干细胞，培养并传代，应用胰腺干细胞特异性标志物CK－19、胰岛β细胞特异性成分胰岛素和α细胞特异性成分胰高血糖素的抗体进行免疫细胞化学染色鉴定细胞种类和分化特性。结果：分离培养的人胎儿胰腺干细胞呈梭形，最初1周生长较慢，以后增殖较快，约培养3周后即可传代培养。传代细胞约生长2周即可再次传代，免疫细胞化学染色显示细胞呈CK－19免疫阳性反应。经诱导分化后，细胞形成类胰岛样组织，此时免疫细胞化学染色显示部分细胞呈随岛素免疫阳性反应，少数细胞呈胰高糖素免疫阳性反应。结论：人胰腺干细胞能在体外培养条件下快速增殖，并具有多向分化潜能，能分化形成胰岛β细胞和α细胞。     

乳鼠皮层神经元原代培养与观察

目的:通过原代培养乳鼠皮层神经元,为脑血管疾病的研究提供实验模型。方法:酶消化法原代培养出生1天Wistar乳鼠的皮层神经元,利用免疫细胞化学和免疫荧光方法进行鉴定。结果:培养的细胞贴壁生长,胞体饱满,突起较长。免疫细胞化学染色显示神经元特异性烯醇化酶阳性细胞达85%,免疫荧光显示胶质细胞酸性蛋白阳性细胞达15%。结论:酶消化法原代培养乳鼠皮层神经元是一种可靠、稳定的获得神经元的方法。     

大鼠视网膜Müller细胞的培养与鉴定

目的：仿照前人建立的方法，优化SD大鼠视网膜Müller细胞体外培养的技术和方法，为后续相关研究建立实验室条件。方法：使用胰蛋白酶消化的方法分离新生SD大鼠视网膜Müller细胞，以DMEM为培养基体外培养，光镜观察。采用电镜观察及荧光免疫组织化学染色的方法进行鉴定。结果：培养的细胞贴壁生长，原代细胞胞体狭长，细胞质丰富，折光性好。电镜下可见特征性的中间丝（直径8～10nm），细胞器丰富；荧光免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和谷氨酰胺合成酶（GS）阳性。结论：酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法。     

兔视网膜Müller细胞原代培养

目的 :建立兔视网膜 Müller细胞原代培养的方法。方法 :组织块悬浮法培养兔视网膜Müller细胞 ,用电镜和免疫组织化学法对细胞进行鉴定。结果 :培养的细胞贴壁生长 ,呈长梭形 ,胞体肥大 ,胞浆丰富。电镜下可见特征性的中间丝 (直径 8～ 1 0 nm) ;免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白 ( GFAP)和 S- 1 0 0阳性 ,八因子相关抗原阴性。结论 :组织块悬浮法培养兔视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法     

牛视网膜微血管内皮细胞培养方法的研究

目的 探求一种简单、易行的体外培养牛视网膜微血管内皮细胞的方法。方法 采用胶原酶消化获得细胞，并用低浓度人血浆提纯细胞。加入视网膜提取液促进细胞生长。结果 经过多次探索、观察，比较成功的进行了视网膜血管内皮细胞的培养，并成功的进行了鉴定。结论 此方法适合一般实验室开展视网膜血管内皮细胞培养。     

人和大鼠胸主动脉成纤维细胞的原代培养

目的培养成纤维细胞,建立不同种属来源的胸主动脉成纤维细胞的培养方法并比较其形态差异。方法用消化法和贴壁法分离不同来源的成纤维细胞,利用差速培养法纯化成纤维细胞,并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫染色鉴定。结果接种24h后细胞全部贴壁,48h后人胸主动脉成纤维细胞体积增大并伸出伪足,形状以梭形或不规则形为主;而大鼠胸主动脉的成纤维细胞生长的相对较慢。结论用Ⅰ型胶原消化动脉的成纤维细胞效果较好,用差速生长纯化的成纤维细胞可用于实验研究。     

成年大鼠骨骼肌成肌细胞的培养和鉴定

目的探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的高浓度培养方法。方法以成年同种系Wistar大鼠为研究对象,采用两步消化法获取大鼠骨骼肌卫星细胞,进行体外培养,对获得的细胞进行形态学研究,以免疫组织化学方法进行鉴定。结果细胞增殖旺盛,分化良好,可融合成肌管。免疫细胞化学染色显示,骨骼肌卫星细胞呈弱阳性,肌管呈强阳性。结论两步消化法体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,用此种方法可培养出高纯度的骨骼肌成肌细胞,操作简单、污染少。     

小鼠脑内星形胶质细胞体外培养方法的优化

目的： 优化小鼠脑内星形胶质细胞的体外培养方法,为星形胶质细胞的功能研究奠定实验基础。 方法： 取新生0～1 d的C57BL/6乳鼠大脑皮质,胰酶消化结合机械吹打方法,分离皮质细胞,制成细胞悬液并差速贴壁处理,待细胞接种24 h轻柔换液,以后每隔2～3 d换液,且每次换液前手动振荡洗涤2次,传代3次后,行胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）免疫细胞化学染色及免疫荧光染色鉴定。 结果： 经过原代及传代培养,获得形态典型、纯度在95%以上的星形胶质细胞。结论： 优化后的体外培养星形胶质细胞方法,稳定有效,操作简便易行,并可获得高纯度的星形胶质细胞。     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。     

一种高选择性、高效的牛视网膜微血管内皮细胞培养方法

目的 建立一种高效、可行、特异性高的牛视网膜微血管内皮细胞(BREC)培养方法.方法 取新鲜牛眼,分离视网膜并用DMEM进行冲洗、匀浆剪碎,过75μm筛,将滤网上滤渣转移至50 ml离心管,用I型胶原酶、DNaseI及蛋白酶等多种酶混合液消化20 min,人血清中和后,过46μm网筛并冲洗,离心5 min,将组织扣在培养皿中,转入15 ml离心管,用10％人血清含生长因子ECGS的DMEM培养液培养于25 cm2,选择性培养视网膜血管内皮细胞,接种于明胶包被培养瓶中,采用ECGS配合肝素培养液促进内皮细胞生长,观察细胞形状生长特性,并用免疫化学荧光方法进行鉴定.结果 选择性培养视网膜微血管内皮细胞成单层、镶嵌铺路石状生长,Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测为阳性纯度均大于95％以上,将细胞种在凝固的基质胶表面,12～18 h形成官腔结构.结论 本方法过程简单、可靠,培养的内皮细胞纯度高,生长状态良好,稳定传代,为视网膜血管生成疾病研究建立了模型.     

Intramural pericyte degeneration in early diabetic retinopathy study in vitro.

An experimental model of diseased pericytes was established by using cultured bovine retinal capillary pericytes in high--glucose medium. The high glucose stimulated polyol pathway, reduced cellular myo-inositol content and disturbed inositol phospholipid metabolism which resulted in a decrease in inositol trisphosphate (IP3) level. The correlation of suppressed IP3 levels with reduced DNA synthesis was evident. These findings suggested the biochemical mechanism by which retinal pericytes degenerate in high glucose. To supplement myo--inositol and/or an aldose reductase inhibitor to the high--glucose medium largely reversed the suppressed IP3 level and the decreased DNA synthesis. Therefore, these two manipulations may be considered as in vitro therapy to treat sick pericytes induced by high glucose.