胍丁胺调节阿片功能的分子和神经生物学机制

胍丁胺是一种内源性生物活性物质,由左旋精氨酸在左旋精氨酸脱羧酶作用下脱羧生成。我们的前期研究发现不管是内源性还是外源性胍丁胺都具有明确的阿片功能调节作用,表现为镇痛、增强吗啡镇痛、抑制吗啡耐受,躯体依赖和精神依赖。近年来,在这些工作的基础上,我们研究了胍丁胺调节阿片功能的分子和神经生物学机制。提出了胍丁胺调节阿片功能可能和激活咪唑啉受体有关这一假说。为了证明这一假说的客观性,本实验室首次建立了IRAS-Cho细胞稳定表达系统,通过观察IRAS的亚细胞定位、配体结合特性、生物学功能和信号转等证明了由美国科学家克隆的IRAS就是野生型I1咪唑啉受体。在此细胞模型上,我们首次证明胍丁胺调节阿片功能与激活I1咪唑啉受体相关。为了在神经元上,特别是在整体行为学实验模型上证明上述发现的存在,本实验室用RNA干涉技术在大鼠原代培养海马神经元和大鼠摇体实验模型上进一步证明胍丁胺调节阿片功能与激活I1咪唑啉受体相关。     

利用RNA干扰技术研究I1咪唑啉受体在阿片依赖中的作用

目的：我们和国外实验室先后研究发现胍丁胺对阿片依赖具有调节作用，其作用可能与I1咪唑啉受体（I1-imidazoline receptor，I1R）有关。但由于没有特异性咪唑啉受体拮抗剂且胍丁胺的作用靶点较多，到目前为止，I1R是否为胍丁胺抗阿片依赖的主要作用靶点尚不能完全确定。因此，本文旨在利用RNA干扰技术确定I1R是否介导胍丁按对阿片依赖的调节作用。方法：利用RNA干扰技术下调细胞内源性I1R的表达，     

抗阿片成瘾药物研究历史与现状

阿片成瘾是一种慢性复发性脑疾病,临床症状包括躯体依赖、稽延症状、精神依赖和复吸, 治疗的关键是防复吸。防复吸药物的研究包括以阿片受体和非阿片受体为靶标的药物。代表性药物分别为阿片受体激动剂美沙酮和受体阻断剂纳屈酮,新型阿片受体配体噻吩诺啡能够完全阻断吗啡等阿片类药物引起的躯体和精神依赖,防止阿片复吸。研究表明,参与调节阿片精神依赖和复吸的非阿片受体作用系统包括多巴胺受体、兴奋性氨基酸受体、γ-氨基丁酸受体、乙酰胆碱受体、5-HT受体、CB1受体和神经营养因子受体等。多巴胺D3受体阻断剂Y-QA14自身无致成瘾性,同时具有抗可卡因和海洛因成瘾及防复吸的作用。咪唑啉Ⅰ型受体激动剂胍丁胺具有抗阿片躯体和精神依赖、缓解稽延症状和防复吸的作用,机制与激活咪唑啉Ⅰ型受体后减轻阿片受体、多巴胺系统和谷氨酸系统的代偿性适应用关。本文将就阿片、阿片成瘾生物学基础、防阿片复吸药物研发展、作用机制、历史、现状和发展趋势加以综述。     

咪唑啉结合位点及受体与心血管功能

人及大鼠心肌细胞存在 2 型咪唑啉结合位点 ,多种动物的血管平滑肌存在 1 型和 2 型咪唑啉结合位点 ,其中 2 型咪唑啉结合位点可能参与血管平滑肌的增殖。支配心血管系统的交感神经末梢存在突触前咪唑啉受体 ,激动该受体抑制NE的释放。与多数咪唑啉类化合物不同 ,莫索尼定对突触前咪唑啉受体无效 ,而大麻受体拮抗剂SR141716A对该受体具有拮抗作用。已经证实多数咪唑啉类化合物具有抗心律失常作用 ;咪唑啉受体的内源性配基胍丁胺降低动物窦房结起搏细胞的放电频率 ,延长人与动物心肌细胞的动作电位时程 ,对异丙肾上腺素诱发的后除极具有抑制作用。但是 ,咪唑啉类和胍类化合物非竞争性抑制心血管系统的KATP通道 ,可能干扰IK .ATP的心脏保护作用。     

胍丁胺对NMDA受体药理作用的研究进展

胍丁胺是一种新的神经递质和/或神经调质,是咪唑啉受体的内源性配体。它作为一种阳离子胺类物质,除了咪唑啉受体外,在生物体内还存在多个作用靶点,NMDA受体是其中最重要的作用靶点之一。本文就胍丁胺与NMDA受体在中枢神经系统的分布、胍丁胺在NMDA受体上的作用位点以及胍丁胺通过NMDA受体介导的药理作用等几个方面进行了综述。     

胍丁胺及其主要生物学作用

胍丁胺作为咪唑啉受体的内源性配体，能调节某些神经递质的释放，并有多方面的生物学作用如降糖、利尿、对抗阿片类药物所致耐受和依赖、抗炎等，因此胍丁胺很可能是又一个新的神经递质或调质。     

莫索尼定的药理和治疗原发性高血压

莫索尼定(moxonidine)系德国Beiersd-orf公司开发的作用机制新颖的抗高血压药物。已于1991年在德国首先上市,商品名为Cynt,有0.2 mg和0.4mg两种片剂。药效学本品是一种对咪唑啉I_1受体(imidazo-line I_1 receptor)有高度亲合力的选择性激动剂。根据不同的组织、种属和所用的配体,本品对这种新发现的受体的选择性比对β_2受体最高可高达600倍。在体内与中枢咪唑啉受体的结合明显与血压下降程度有关。动物用一种对咪唑啉位点有亲和力的部分α_2拮抗剂BDF6143预处理,可以抵消本品引起的血压下降。体外本品是一种α_2肾上腺素受体     

神经元受体

本文题为神经元受体(Neuronal receptor),旨在强调神经药物的结合位点并不一定是神经递质的受体。下述内容着重介绍,可被配体结合试验所标记的识别位点及其与第二信使之间的联系、受体的放射自显影分布、作为神经递质的药物受体的内源性配体,以及受体结合技术用于酶学研究的策略。阿片受体大部分递质受体仅占脑组织重量的百万分之一。值得注意的是,粗制匀浆中的阿片受体可与可逆性阿片类药物结合而得以标记。其成功因素之一是由于采用了在低浓度(nM)下就对     

吗啡长期给药后大鼠脑内MAO—B活性及咪唑啉受体的下调

目的:探讨吗啡长期给药处理后大鼠不同脑区MAO-B活性及咪唑啉受体含量的变化。方法:用[~3H]咪唑克生配体结合试验测定咪唑啉受体含量,用高效液相色谱法测定MAO-B活性。结果:咪唑克生和吗啡能剂量依赖性地抑制大鼠脑匀浆MAO-B活性。咪唑啉受体的内源性配体胍丁胺既不影响MAO-B活性,也不影响咪唑克生及吗啡对MAO-B活性的抑制作用。吗啡连续给药16d后大鼠大脑、海马、丘脑、纹状体及小脑内MAO-B活性均显著下调(P<0.01)。纳洛酮及咪唑克生单次给药对吗啡依赖大鼠上述脑区MAO-B活性均没有进一步影响;胍丁胺伴随吗啡给药后能显著抑制吗啡降低MAO-B活性的作用。吗啡连续给药后大鼠皮层和小脑咪唑啉受体数量减少而亲和力上调(P<0.05)或P<0.01)。结论:MAO-B活性与吗啡依赖大鼠发生戒断综合征相关,但与胍丁胺对吗啡镇痛作用的影响无关;胍丁胺对吗啡药理作用的影响与其激活咪唑啉受体有关。     

胍丁胺抗阿片依赖研究进展

阿片成瘾,又称为阿片依赖,是一种慢性复发性脑疾病,可引起一系列严重的社会、经济和公共卫生问题。由于阿片依赖的神经生物学机制尚未阐明,目前仍缺乏有效的医学干预手段。研究阿片依赖的神经生物学机制、寻找有效的防复吸药物已成为阿片依赖研究领域的热点。胍丁胺是一种新发现的候选神经递质或调质,被认为是咪唑啉受体的内源性配体,本文主要以我们的研究工作为基础,对外源性胍丁胺的抗阿片依赖作用特点及其可能的作用机制加以综述。     

川芎嗪对大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤L4/L5段背根神经节P2X3受体表达的影响

目的 探讨川芎嗪抑制P2X₃受体介导慢性神经病理痛的作用途径。方法 制备大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)神经病理痛模型，于d 2起ip川芎嗪100 mg·kg^-1，每天1次，共14 d。免疫组织化学法观察CCI大鼠L₄/L₅段背根神经节P2X₃受体的表达，全细胞膜片钳技术测定新鲜分离的L₄/L₅段背根神经节三磷酸腺苷（ATP）和α,β-亚甲基三磷酸腺苷（α,β-meATP）激活的电流。结果 与正常对照组比较，正常大鼠ip川芎嗪14 d，L₄/L₅段背根神经节P2X₃受体表达、ATP激活电流和α,β-meATP激活电流无明显变化，假手术组亦无明显变化。与假手术组比较，CCI模型组大鼠L₄/L₅段背根神经节P2X₃受体的表达、ATP和α,β-meATP激活电流明显增强。CCI大鼠ip川芎嗪14 d，L₄/L₅段背根神经节P2X₃受体表达、ATP和α,β-meATP激活电流较CCI模型组明显降低。结论 川芎嗪可抑制CCI大鼠L₄/L₅段背根神经节P2X₃受体的表达，从而对P2X₃受体介导的神经病理痛产生抑制作用。     

氧自由基对心室起搏离子流If的影响

应用玻管双微电极电压箝制术，观察氧自由基对正常和模拟缺血绵羊心室心肌传导纤维起搏离子流(I_f)的影响. 结果显示：氧自由基对正常绵羊心室心肌传导纤维I_f无明显影响. 对缺血心室心肌传导纤维I_f的幅值也无明显作用，但在膜电位-90至-110 mV水平,延长起搏离子流达稳态的激活时间和半激活时间(P<0.001),表明氧自由基对心室正常自律组织活动具有抑制作用. 提示缺血再灌性快速性室性心律失常不是由于氧自由基增强正常心室自律组织活动引起.     

异丙肾上腺素致大鼠心肌肥厚时心肌细胞核Ca2+转运

目的 观察异丙肾上腺素(Iso)致大鼠心肌肥厚模型心肌细胞核⁴⁵Ca²⁺摄取、钙释放通道肌醇1,4,5-三磷酸(IP₃)受体(IP₃R)和ryanodine受体(RyR)的动力学变化，以探讨细胞核Ca²⁺的转运是否参与心肌肥厚发生。方法 Iso(sc 20、10和5 mg·kg^-1剂量递减3 d，3 mg·kg^-1维持7 d)制备大鼠心肌肥厚模型，用差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯心肌细胞核，用⁴⁵Ca²⁺同位素法测定细胞核钙摄取，用［³H］标记配体分析心肌细胞核IP₃R和RyR的动力学特点。结果 与对照组相比，Iso可导致大鼠心肌显著肥大，伴有显著心肌纤维化；心肌细胞核膜IP₃R与其配体的最大结合容量(B_max)减少23.4%(P<0.05)，解离常数(K_d)无明显变化(P>0.05)；细胞核RyR的B_max增加59.9%(P<0.01)，K_d无明显变化(P>0.05)；⁴⁵Ca²⁺摄取显著低于对照组(P<0.01)，最大摄取与对照组相比降低62%(P<0.01)，达半数最大摄取时［Ca²⁺］无显著变化。结论 Iso导致大鼠心肌肥厚纤维化发生过程中，心肌细胞核⁴⁵Ca²⁺摄取能力降低，核上RyR数目上调，而IP₃R数目下调，受体亲和力无变化，提示心肌细胞核钙调节系统参与心肌肥厚的发生过程。     

三磷酸肌醇信号途径参与血小板激活因子诱导豚鼠心室肌细胞钙浓度增高

目的观察血小板激活因子(PAF)是否影响心室肌细胞钙离子浓度([Ca~(2+)]i)以及通过哪条信号转导通路起作用。方法采用酶法分离豚鼠心室肌细胞,用PAF刺激细胞;用Fluo-3/AM和共聚焦显微镜观察细胞[Ca~(2+)]i;用2-氨乙基硼酸二苯酯(2-APB)和雷诺定(ryanodine)分别阻断IP3和雷诺定信号通路。全细胞膜片钳技术观察心室肌细胞L型钙电流(ICa-L)。结果无论在有钙还是无钙台氏液,PAF(1pmol·L-1~10nmol·L-1)都能增加心肌细胞[Ca~(2+)]i,其作用能够被2-APB2μmo·lL-1阻断,而不能被雷诺定200μmol·L-1阻断。PAF1nmol·L-1对ICa-L没有明显影响,对照组和实验组电流密度分别为-(11.0±1.9)和-(10.5±1.3)pA·pF-1。结论PAF能增加豚鼠心室肌细胞[Ca~(2+)]i,IP3信号通路可能参与了这一过程。     

羊角拗苷对豚鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度的影响

目的观察羊角拗苷(Div)对豚鼠心室肌细胞内游离钙离子([Ca2+]i)浓度的影响,以探讨Div正性肌力作用的机制。方法Fura-2/AM荧光探针标记豚鼠心室肌细胞,应用荧光离子成像系统观察Div800nmol.L-1对心室肌细胞[Ca2+]i的影响。结果在正常台氏液中,Div使心室肌细胞[Ca2+]i显著升高(243±36)%,在无钙液中对[Ca2+]i无明显影响。在无Na+、无K+台氏液中,Div使[Ca2+]i升高(96±20)%。给予L型钙通道阻滞剂CdCl2100μmol.L-1预处理后,Div仍使[Ca2+]i升高(63±10)%。给予T型钙通道阻滞剂NiCl240μmol.L-1预处理后,Div引起的[Ca2+]i升高基本被阻断。结论体外应用Div800nmol.L-1时使豚鼠心室肌细胞[Ca2+]i升高,该升高作用依赖于细胞外Ca2+的存在,可能主要由T型钙通道介导,L型钙通道和Na+-Ca2+交换蛋白亦参与其中。其正性肌力作用与心室肌细胞[Ca2+]i升高有关。     

Differential Binding of Inorganic Particles to MARCO

Alveolar macrophages (AM) in the lung have been documented toplay pivotal roles in inflammation and fibrosis (silicosis)following inhalation of crystalline silica (CSiO₂). In contrast,exposure to either titanium dioxide (TiO₂) or amorphous silica(ASiO₂) is considered relatively benign. The scavenger receptormacrophage receptor with collagenous structure (MARCO), expressedon AM, binds and internalizes environmental particles such assilica and TiO₂. Only CSiO₂ is toxic to AM, while ASiO₂ andTiO₂ are not. We hypothesize that differences in induction ofpathology between toxic CSiO₂ and nontoxic particles ASiO₂ andTiO₂ may be related to their differential binding to MARCO.In vitro studies with Chinese hamster ovary (CHO) cells transfectedwith human MARCO and mutants were conducted to better characterizeMARCO-particulate (ASiO₂, CSiO₂, and TiO₂) interactions. Resultswith MARCO-transfected CHO cells and MARCO-specific antibodydemonstrated that the scavenger receptor cysteine-rich (SRCR)domain of MARCO was required for particle binding for all thetested particles. Only TiO₂ required divalent cations (viz.,Ca⁺² and/or Mg⁺²) for binding to MARCO, and results from competitivebinding studies supported the notion that TiO₂ and both thesilica particles bound to different motifs in SRCR domain ofMARCO. The results also suggest that particle shape and/or crystalstructure may be the determinants linking particle binding toMARCO and cytotoxicity. Taken together, these results demonstratethat the SRCR domain of MARCO is required for particle bindingand that involvement of different regions of SRCR domain maydistinguish downstream events following particle binding.     

在Sf9昆虫细胞-杆状病毒系统中表达毒蕈碱型M_2及M_5受体重组突变体

目的为乙酰胆碱毒蕈碱(M)受体亚型特异性的变构调节剂及基因工程的研究提供实验平台。方法用PCR及搭桥PCR法对乙酰胆碱M2及M5受体作以下突变:①将N-糖基化位点Asp突变为Asn;②删除对蛋白酶敏感的M受体的第三个细胞内环;③在C端添加凝血酶识别位点(CMV)和6-His标记。将PCR扩增出重组嵌合蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达M2/M5受体蛋白。Western印迹及放射性配体受体结合实验验证受体的正确表达及功能。结果通过搭桥PCR,成功扩增出1018 bp的重组M2受体和1041 bp重组M5受体核酸序列;使用pUC/M13的扩增引物成功构建M2/M5重组转移载体。将重组载体质粒与线性化病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞,见细胞空泡样病变。Western印迹分析确定重组杆状病毒感染昆虫细胞M2/M5蛋白表达,放射性配体受体饱和实验结果表明,表达的重组受体蛋白与[3H]N-甲基-东莨菪碱具有特异性结合能力。结论 Sf9昆虫细胞能够表达M2及M5重组受体蛋白,M2及M5重组受体蛋白的病毒样颗粒可用于M受体的新药研究。     

In vitro and ex vivo distribution of [3H]harmane, an endogenous beta-carboline, in rat brain

The endogenous β-carboline, harmane, has been shown to bind to monoamine oxidase A (MAO-A) and a separate, high affinity, non-MAO site. Research in our laboratory has shown that harmane is an active component of clonidine-displacing substance (CDS), the proposed endogenous ligand for imidazoline binding sites (IBS). In the present study we have investigated the distribution of [³H]harmane in rat brain, and related the binding profile to the distribution of the MAO-A selective ligand [³H]Ro41-1049 and the I₂BS ligand [³H]2-BFI. The in vivo distribution of [³H]harmane following intravenous administration was also investigated. Receptor autoradiography revealed a highly significant correlation for the distribution of [³H]harmane and [³H]Ro41-1049, and a significant correlation for [³H]harmane and the I₂BS ligand [³H]2-BFI. The in vivo distribution of [³H]harmane suggests that the ligand accumulates in the adrenal gland and throughout the brain with the primary route of excretion occurring via the duodenum. In conclusion, these studies have shown that [³H]harmane labels a population of binding sites that reflect the distribution of MAO-A. Further evidence for a non-MAO, IBS [³H]harmane population has not been shown but the high level of expression of the MAO-A site is likely to have masked the much smaller population of I₂BS.     

腹侧被盖区注射M_5受体反义寡脱氧核苷酸对大鼠海洛因敏化的抑制作用

目的观察中脑腹侧被盖区(VTA)毒蕈碱受体亚型5(M5)在海洛因诱导大鼠行为敏化中的作用。方法Sprague-Dawley成年雄性大鼠sc海洛因0.25mg·kg-1·d-1,连续8d,制备海洛因敏化模型,每次给药后15min测定大鼠60min内的自主活动。之后停药10d,第18天VTA内微量注射M5受体反义(M5AS-ON)或正义寡脱氧核苷酸(M5S-ON)2μg。24h后大鼠sc海洛因0.25mg·kg-1激发,15min后测定大鼠60min内的自主活动。用免疫组化法检测大脑蓝斑核(LC)和杏仁核(LA)磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(pCREB)表达水平。结果海洛因模型组戒断10d后大鼠自主活动较对照组显著增加,表明成功制备海洛因敏化模型;在海洛因激发前24hVTA微量注射M5AS-ON能抑制大鼠海洛因的行为敏化,而VTA中微量注射M5S-ON组与模型组无显著差异;同时,模型组大鼠脑内LC和LA区神经元pCREB免疫反应阳性表达增加,VTA中微量注射M5AS-ON能明显抑制LC及LA区神经元pCREB阳性表达的增加,而VTA中注射M5S-ON后大鼠LC和LA区神经元pCREB表达较海洛因敏化大鼠无显著差异。结论VTA内M5受体参与了海洛因的行为敏化,其作用机制可能与LC和LA神经元CREB蛋白的磷酸化改变有关。