人毛乳头细胞HSPC016基因在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的 构建人毛乳头细胞HSPC016基因的原核表达载体,诱导其表达并对目的蛋白基本生物学特性进行鉴定。方法采用PCR技术从pcDNA3．1( )／HSPC016中扩增出195bp目的基因,克隆至pMD18-T载体,双酶切回收纯化目的片段后连接至同样酶切回收的表达载体pEql-28a( )质粒中。重组质粒经酶切及测序鉴定后转化工程菌E．coli B12l,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测,UVP图像扫描分析并对目的蛋白进行N-端氨基酸测序鉴定。结果采用PCR技术成功地从peDNA3．1( )／HSPC016中扩增出195bp目的基因,序列分析显示HSPC016基因ORF由195bp组成并与GenBank公布序列完全一致。原核表达载体pET：28a( )／HSPC016转化工程菌E.coli BL21并经诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定：目的蛋白Mr约为7200,与理论预测值相吻合;UVP扫描表明目的蛋白表达率约20％。N-端氨基酸测序结果与预期序列完全一致。结论HSPC016基因能通过原核载体pET：28a( )及工程菌E．coli BL2l进行高效、正确地表达,为研究HSPC016基因表达的生物学意义奠定了基础。     

趋化因子MIP-3α的克隆与表达

目的 克隆人趋化因子MIP-3α基因，表达并初步纯化MIP-3α融合蛋白。方法从扁桃体中提取总RNA，再进行RT-PCR，扩增MIP-3a成熟蛋白基因，并在5’和3’分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点，通过这两个酶切位点重组于pET32a( )载体上，转化E．coli．DH5α，筛选阳性克隆，酶切鉴定，DNA测序检测插入序列的正确性，缺失突变获得MIP-3α天然蛋白表达载体pET32a( )／MIP-3α，SDS-PAGE分析其表达，Westernblot验证融合蛋白。大量表达并初步纯化MIP-3α融合蛋白。结果 成功克隆了MIP-3α基因，表达并初步纯化得到MIP-3α融合蛋白。结论构建的MIP-3α硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式表达MIP-3α硫氧还蛋白。     

小鼠LIGHT胞外段基因原核表达质粒的构建及表达

目的 构建含有LIGHT胞外段的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法 从由小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增LIGHT胞外段,克隆至原核表达载体pEF-24a( )中,构建重组表达质粒pET24-LIGHYECD.重组质粒经酶切鉴定及序列测定后,转化E. coli BL21,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果 RT-PCR扩增出了525 bp LIGHT胞外段的cDNA,经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出相对分子质量为20 000的LIGHT胞外段蛋白.结论 成功地克隆了小鼠LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达,为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

人分泌型白细胞介素-16基因的克隆及其原核表达

目的:克隆人分泌型IL-6 cDNA,构建IL-16的原核表达质粒,并观察其在大肠杆菌中的表达.方法:采用PCR技术从健康成人外周血单个核细胞(PBMC)总cDNA文库中扩增人分泌型IL-16 DNA片段;PCR产物分离纯化后,将其克隆至pUC18-T载体中,经PCR、酶切鉴定及DNA测序确证后,将该基因定向插入原核表达载体pMAL-C2,获得重组质粒pMAL-IL-16,然后将其转化至E.coli DH5α,经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE及Western blot法鉴定表达产物.结果:获得了编码人分泌型IL-16的cDNA,经测序证明其长度为393 bp,编码130个氨基酸;构建了IL-16原核表达载体,并应用E.coli DH5α表达,得到1个相对分子质量(Mr)约56000的IL-16重组融合蛋白,与理论大小相符,且经SDS-PAGE及Western blot法验证.表明人分泌型IL-16原核表达载体构建并表达成功.结论:本实验成功克隆了人分泌型IL-16 cDNA,构建了IL-16原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,为IL-16的纯化奠定了基础.     

颗粒溶素重组表达载体的构建和原核表达

目的：构建人颗粒溶素（Granulysin,GNLY）基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：抽提体外培养的单个核细胞总RNA,通过RT-PCR的方法获得含有222bp的颗粒溶素cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a（＋）中,构建重组表达质粒pET28a（＋）-GNLY,在大肠杆菌中诱导表达并经Ni亲和层析纯化。用SDS-PAGE和Westernblot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GNLY融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实,成功地构建了GN-LY原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量（Mr）同预期值相一致。结论：成功构建了重组表达质粒pET28a（＋）-GNLY,并在大肠杆菌BL21（DE3）plysS中表达,获得了具有良好的抗原性和特异性的GNLY融合蛋白,为下一步研究人GNLY的功能奠定了基础。     

人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的：构建人Cyclin E基因原核表达载体,并在E.coli BL21中表达并纯化。方法：PCR扩增人Cyclin E基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E。经限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得全长约为1200bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E转化E.coli BL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论：成功地构建了表达载体pET32a（＋）-Cyclin E,并表达出重组蛋白His-Cyclin E,为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。     

HPV16型E6重组蛋白的表达及其兔多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E6原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法通过PCR法从Siha细胞株中获取HPV16 E6基因后克隆至pET21a(+)载体,构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;将重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至E.coli BL21(DE3)中,通过异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达HPV16 E6-His标签融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后通过Western blot法鉴定;将纯化的HPV16型E6重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体, ELISA检测免疫后血清多克隆抗体效价,并用Western blot法和免疫荧光技术分析HPV16 E6兔多克隆抗体的特异性。结果成功构建pET21a(+)/HPV16 E6重组质粒,并经测序鉴定;在重组质粒pET21a(+)/HPV16 E6转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,经亲和层析法获得纯化的HPV16型E6重组蛋白,用于免疫日本大耳白兔获得多克隆抗体,抗体效价为1∶40 000,并用Western blot法和免疫荧光技术确认了多克隆抗体的特异性。结论 HPV16 E6原核表达成功并制备了HPV16 E6兔多克隆抗体。     

人LIGHT胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人LIGHT胞外段基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:从人外周血单核细胞来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR得到LIGHT胞外段基因,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果:RT-PCR扩增出了大小为543 bp 的LIGHT胞外段基因,经测序证明序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的蛋白.结论:成功地克隆了人LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

小鼠B7-DC胞外段原核表达载体的构建及表达

目的: 构建小鼠B7-DC胞外段基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21中诱导表达.方法: 从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(DC)中提取总RNA, 经RT-PCR扩增B7-DC胞外段, 并将其克隆至原核表达载体pET32a( )中, 构建重组表达质粒pET32a( )-B7-DCECD.重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达目的蛋白, 并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果: 获得全长为582 bp的小鼠B7-DC胞外段基因, 经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的B7-DC胞外段蛋白.结论: 成功地构建了小鼠B7-DC胞外段基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中进行表达, 为进一步研究B7-DC的功能奠定实验基础.     

人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建

在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因并获得真核表达载体。由人成骨瘤细胞中提取总RNA，利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA；将此基因片段重组到pGEM-T克隆载体中，转化到大肠杆菌DH5α后，蓝白斑筛选阳性克隆，利用限制性酶切、PCR扩增和核苷酸序列分析鉴定重组质粒；将pGEM-T克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体中，用限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。结果表明：重组在两种质粒中的基因片段为人骨形成蛋白2基因全编码序列。克隆获得人骨形成蛋白2基因．并得到此基因的真核表达载体，为人骨形成蛋白2的表达打下了基础。     

蛇毒金属蛋白酶抑制剂基因的合成及杆状病毒表达载体的构建

研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂（BJ46a）基因的合成及杆状病毒表达载体的构建。根据GenBank中查找的BJ46a基因序列（AF294836），将其分为20个片段，通过缓慢退火PCR法使之拼接为完整的BJ46a基因，经SacⅠ及XhoⅠ双酶切后定向克隆到载体pET-42a（＋）中，PCR扩增、酶切及测序鉴定；根据测序结果用定点突变法逐一改正错误位点。随后将该基因插入到转座载体pFastBac HT C的MCS中，转化大肠杆菌DH5 α-T1，以LB／AP平板筛选阳性重组子，PCR扩增、酶切鉴定，提取pFastBac HT C-BJ46a重组体进一步转化DH10Bac感受态细胞，48h后通过蓝白筛选，挑取单个白色菌落划线，证实所得菌落均为白斑，挑克隆PCR鉴定。结果表明成功构建杆状病毒重组转座载体、重组穿梭载体。含BJ46a基因的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，获得目的蛋白的表达。BJ46a基因的合成及杆状病毒表达载体的成功构建，为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。     

HIV-1 nef基因的克隆及原核表达研究

目的:构建HIV-1 Nef基因的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达,初步优化其表达条件。方法:利用特异性引物PCR扩增获得HIV-1 Nef基因片段,PCR产物经限制性内切酶双酶切后连接载体pET24a(+),构建重组质粒pET24a(+)-Nef。经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coliBL21,IPTG诱导表达目的蛋白,优化表达条件,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定表达产物。结果:PCR扩增获得618bpDNA片段,酶切鉴定结果表明HIV Nef基因已克隆入原核表达载体pET24a(+)中,测序证明序列正确。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组菌诱导后可表达相对分子质量(Mr)符合预期的融合蛋白。0.1mmol/LIPTG在37℃诱导6h为最佳表达条件,重组蛋白表达量可由15.8%增加到43.9%。结论:在大肠杆菌中成功地表达了HIV Nef蛋白,并初步获得了最优化的表达条件。     

人乳头瘤病毒16型 E5基因克隆、原核表达及产物鉴定

目的 克隆HPVl6 E5基因,构建原核重组工程菌并诱导表达,对表达产物HPVl6E5蛋白进行鉴定.方法 提取宫颈癌组织DNA作为模板,用PCR方法扩增HPVl6 E5基因,经BamH I和HindⅢ双酶切后,插入相同酶切的pET21b载体质粒,转化DH5α,筛选阳性克隆.经酶切和测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),建屯重组工程菌株pET21b-HPVl6E5/BL21(DE3).经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物.结果 HPVl6 E5基因扩增片段0.27kb.测定序列与HPVl6原型株E5基因比较,出现4处核苷酸变异,分别为3979、4042、4077和4089位,引起144L和165V氨基酸改变.重组质粒经酶切和序列测定证实构建正确.SDS-PAGE分析重组菌在16 kDa处出现蛋白条带.该蛋白条带可被组氨酸标签单克隆抗体特异性识别.结论 成功克隆HPVl6E5基因,并构建原核表达质粒,E5 蛋白在BL21(DE3)中表达.本实验为进一步研究E5生物学活性、转化活性和肿瘤杀伤免疫作用奠定了实验基础.     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的:构建人CIDE-3基因的原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA,经RT-PCR扩增人CIDE-3基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a( )中,构建重组质粒pET28a( )-CIDE-3。经限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得全长为516bp的人CIDE-3基因片段。以构建的重组质粒pET28a( )-CIDE-3转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为23000的重组CIDE-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21(DE3)的胞质中,表达量约占全菌蛋白的32%。结论:成功地构建了原核表达载体pET28a( )-CIDE-3,并表达出重组CIDE-3蛋白,为进一步多克隆抗体的制备和凋亡的相关研究奠定了实验基础。     

粉尘螨Ⅰ类抗原cDNA的克隆表达和初步鉴定

目的　构建粉尘螨Ⅰ类抗原 (Derf1)cDNA基因的重组表达质粒 ,并于E .coli表达。方法　用BamHⅠ和SacⅠ从重组质粒pMD 18T Derf 1上切下Derf1基因 ,插入表达载体pET32a( )质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1,在氨苄青霉素阳性的LB平板上筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒pET32a( ) Derf 1转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SDS PAGE电泳和薄层凝胶扫描定量分析。结果　对重组质粒进行酶切和PCR鉴定 ,与预期结果相符 ,证明已成功构建携带Derf1基因的重组原核表达质粒pET32a( ) Derf 1。核酸序列测定及同源性分析证实所构建的原核表达质粒pET32a( ) Derf1中所含的Derf1基因与GenBank中的Derf1序列同源性达到 99.5 %。Derf 1基因在大肠杆菌诱导表达后获得Mr 约4 5 0 0 0的蛋白 ,蛋白含量占全菌体蛋白含量的 15 %。结论　成功构建了粉尘螨Ⅰ类抗原cDNA基因的重组表达质粒pET32a( ) Derf 1,并在大肠杆菌中获得高效表达 ,为获得重组纯化Derf 1变应原并用于尘螨变应性疾病的诊治奠定基础     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain—like基因片段，构建原核表达载体，诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入SalI和EcoRI酶切位点。应用FIT—PCR扩增弓形虫RH株Calpain—like基因片段，插入pGEM—T载体，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，亚克隆到原核表达质粒pET32a，重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子eDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段；含pET32a／Calpain—like的重组质粒在宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain—like基因，弓形虫Calpain—like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

我国地方品种姜曲海猪TLR5基因的克隆、表达及鉴定

目的:克隆我国地方品种姜曲海猪TLR5基因,构建该基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白并鉴定其免疫特性,为进一步研制TLR5单克隆抗体(mAb)提供免疫原。方法:从全血中提取姜曲海猪的基因组,设计特异性引物,利用PCR方法扩增得到TLR5基因片段,PCR产物克隆到原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达质粒pET-TLR5,将重组表达质粒转化E.coli BL21,0.5 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定蛋白活性。结果:成功扩增出猪TLR5基因片段,大小为2 571 bp。酶切鉴定结果表明,猪的TLR5基因成功克隆入原核表达载体pET30a(+)中,重组质粒pET-TLR5在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示出相对分子质量(Mr)大小约95 200;Western blot结果表明,表达产物与兔抗小鼠TLR5 mAb具有良好的反应性。结论:成功克隆并表达具有较好免疫原性的猪TLR5分子,为其mAb的制备提供生物材料。     

牛IgG2Fc受体（boFcγ2R）胞外区基因原核表达载体的构建及其表达

目的：构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体，并在E.coli BL21（DE3）中表达。方法：提取健康成年牛的白细胞总RNA，经RT-PCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段，并将其克隆到载体pGEM-TEasy，经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切鉴定及序列测定后，再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中，构建重组质粒pET-2R，转化E.coli BL21（DE3）经LPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得682bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段。以构建的重组质粒pET-2R转化E.coli BL21（DE3）后，经IPTG诱导，表达出相对分子质量（Mr）约为30000的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coli BL21（DE3）的胞质中，Western blot检测表明该蛋白能和牛IgG2结合。结论：成功地构建了原核表达载体pET-2R，并表达出重组蛋白。为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。     

天花粉蛋白突变体TCSFYY163-165CSA的构建表达与纯化

目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并在原核系统进行表达及纯化。方法:应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇(FYY163-165),并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模扳,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序。将阳性重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western blot法鉴定和Ni-NTA层析纯化。结果:构建了带有TCS突变体基因(TCSFYY163-165CSA)的重组表达质粒,使目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论:成功地构建了TCS突变体基因TCSFYY163-165CSA,并获得高效表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径。     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。