麦氏弧菌多位点序列分型方法的建立与应用

目的建立针对麦氏弧菌的多位点序列分型（MLST）方法,评价该方法的分型效果,并对收集的麦氏弧菌进行MLST分析。方法筛选出7个管家基因（ftsZ、gapA、mreB、gyrB、purM、recA、ropA）,设计特异引物,在17株麦氏弧菌中PCR扩增管家基因序列。 用DnaSP 6.12.03软件和Split tree 4.0软件评价基因多态性、中性进化和基因重组情况;根据7个管家基因的序列差异获得对应的序列分型（ST）型别,用BioNumerics 7.1软件对不同ST型别构建最小生成树和聚类图,并用eBURST 3.0软件计算克隆复合体（CCs）。结果所选的管家基因具有足够多的等位基因位点、序列差异和足够高的分辨率;7个管家基因的Split tree对所有麦氏弧菌的聚类一致;中性试验结果显示,7个管家基因在进化过程中受遗传漂变的影响较小。 MLST将17株麦氏弧菌分成14个ST型别,大多数菌株（64.70%）均单独形成一个ST型别,其中ST007形成了可能的优势克隆群。 这些菌株之间存在相对较远的遗传距离,在垂直传播上呈现出潜在的地域聚集性。结论本研究建立的麦氏弧菌的MLST方法能分析麦氏弧菌的种群结构和遗传进化关系。     

重复序列PCR与多位点分型技术在热带假丝酵母菌基因分型中的比较

目的分析比较重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)与多位点分型技术(MLST)在热带假丝酵母菌基因分型中的应用。方法收集来自5个地区6家医院的147株热带假丝酵母菌,分别以Ca-21、Ca-22、Com-21两两组合为引物,选用最合适的引物对进行REP-PCR后通过电泳获得REP-PCR型。在不同型别中各挑选3株采用MLST法扩增热带假丝酵母菌的6个管家基因,扩增片段测序后与数据库比对得到相应的序列型(sequencetype,ST)。结果 REP-PCR以Com21-Com21为引物对分型效果最好,REP-PCR与MLST分型结果一致。147株热带假丝酵母菌产生A～H共8种REP-PCR型,分别对应MLST的ST146、新型1、ST136、ST127、ST177、ST169、新型2和ST117。结论 REP-PCR与MLST在热带假丝酵母菌的基因分型中分辨率相同,而REP-PCR更为方便迅速,可作为实验室大量菌株分型的首选方法。     

艰难梭菌感染主要ST型菌株生物学特征的比较

目的探究致医院感染性腹泻艰难梭菌主要序列型别(ST81、ST8和ST42)之间的毒力特征、芽孢形成能力及耐药机制等方面的差异。方法收集2017年9月至2019年9月首都医科大学附属北京友谊医院临床住院腹泻患者送检艰难梭菌培养的稀便标本816份进行艰难梭菌分离和培养。以该院主要序列型别的艰难梭菌ST81(26株)、ST8(15株)和ST42(14株)为实验菌株。应用聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫荧光法分别检测艰难梭菌的毒素基因和毒素A/B蛋白的表达;采用平板涂布法检测艰难梭菌的芽孢形成能力;采用琼脂稀释法检测艰难梭菌对11种抗菌药物的耐药性;采用PCR方法扩增耐药基因、测序及氨基酸突变分析艰难梭菌携带的耐药基因和氨基酸的突变位点。计量资料的组间比较采用Kruskal Wallis秩和检验, 率的比较采用Fisher精确检验。结果 ST81型菌株为tcdA-tcdB+/cdtA-cdtB-毒素型别, ST8和ST42型菌株均为tcdA+tcdB+/cdtA-cdtB-毒素型别, ST42、ST8和ST81型别菌株产生毒素A/B蛋白的产量分别为41.9、2.4和0.83, ST42和ST8...     

某院产ESBLs大肠埃希菌多位点序列分型研究

目的了解郑州大学附属肿瘤医院临床和环境中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌多位点序列分型(MLST)及其遗传进化关系,为监测产ESBLs菌株的流行和医院感染控制提供依据。方法采用基因扩增和测序的方法对26株产ESBLs大肠埃希菌7个管家基因进行序列分析,并与MLST数据库比对,得到每个菌株相应的等位基因号。结果 26株产ESBLs大肠埃希菌获得16种序列分型(ST),其中3株为ST69型、3株为ST131型。结论产ESBLs大肠埃希菌遗传背景多样化,ST131型和ST69型为本研究主要型别,其它型别散在分布。     

炎症性肠病患者中艰难梭菌感染的分子流行特征

目的初歩研究上海仁济医院炎症性肠病患者中艰难梭菌的分子流行特征,为炎症性肠病患者中艰难梭菌感染的监控提供证据。方法对2014年6月-2015年6月的222份炎症性肠病腹泻患者粪便标本进行艰难梭菌毒素检测和厌氧培养。采用多位点序列分型(MLST)进行分型,传统PCR方法检测其毒素基因,琼脂稀释法检测艰难梭菌体外药物敏感性,同时对炎症性肠病患者所在病房进行环境中艰难梭菌检测。结果222份粪便标本中艰难梭菌的检出率为13.5%(30/222),克罗恩病和溃疡性结肠炎患者中艰难梭菌检出率为15.7%(22/140)和9.8%(8/82),病房环境共检出4株艰难梭菌。MLST分型22株艰难梭菌为14种ST型,主要型别为ST54型。PCR检测毒素基因显示;TaM+raffl+菌株为主(72.7%,16/22),未检出二元毒素。22株艰难梭菌对氯霉素、四环素、氨苄西林、甲硝唑、万古霉素和美罗培南均敏感,对克林霉素耐药率较高,为63.6%,8株对莫西沙星耐药。结论炎症性肠病腹泻患者中艰难梭菌毒素基因以TcdA+TcdB+型为主,菌株克隆以ST54型为主,该型菌株在病房环境中也有检出。应当密切监测炎症性肠病患者中艰难梭菌的感染毒素基因。     

艰难梭菌分子分型技术研究进展

艰难梭菌是一种革兰阳性的专性厌氧产芽孢杆菌。核糖体027型高毒力株在发达国家的多次暴发使得艰难梭菌越来越引起重视,近年来艰难梭菌感染的发生频率已在全世界范围内呈显著上升趋势。目前该菌的分子流行病学研究进展较快,常用的分子分型方法包括限制性酶切分型、PCR核糖体分型、脉冲场凝胶电泳、多位点序列分析、重复序列PCR分型、多位点可变数目串联重复序列分析、毒素分型和全基因组测序分析等。同时,仍有不断改进的新型分子分型方法应用于此,以期更准确、快速和有效地对艰难梭菌感染暴发进行识别与调查,为艰难梭菌的感染防控提供可靠的分子流行病学数据。     

艰难梭菌毒素基因检测及分子流行病学分析

目的了解腹泻患者艰难梭菌感染现状,并分析分离菌株的核糖体分型情况。方法收集161例住院腹泻患者粪便标本进行艰难梭菌毒素基因PCR检测,同时进行产毒培养法,并比较2种方法的一致性;对分离的艰难梭菌进行核糖体分型。结果艰难梭菌产毒培养法阳性率为9.94%(16/161),粪便艰难梭菌毒素基因阳性率为9.94%(16/161),2种方法结果差异无统计学(P0.05),一致性较好(Kappa0.75)。培养所得18株艰难梭菌中A、B毒素基因均阴性的2株(11.11%),tcdA~+tcdB~+产毒株15株(83.33%),tcdA~-tcdB~+1株(5.56%)。18株艰难梭菌核糖体分型分为16种型别(GS1～GS16),未发现核糖体分型027型菌株。结论艰难梭菌粪便毒素基因PCR检测可用于临床诊断,未发现本院艰难梭菌暴发流行。     

浙江地区临床分离粪肠球菌的多位点序列分型及耐药性分析

目的对粪肠球菌进行多位点序列分析(MLST),探讨浙江地 区粪肠球菌的分子分型与耐药性的相关性。方法收集2018年1～8月 浙江地区多家医院临床分离的粪肠球菌,总计74株;根据粪肠球菌的7个管家基因序列对74 株菌株进行多位点序列(MLST)分型;同时对该74株菌株进行药敏实验,分析MLST与药物耐药 性的相关性。结果74株菌分为20个ST型,3个型别为新的型别。ST1 6和ST179是浙江地区的优势型别菌株,同属于CC16克隆复合体,两者占所有菌株的55%以上 ,其中ST16包含21株菌(占28.38%),其次为ST179,包含20株菌(占27.03%),再次是ST4和 ST6,各包含6株(占8.11%)。药敏结果显示,粪肠球菌耐药程度高的抗生素主要是四环素及 红霉素,其耐药率分别为89.2%和73%,不同ST的粪肠球菌均对这两种抗生素产生耐药。ST1 79与ST16两者耐药谱相似,区别主要是ST179对利福平均为敏感,而ST16有部分(33.3%)会 对利福平产生耐药;另外,ST6对喹诺酮类药物及高浓度的庆大霉素耐药,ST4型的粪肠球 菌会对青霉素产生耐药。结论目前浙江省粪肠球菌分离菌株主要以 CC16(包含ST16与ST179)克隆株为主,不同MLST分型的菌株与耐药可能有一定的相关性,仍 需验证。     

医院感染光滑念珠菌耐药性及流行病学分析

目的分析仁济医院光滑念珠菌的基因分型以及不同基因型光滑念珠菌的药物敏感性结果,以了解仁济医院光滑念珠菌的耐药性和流行情况,并探讨两者间是否存在相关性。方法运用多位点序列分型(MLST)技术,对34株光滑念珠菌的6个管家基因进行测序分析,利用Clustalx软件与MLST数据库进行序列比对,确定其等位基因谱型及菌株序列型(ST)。利用Clustalx软件绘制进化树,同时通过eBURST程序将菌株分为各个克隆系,以比较不同基因型之间亲缘关系的远近。采用ATB FUNGUS半自动真菌鉴定和药物敏感性分析系统进行药物敏感性试验,结合基因分型结果,运用Ridit分析方法探究两者的联系。结果 34株光滑念珠菌经MLST分型,得到6个ST,其中ST-7 27株,占总数的79.4%(27/34);ST-10 3株,占总数的8.8%(3/34),其余4型(ST-3、ST-15、ST-43、ST-55)各1株。34株光滑念珠菌对氟胞嘧啶、两性霉素B 100.0%敏感,对伏立康唑和氟康唑的敏感率分别为97.1%和91.2%,伊曲康唑抑菌效果差,敏感率仅11.8%。以ST-7为标准组,氟康唑、伏立康唑及伊曲康唑药物组中ST-10组及其他ST组均包含标准组的平均Ridit值。结论 ST-7为仁济医院光滑念珠菌中优势菌株;光滑念珠菌的耐药谱与基因型相关性差。     

2014—2018年仙桃市伤寒沙门菌分子分型及耐药性分析

目的了解仙桃市伤寒沙门菌的耐药性及分子分型特征。方法收集2014—2018年分离的29株伤寒沙门菌开展药敏试验、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型及多位点序列分型(MLST)分析。结果药敏结果显示,29株伤寒沙门菌中27株菌对26种临床常见抗菌药物均为敏感/中度敏感,余2株菌有不同程度的耐药性,其中1株菌株耐药谱分布较广,对β-内酰胺/β-内酰胺抑制剂复合物类药物耐药。PFGE结果显示,29株伤寒沙门菌可分为6种PFGE型别,其中流行优势型为HuBXTSal003型别。MLST分型显示,29株菌株共有2种序列型,其中ST2为优势ST型。结论仙桃市伤寒沙门菌株存在优势PFGE带型及优势ST型,有多重耐药菌株出现。     

婴儿艰难梭菌携带状况及菌株特征研究

目的调查婴儿艰难梭菌的携带状况及菌株特征。方法收集2015年8-11月在该院住院或门诊治疗的1岁内婴儿粪便标本238份,利用免疫层析法快速初筛艰难梭菌,阳性标本再利用CDIF平板进行厌氧培养以获得菌株,利用PCR方法检测艰难梭菌毒素A、B的编码基因tcdA、tcdB和二元毒素编码基因cdtA、cdtB,运用slpA测序分型(slpA ST)方法对菌株进行基因分型。结果 238份粪便标本共分离出50株艰难梭菌,3月、3~6月和6月至1岁三组婴儿艰难梭菌的分离率分别为9.3%,17.6%和27.3%,三组见比较差异有统计学意义(χ~2=6.940,P=0.0310.05)。52.0%(26/50)的菌株为产毒株,其中69.2%(18/26)的菌株产毒模式为tcdA+tcdB+cdtA-cdtB-。50株艰难梭菌可分为11种slpA ST型,产毒株最常见的基因型为slpA ST fr-02和kr-02,而非产毒株则为xr-03。结论 1岁内婴儿艰难梭菌携带率较高,且过半为产毒株,大多同时产毒素A和B。产毒株与非产毒株的基因型存在差别。     

多重PCR检测毒力型艰难梭菌的方法学研究及应用

目的建立多重PCR方法检测毒力型艰难梭菌。方法设计艰难梭菌种特异tpi引物和毒力基因tcdA、tcdB特异性引物,建立多重PCR方法。利用已知菌株,验证方法的特异性和最低检出限。与厌氧培养法、ELISA法比较其检测临床菌株和其毒素分泌的准确性。结果多重PCR方法检测艰难梭菌的最低检出浓度为0．7pg／IM,特异性为100％。53株厌氧培养法鉴定的艰难梭菌临床分离株,多重PCR方法检测tpi基因均为阳性,其中tcdA＋／tcdB＋为39株．tcdA一／tcdB．为14株。ELISA法检测毒素A／B显示23株为阳性、30株为阴性。23株ELISA法毒素A／B阳性的艰难梭菌多重PCR方法检测结果均为tcdA十／配拈＋。结论多重PCR方法可用于检测毒力型艰难梭菌具有较高的临床应用价值。     

杭州市富阳区住院腹泻患者艰难梭菌感染及菌株分子特征分析

目的了解浙江省杭州市富阳地区住院腹泻患者艰难梭菌感染情况,研究感染患者临床危险因素及分离菌株的分子特征。方法收集2017年5月至2018年2月就诊于第一人民医院的228例腹泻患者的粪便标本,通过厌氧培养进行艰难梭菌菌株分离和鉴定,进行多位点序列基因分型,以琼脂稀释法测定菌株耐药性,对患者临床资料进行统计分析。结果228份标本共检测出产毒型艰难梭菌41株,其中31株为医院获得性腹泻;阳性患者平均年龄67.8岁,主要来自消化内科（34.1%）和肾内科（19.5%）。 ST2、ST3和ST54为主要基因型。 所有菌株对万古霉素、甲硝唑、四环素、哌拉西林敏感。 临床资料统计分析显示,＞60周岁、患基础性疾病和有抗生素用药史的阳性患者数量远高于阴性患者比例（χ2＝4.229、9.022、5.767,P＝0.023、0.001、0.009）。结论杭州市富阳区住院腹泻患者艰难梭菌感染患者主要来源于院内感染。 患有基础性疾病、8周内有抗生素用药史的老年患者为感染的危险因素;在院内感染防控中需进一步加强监测。     

Highly variable penicillin resistance determinants PBP 2x, PBP 2b, and PBP 1a in isolates of two Streptococcus pneumoniae clonal groups, Poland 23F-16 and Poland 6B-20

Penicillin-binding proteins (PBPs) in representatives of two Streptococcus pneumoniae clonal groups that are prevalent in Poland, Poland 23F-16 and Poland 6B-20, were investigated by PBP profile analysis, antibody reactivity pattern analysis, and DNA sequence analysis of the transpeptidase (TP) domain-encoding regions of the pbp2x, pbp2b, and pbp1a genes. The isolates differed in their MICs of beta-lactam antibiotics. The majority of the 6B isolates were intermediately susceptible to penicillin (penicillin MICs, 0.12 to 0.5 microg/ml), whereas all 23F isolates were penicillin resistant (MICs, >or=2 microg/ml). The 6B isolates investigated had the same sequence type (ST), determined by multilocus sequence typing, as the Poland 6B-20 reference strain (ST315), but in the 23F group, isolates with three distinct single-locus variants (SLVs) in the ddl gene (ST173, ST272, and ST1506) were included. None of the isolates showed an identical PBP profile after labeling with Bocillin FL and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, and only one pair of 6B isolates and one pair of 23F isolates (ST173 and ST272) each contained an identical combination of PBP 2x, PBP 2b, and PBP 1a TP domains. Some 23F isolates contained PBP 3 with an apparently higher electrophoretic mobility, and this feature also did not correlate with their STs. The data document a highly variable pool of PBP genes as a result of multiple gene transfer and recombination events within and between different clonal groups.     

Cloning and hybridization analysis of ermP, a macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinant from Clostridium perfringens

The erythromycin resistance determinant from Clostridium perfringens CP592 was cloned and shown to be expressed in Escherichia coli. The resultant plasmid, pJIR122 (7.9 kilobase pairs [kb]), was unstable since in both recA+ and recA E. coli hosts spontaneous deletion of 2.7 kb, including the erythromycin resistance determinant, was observed. Subcloning, as well as deletion analysis with BAL 31, localized the erythromycin resistance gene (ermP) to within a 1.0-kb region of pJIR122. A 0.5-kb fragment internal to ermP was 32P labeled and used as an ermP-specific probe in DNA hybridization experiments which used target DNA prepared from representatives of each of the known erm classes and also from erythromycin-resistant isolates of a variety of clostridial species. Hybridizing sequences were detected in DNA from several Clostridium difficile isolates and a Clostridium paraputrificum strain; however, ermP was not widespread in erythromycin-resistant C. perfringens isolates. The ermP determinant hybridized to, and shared significant restriction identity with, the ermB class gene from the streptococcal plasmid pAM beta 1. No hybridization was detected with the other six hybridization classes of erm determinants.     

5岁以下腹泻患者分离的艰难梭菌分子型别和耐药特征分析

目的 分析中国部分地区5岁以下腹泻患儿分离的艰难梭菌的分子型别和耐药特征,为后续研究及临床用药提供数据支持.方法 收集2010-2020年云南、山东、上海、陕西、河南和北京6省市5岁以下腹泻患儿的粪便标本,通过厌氧培养分离和鉴定艰难梭菌.使用聚合酶链式反应(PCR)方法进行毒素基因检测、多位点序列分型(MLST)和核糖...     

产KPC-2 肺炎克雷伯菌的MLST 和wzi 分型分析

目的探讨产KPC-2肺炎克雷伯菌的多位点序列分型(MLST)并确定其wzi分型。方法收集南京鼓楼医院2012—2014年分离的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌108株,采用改良Hodge试验筛选产碳青霉烯酶菌株,PCR和DNA测序技术鉴定KPC-2编码基因。对产KPC-2菌株,用MLST技术分析其遗传相关性,并用PCR技术对其进行wzi分型。结果 108株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中,72株产KPC-2。72株产KPC-2菌株经MLST分型分为9个不同克隆型,其中ST11(61/72,84.7%)最为流行,其次为ST15(4/72,5.6%);72株产KPC-2细菌有7种wzi分型,wzi209(K47荚膜型)最为流行(58/72,80.6%),其次为wzi64(K64荚膜型)(6/72,8.3%)。结论产KPC-2肺炎克雷伯菌ST11型在我院存在克隆播散,大多为wzi209,荚膜型为K47,需加强感染控制措施。     

Molecular characteristics of serotype 3 Streptococcus pneumoniae isolates among community-acquired pneumonia patients in Japan

In order to understand the spread of the erythromycin-resistant serotype 3 Streptococcus pneumoniae clone in Japan, we have assessed the molecular characteristics of this clone. Among 156 S. pneumoniae isolates recovered from adults with community-acquired pneumonia between 2003 and 2005, 42 were serotype 3 and 40 were sequence type (ST) 180/Netherlands(3)-31 by multilocus sequence typing. Thirty-eight of the 40 ST 180 isolates had acquired resistance to erythromycin via the ermB gene. Although the ermB-positive ST180 clone isolates were more susceptible to penicillin and trimethoprim-sulfamethoxazole than ermB-positive non-ST180 isolates and contained a less mutated pbp1a or pbp2b gene, without a mefA gene, the ST180 clone was highly prevalent among ermB-positive isolates. Routine surveillance for the ST180 S. pneumoniae clone may soon become necessary.     

In vitro activity of efrotomycin, ciprofloxacin, and six other antimicrobials against Clostridium difficile

The susceptibility of 69 clinical isolates of Clostridium difficile from the Minneapolis Veterans Administration Medical Center and 29 C. difficile strains from other hospitals to efrotomycin, ciprofloxacin, and six other antimicrobials was tested in vitro by agar dilution. Ciprofloxin (MIC50 and MIC90 = 8 mcg/ml) was only moderately active whereas efrotomycin (MIC50 = 0.125, MIC90 = 0.25 mcg/ml) was highly active against C. difficile.