人成骨细胞系hFOB1．19生物学特性的研究

本研究以成骨细胞系hFOB1．19（hFOBs）为对象，探讨成骨细胞在造血调控中的作用。采用RT-PCR检测hFOB多能干细胞的标志（Oct-4，Rex-1，hTERT）的表达及体外向脂肪细胞诱导分化程度，以测定其多向分化的能力。用流式细胞术（FCM）检测hFOB的细胞表型，RT—PCR检测细胞因子（SCF，IL-6，IL-11，SDF-1α，GM—CSF及G—CSF）的表达，并和骨髓来源的间充质干细胞（BM—MSC）进行比较。结果表明：hFOBs可表达Oct-4、Rex-1多能干细胞的标志，但不表达hTERT；体外诱导分化实验证实hFOB具有多向分化潜能。FCM发现hFOBs和BM—MSC具有相同的细胞表型，均表达CD44、CD73（SH3）、CD105（SH2）及CD90（Thy-1），但不表达CD34、CD45、HLA—DR等造血细胞标记。RT—PCR检测还发现：hFOBs和BM—MSC均表达SCF，IL-6，IL—11，SDF-1α等细胞因子mRNA，但hFOBs还能表达GM-CSF和G-CSF。结论：人成骨细胞系hFOB1．19可能是处于较早阶段的成骨祖细胞，表达多种造血相关的细胞因子，是研究成骨细胞调控造血的较好的模式系统。     

间充质干细胞与相关因子

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞及成肌细胞分化的多向潜能，可在造血微环境形成、组织修复及基因治疗中得到应用。多种生长因子如TGF—β，IGF—I，BMP及FGF在MSC分化中发挥不同的促进作用并有协同性；MSC可分泌G—CSF，SCF，LIF，M—CSF，IL—6和IL—11等多种细胞因子支持造血并与某些疾病的发生有关；相关因子作用后的MSC将在基因工程应用中发挥重要作用。     

胰腺十二指肠同源基因1的结构、表达调控与功能

胰腺十二指肠同源基因1（PDX-1）是编码调节与胰腺发育和β细胞特异基因表达有关的一种特异性转录因子,是胰腺干细胞分化、成熟过程中的第一个分子标记。PDX-1基因的活化可促进胰岛素的释放及β细胞重要基因的表达,也是胰腺干细胞分化为胰岛β细胞的必要条件之一。细胞因子、胰高糖素样肽1（GLP-1）等多种信号转导物质协同调节PDX-1基因的表达。探讨PDX-1的基因表达及生理功能,有助于理解胰腺干细胞向胰岛β细胞诱导分化过程,进一步评估其在糖尿病发生中的可能作用。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化

目的：探讨小香猪骨髓间充质干细胞（MSC）向成骨细胞和成软骨细胞诱导分化的能力。方法：选用早期贴壁培养的小香猪骨髓MSC，在传代两三次后加入条件培养基，观察了细胞的形态学变化，同时检测碱性磷酸酶、钙盐沉积以及细胞外基质和Ⅱ型胶原的表达。结果：MSC在骨形成蛋白（BMP）、地塞米松和β－磷酸甘钠的作用下，两三天细胞从梭形变为圆形或类圆形，细胞体积增大，12－15d时细胞集落的表面可见有颗粒状物质分泌，碱性磷酸酶染色为阳性，20－25d时，分泌颗粒更加明显，核固红染色为阳性，表现出成骨细胞的特点，在培养体系中加入地塞米松和转化生长因子－β1后两三，可见细胞由类成纤维状变为圆形成椭圆形状，有的呈肾性，体积增大，10d后可见细胞周围有基质分泌，Ⅱ型胶原染色为阳性，表现为软骨细胞分化的特点。结论：在一定培养条件下成功诱导小香猪骨髓MSC向成骨细胞和成软骨细胞分化，为我们进一步的研究打下基础。     

骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞对T细胞的免疫抑制作用

本研究比较来源于正常志愿者和骨髓增生异常增生综合症一难治性贫血（MDS—RA）患者骨髓间充质干细胞（MSC）免疫抑制作用的区别。培养12例正常志愿者和12例MDS患者的骨髓MSC，比较两组MSC的形态、细胞表型、细胞因子的表达，通过植物血凝素（PHA）刺激的T细胞增殖试验、混合淋巴细胞反应和T细胞周期检测、T细胞凋亡检测等比较两组MSC对T细胞的抑制作用的区别。结果表明：两组MSC的形态、表型基本相同；MDS患者来源的MSC对PHA和同种异体抗原诱导的T细胞的抑制作用均低于正常志愿者来源的MSC；加入正常志愿者的MSC后有更多的T细胞阻滞在G0／G1期，但MDS来源的MSC的这种作用较弱；MDS来源的MSC抑制T细胞活化的能力也下降，但是抑制T细胞凋亡的能力增强。另外，MDS来源的MSC表达转化生长因子（TGF—β1,3）、FasL较正常志愿者MSC表达的明显减弱，而TGF—B2的表达却增加。结论：虽然MDS来源的MSC在形态、增殖和细胞表型上基本正常，但其对T细胞的抑制作用减弱，其异常是否与MDS的发病机制有关需要进一步的研究。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化

目的探讨小香猪骨髓间充质干细胞(MSC)向成骨细胞和成软骨细胞诱导分化的能力。方法选用早期贴壁培养的小香猪骨髓MSC,在传代两三次后加入条件培养基,观察了细胞的形态学变化,同时检测碱性磷酸酶、钙盐沉积以及细胞外基质和II型胶原的表达。结果MSC在骨形成蛋白(BMP)、地塞米松和β-磷酸甘油钠的作用下,两三天细胞从梭形变为圆形或类圆形,细胞体积增大,12～15d时细胞集落的表面可见有颗粒状物质分泌,碱性磷酸酶染色为阳性,20～25d时,分泌颗粒更加明显,核固红染色为阳性,表现出成骨细胞的特点;在培养体系中加入地塞米松和转化生长因子-β1后两三天,可见细胞由类成纤维状变为圆形或椭圆形状,有的呈肾性,体积增大,10d后可见细胞周围有基质分泌,II型胶原染色为阳性,表现为软骨细胞分化的特点。结论在一定培养条件下成功诱导小香猪骨髓MSC向成骨细胞和成软骨细胞分化,为我们进一步的研究打下基础。     

骨髓脂肪细胞促进多发性骨髓瘤细胞生存并上调抗药性

目的：探讨多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓微环境中脂肪细胞（Ad）在MM发生、发展中的作用。方法：油红O染色分析正常供者（HD）及初诊MM(ND-MM)患者骨髓涂片中骨髓脂肪细胞（BMA）含量。分别收集正常供者及初诊MM患者间充质干细胞（MSC），采用体外共培养试验探讨MM细胞对MSC成脂分化的影响以及BMA在MM细胞生存和耐药中的作用。实时定量PCR法检测MSC及MSC衍生Ad中成脂及成骨分化相关基因PPAR-γ、DLK1、DGAT1、FABP4、FASN和ALP表达，蛋白印迹法检测含或不含PPAR-γ抑制剂G3335共培养上清中IL-6、IL-10、SDF-1α、TNF-α和IGF-1水平。结果：油红O染色结果显示，与正常对照相比，ND-MM骨髓涂片阳性BMA显著增多，且与疾病状态相关，治疗有效者骨髓BMA含量下降；MM细胞明显上调了MSC成脂分化相关基因PPAR-γ、DLK1、DGAT1、FABP4和FASN的表达水平，而成骨分化相关基因ALP则明显下调。在MM骨髓微环境中MM细胞与MSC相互作用的直接后果是以成骨细胞为代价促进MSC向Ad分化，且该类Ad的细胞因子分泌谱发生变化。P...     

腐胺促进人骨髓间充质干细胞成骨分化

目的:探索腐胺对人骨髓间充质干细胞(MSC)增殖分化的影响,以期建立一种新的MSC成骨分化诱导体系。方法:采集3份健康人骨髓MSC,应用MTT实验检测腐胺对细胞增殖的影响。实验分为:1腐胺组(100μmol/L腐胺),2阳性对照组(加入以地塞米松、抗坏酸磷酸盐和β-磷酸甘油组成的标准诱导体系),3阴性对照组(未加腐胺体系),MSC培养1周后应用PCR法检测细胞Runx-2表达水平,2周后进行碱性磷酸酶原位组织化学染色,并将部分细胞裂解后测定细胞碱性磷酸酶活性及蛋白质浓度。此外,以标准成脂分化诱导体系为阳性对照,MSC培养体系中加入腐胺,培养2周后油红O染色,观察腐胺诱导MSC成脂细胞分化作用。结果:在一定范围内腐胺促进人骨髓MSC增殖,且效应呈浓度依赖性。腐胺(100μmol/L)培养MSC 1周后,细胞Runx-2表达水平显著增加;2周后,组织化学染色显示,细胞呈现明显的碱性磷酸酶活性,单位细胞蛋白质浓度内酶活性显著高于阴性对照组(0.87±0.012 vs 0.52±0.010)(P0.01),也明显高于阳性对照组(0.83±0.029)(P=0.02)。在该浓度下,油红O染色显示腐胺组MSC未发生脂肪细胞分化。结论:腐胺可促进MSC增殖并促使其向成骨细胞分化,可作为MSC体外成骨细胞分化新诱导成分之一。     

miR-3960对成骨细胞分化的影响

背景:成骨细胞的分化成熟过程涉及多种激素和细胞因子对成骨细胞分化相关基因表达的调控,近来发现多个微小RNAs也参与了这一调控过程。目的:观察miR-3960在小鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中的作用。方法:将miR-3960表达载体pSilencer4.1-miR-3960转染骨髓基质细胞,构建miR-3960过表达细胞模型,随后予300μg/L骨形态发生蛋白2诱导分化,观察成骨细胞分化指标变化。结果与结论:转染pSilencer4.1-miR-3960能够在细胞中稳定地高表达miR-3960。miR-3960过表达促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中的碱性磷酸酶活性增高和骨钙素分泌,增加细胞中的钙沉积量。抑制miR-3960降低骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中的碱性磷酸酶活性,减少骨钙素分泌,降低钙沉积量。表明miR-3960可以促进成骨细胞分化。     

复合骨形态发生蛋白2及碱性成纤维细胞生长因子注射型骨修复材料对兔骨髓基质细胞增殖和超微结构的影响

目的观察以纤维蛋白胶(fibrinsealant,FS)为载体的注射型骨修复材料对体外培养的兔骨髓基质细胞(marrowstromalcell,MSC)增殖和超微结构的影响。方法实验分组为实验组(FS+bFGF+rhBMP-2)、对照组1(FS)、对照组2(FS+bFGF)、对照组3(FS+rhBMP-2)及单纯对照组。采用细胞培养、MTT及电镜等方法对各组兔MSC的增殖及超微结构进行研究。结果(1)各组材料对细胞促增殖作用由强到弱依次是:对照组2(FS+bFGF)、实验组(FS+bFGF+rhBMP-2)、对照组1(FS)、对照组3(FS+rhBMP-2)、单纯对照组,差异有显著性(P<0.05);(2)扫描电镜观察发现,材料表面粗糙,有微孔存在,各组细胞与材料融合生长。透射电镜观察发现:实验组的绝大部分细胞呈成骨细胞表型,细胞增殖状态旺盛,分化好。各对照组细胞或是细胞增殖活性高,但向成骨细胞表型分化差,或是向成骨细胞表型分化好,但细胞增殖活性较差。结论FS+bFGF+rhBMP-2即可显著促进MSC增殖和兔MSC向成骨细胞方向的分化水平。     

间充质干细胞来源的成骨细胞具有免疫调控能力

为了探讨来源于间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的成骨细胞的免疫调控能力，将MSC在成骨诱导体系中诱导分化1周后用MTT法检测细胞生长变化，流式细胞术鉴定其免疫表型改变，淋巴母细胞转化实验观察其免疫调控能力。结果表明，MSC在向成骨诱导过程中细胞生长迅速，明显快于未诱导的MSC，细胞表型未发生明显变化，即CD73，CD105，CD44，CD29等仍为强阳性，而造血细胞的表面标志CD34，CD45和参与免疫反应的细胞表面分子HLA—DR，CD86等仍为阴性。淋巴母细胞转化实验结果显示，源于MSC的成骨细胞具有免疫调控能力，且随着成骨细胞量的增多，抑制T细胞增殖能力越强。结论：MSC来源的成骨细胞具有免疫调控能力。     

人骨髓间充质干细胞对脐血T淋巴细胞转化的影响

为研究间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）的免疫调节作用，从人骨髓中分离培养间充质干细胞，并通过其形态的均一性及流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度。将分离培养的间充质干细胞接种于96孔板中（分别为2000个/孔组与1000个/孔组），与经分离的脐血T淋巴细胞共培养3天，以单独培养的脐血T淋巴细胞为对照组，加入植物血凝素（PHA）刺激60小时，H^3-TdR标记后用液体闪烁计数仪检测，以观察MSC对脐血T淋巴细胞转化的影响。结果显示，当接种2000个MSC时，其对T细胞的增殖起抑制作用（抑制率为33.4％）；而接种1000个MSC时，其对T细胞的增殖起促进作用（促进率为22.5％）。由此得出结论，MSC免疫调控作用与其加入细胞数量相关，当MSC数量多时表现为负调控，而当MSC数量少时表现为正调控。     

间充质干细胞分化的内皮细胞有免疫调控作用

为了探讨间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）诱导而来的内皮细胞的免疫调控能力，将人骨髓MSC在体外经VEGF诱导分化为内皮细胞，并用倒置相差显微镜和流式细胞术分别观察和检测细胞的形态和免疫表型，用淋巴细胞转化实验观察其免疫调控能力。结果表明：MSC在向内皮细胞分化的体系中生长迅速，诱导后的细胞经von Willebrand factor（vWF）免疫荧光染色呈阳性，能在Matrigel上形成毛细血管样网状结构。细胞表面标记无明显改变，即CD73、CD105、HLA—ABC仍阳性，CD34、CD80、CD86、HLA—DR、CD31仍为阴性。由MSC诱导分化而来的内皮细胞能抑制T淋巴细胞的增殖，其抑制作用随内皮细胞加入量的增多而增强。结论：由骨髓MSC来源的内皮细胞对T淋巴细胞具有调控作用。     

多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞生物学特性分析

为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor，SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31；MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能；MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常；MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论：MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。     

骨髓间充质干细胞分化的成骨细胞支持脐血造血干祖细胞的研究

本研究利用骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞构建二维培养体系,探讨其体外支持脐血干/祖细胞生存的作用.体外进行人骨髓间充质干细胞（MSC）原代培养后诱导为成骨细胞,构建二维培养体系.将免疫磁珠分选的CD34^＋脐血干/祖细胞接种于其中,在无外源性细胞因子情况下进行体外培养,进行CFU,HPP-CFU和LTC-IC测定并将其分别与MSC、成骨细胞,MSC/成骨细胞（1：2）作为饲养细胞的二维培养体系实验结果相比较.结果发现：在所构建的造血干/祖细胞（HSPC）二维培养体系中,骨髓MSC诱导成骨细胞对于脐血造血干/祖细胞培养的支持作用显著优于其他各组培养体系,尤其对长期造血干细胞（long term-HSC）体外生存有更为明显地支持作用.结论：骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞构建的二维体系对于脐血干/祖细胞体外培养具有支持作用,进一步证实成骨细胞对造血干细胞生存与增殖具有重要调控作用.     

小鼠骨髓间充质干细胞对胚胎干细胞造血分化的影响

骨髓间充质干细胞作为骨髓基质细胞的前体细胞 ,在体外具有一定的造血支持作用 ,与造血干细胞共移植可促进其植入。本研究旨在初步探讨应用小鼠骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养作为一种新的分化体系的可行性。首先分离、培养并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞 ,然后利用扩增培养的骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养 ,通过造血集落培养和RT PCR观察造血分化的特点。结果表明 ,分离、扩增培养至第四代之后的骨髓间充质干细胞形态均一 ,高表达Sca 1,CD2 9,CD4 4和CD10 5 ,而CD34和CD4 5等造血与内皮细胞特异性表面标志呈阴性 ;特异性诱导体系内传代后 (>4代 )的骨髓间充质干细胞可向脂肪细胞和成骨细胞分化。与悬浮分化体系相比 ,骨髓间充质干细胞共培养体系中初始分化的胚胎干细胞含有显著增加的拟胚体形成细胞而没有造血集落形成细胞。此外 ,RT PCR检测发现 :共培养细胞表达胚胎干细胞特异性转录因子Oct 4 ,而造血标记Flk 1,GATA 1和 β H1为阴性。结论 :间充质干细胞在一定程度上抑制了胚胎干细胞的初始分化 ,但是共培养体系来源的拟胚体产生造血集落的能力显著高于悬浮体系     

人骨髓间充质干细胞分离鉴定方法的改进

本研究的目的是建立一种基于临床移植需要的分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSC）的方法,为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验基础.采用Percoll分离液（1.073/gml）从新鲜成人骨髓穿刺液中分离MSC,应用贴壁筛选法传代培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系（地塞米松0.1 μmol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50μmol/L）及脂肪诱导体系（地塞米松1μmol/L、牛胰岛素5 mg/L、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤0.5 mmol/L、消炎痛60μmol/L）分别诱导MSC定向分化,通过细胞形态观察及免疫化学染色进行鉴定.结果表明：从成人骨髓液中分离培养出MSC,稳定表达CD73、CD105、CD166,不表达CD34、CD45.定向诱导的成骨细胞表达碱性磷酸酶活性,脂肪细胞内出现明显的脂滴.结论：采用密度梯度离心联合贴壁筛选法并通过流式细胞术检测及定向诱导分化,能够从成人骨髓液中分离出MSC,并完成细胞表型及多向分化潜能的初步鉴定.本操作方案具有一定的临床应用价值.     

人骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用

为了探讨人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）体外对T淋巴细胞的免疫调节作用，从人骨髓液中分离培养MSC，通过细胞形态、免疫组织化学及流式细胞术检测其表面标记进行鉴定；将植物血凝素（PHA）及从人脐血中分离培养的树突状细胞（dendritic cell，DC）作为刺激因素，经磁珠分选的人CD2^＋ T淋巴细胞作为反应细胞．用^3H—TdR标记β液体闪烁计数仪检测与MSC共培养前后T淋巴细胞增殖能力的变化；用流式细胞术检测与MSC共培养10天后的CD2^＋ T细胞内各亚群Th1、Th2、Tc1、Tc2比例的变化。结果表明：MSC能明显抑制由DC诱导的T淋巴细胞增殖（P=0．004），同时MSC抑制由PHA引起的T细胞增殖，但不具有显著性差异（P=0．26），MSC培养上清液单独并不具备抑制T细胞增殖的作用，与MSC共培养后的T细胞亚群中，Th2及Tc2亚群含量较共培养前明显增加（P〈0．05）。结论：MSC对由DC和PHA诱导的淋巴细胞增殖反应均具有抑制作用，并且这种作用可能与细胞间相互作用及诱导T细胞亚群的改变有关。     

Fucoidan‐induced osteogenic differentiation promotes angiogenesis by inducing vascular endothelial growth factor secretion and accelerates bone repair

Osteogenesis and angiogenesis, including cell–cell communication between blood vessel cells and bone cells, are essential for bone repair. Fucoidan is a chemical compound that has a variety of biological activities. It stimulates osteoblast differentiation in human mesenchymal stem cells (MSCs), which in turn induces angiogenesis. However, the mechanism by which this communication between osteoblasts and endothelial cells is mediated remains unclear. Thus, the aim of this study was to clarify the relationship between fucoidan‐induced osteoblastic differentiation in MSCs and angiogenesis in endothelial cells. First, the effect was confirmed of fucoidan on osteoblast differentiation in MSCs and obtained conditioned media from these cells (Fucoidan‐MSC‐CM). Next, the angiogenic activity of Fucoidan‐MSC‐CM was investigated and it was found that it stimulated angiogenesis, demonstrated by proliferation, tube formation, migration and sprout capillary formation in human umbilical vein endothelial cells. Messenger ribonucleic acid expression and protein secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF) were dramatically increased during fucoidan‐induced osteoblast differentiation and that its angiogenic activities were reduced by a VEGF/VEGF receptor‐specific binding inhibitor. Furthermore, Fucoidan‐MSC‐CM increased the phosphorylation of mitogen‐activated protein kinase and PI3K/AKT/eNOS signalling pathway, and that its angiogenic effects were markedly suppressed by SB203580 and AKT 1/2 inhibitor. Finally, an in vivo study was conducted and it was found that fucoidan accelerated new blood vessel formation and partially promoted bone formation in a rabbit model of a calvarial bone defect. This is the first study to investigate the angiogenic effect of fucoidan‐induced osteoblastic differentiation through VEGF secretion, suggesting the therapeutic potential of fucoidan for enhancing bone repair.