四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆

目的：应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法：将四环素抗性基因（Tet^R)克隆到载体p^BV223；根据氨基酸密码子的简并性，在保持原有氨基酸序列不变的情况下，人工合成外源基因的cDA5′端简并引物库，以hGM-CSF克隆文库，导入大肠杆菌DH5α中，构建转基因的细菌文库，在不同质量浓度（20mg/L,40mg/L,50mg/L,60mg/L)的四环素培养基中培养。结果：从高浓度四环素培养基中获得高效表达的p^BV223/hGM-CSF克隆，测序结果显示该克隆的hGM-CSFcDNA5′端序列与天然序列比较有7个碱基发生突变，且符合实验设计的要求，通过基因重组，构建成最终的高效表达克隆P^BV220d/hGM-CSF,其表达hGM-CSF的量占细菌总量的18%，较原表达水平提高80%。结论：可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。     

产黄曲霉毒素解毒酶真菌(E-20)cDNA文库的构建

目的 :构建产黄曲霉毒素解毒酶 (ADTZ)真菌 (E - 2 0 )的cDNA文库 ,为进一步筛选和克隆 (E - 2 0 )菌的特异表达基因做准备。方法 :用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建 (E - 2 0 )菌的cDNA文库 ,检测未扩增文库滴度和重组率后 ,进行文库的扩增 ,并检测扩增文库的质量。随机挑取 1 0个阳性克隆进行测序。结果 :未扩增文库滴度达 1 .0× 1 0 6pfu/mL ,重组率约为 98.9% ,扩增后滴度为 3× 1 0 8pfu/mL ,容量约为 4× 1 0 1 0 。测序结果得到 9条新的表达序列标签 (EST) ,1个 (E - 2 0 )菌的NADH -辅酶Q氧化还原酶 (NuoC)基因。结论 :E - 2 0表达型λ噬菌体cDNA文库的成功建立 ,对于该菌种中有明确功能的特异基因如ADTZ基因的克隆 ,以及新基因的克隆与功能研究提供了许多可资利用的信息     

人源性肝细胞生长刺激因子cDNA克隆和序列分析

目的 :阐明人源性肝细胞生长因子 (HDSSF)的本质 ,为进一步基因克隆奠定基础。方法 :以简并PCR扩增获取目的基因片断 ;杂交筛选人胎肝cDNA文库 ;末段终止法进行HDSSF核苷酸序列分析。结果 :简并PCR扩增出接近HDSSF分子量 6 0 0bp片断 ;人胎肝cDNA文库经初筛和复筛获得含有目的基因的单克隆噬斑 ;测定了HDSSF基因序列 ,其cDNA链为 74 8bp ,含有 5 94bp的完整开放读码框架和 5′及 3′末端非编码区序列。序列分析显示HDSSF应为一含有 1 98个氨基酸残基的新的促肝细胞生长物质。结论 :本研究成功获得目的基因HDSSF克隆 ,人HDSSF克隆成功为开展人源性HDSSF的重组产品研制奠定了基础     

人源性肝细胞生长刺激因子cDNA克隆和序列分析

目的：阐明人源性肝细胞生长因子(HDSSF)的本质，为进一步基因克隆奠定基础。方法：以简并PCR扩增获取目的基因片断；杂交筛选人胎肝cDNA文库；末段终止法进行HDSSF核苷酸序列分析。结果：简并PCR扩增出接近HDSSF分子量600bp片断；人胎肝cDNA文库经初筛和复筛获得含有目的基因的单克隆噬斑；测定了HDSSF基因序列，其cDNA链为748bp，含有594bp的完整开放读码框架和5′及3′末端非编码区序列。序列分析显示HDSSF应为一含有198个氨基酸残基的新的促肝细胞生长物质。结论：本研究成功获得目的基因HDSSF克降．人HDSSF克隆成功为开展人源性HDSSF的重组产品研制奠定了基础。     

毛乳头细胞凝聚性生长差异表达基因的筛选及HSPC016全长克隆的生物信息学分析

目的　筛选与毛乳头细胞 (DPC)凝聚性生长相关的基因表达 ,全长克隆凝聚性生长相关基因HSPC0 16并进行生物信息学分析。方法　应用抑制性消减杂交技术 ,构建DPC凝聚性生长与非凝聚性生长的cDNA消减文库 ,克隆鉴定凝聚性生长特异表达基因。应用RACE技术 ,克隆DPC凝聚性状态下HSPC0 16全长表达序列 ,使用生物信息学手段分析其染色体定位、蛋白序列、结构域及功能。结果　成功构建了DPC凝聚性生长差异表达cDNA文库 ,筛选出DPC与细胞同源凝集、生长调控、分化发育及信号转导相关的基因 ,其中包括HSPC0 16。HSPC0 16全长cDNA为 4 0 0bp ,染色体定位于 3q2 1 31;HSPC0 16蛋白为 6 4aa,结构域属于PD0 5 3992家族 ,与T2FA基因功能域同源。结论DPC凝聚性生长的差异表达cDNA文库为进一步筛选并克隆DPC凝聚性生长相关基因奠定了基础 ,也为宏观分析多基因协同参与DPC生长调控和功能发挥提供了依据。HSPC0 16的生物信息学分析显示此基因与DPC基因转录调节有关     

原发型肝癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

目的 构建人原发型肝癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选肝癌抗原基因.方法 采用确诊的原发型肝癌患者新鲜手术切除癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率.以肝癌患者的血清,采用血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析.结果 成功构建了混合原发型肝癌cDNA文库经测定原始文库滴度为7.42X106pfu/mL,含3.96×106个重组子,重组率为93%,扩增文库滴度为3.92×109pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0 kb之间.文库经3轮血清学筛选共获得31个阳性克隆,分别代表了24个独立的cDNA插入片段(抗原基因).其中17个与已知基因高度同源,另外7个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因.利用SMART技术构建了高质量的人原发型肝癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究.结论 应用SEREX技术初步筛选原发型肝癌组织cDNA文库,共得到17个原发型肝癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为原发型肝癌的免疫学研究提供新的研究分子.     

乳链菌表达hGM-CSF基因的拼装及其载体pNCSF构建

目的 体外拼装适合在乳酸链球菌表达的人粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte—macrophage colony stimulatingfactor，hGM—CSF），并构建载体pNCSF。方法 根据hGM-CSF的氨基酸序列及乳酸链球菌偏好的密码子，将hGM—CSF基因外显子的全长碱基序列用DNAWORKS程序设计成16条互补的寡核苷酸片段，并且分别在第1条和第16条寡核苷酸片段上分别设计PstⅠ和BamHⅠ酶切位点，将相同终浓度的寡核苷酸混合进行PCR反应，完成hGM-CSF基因拼接，得到目的基因片段，对寡核苷酸片段进行拼装和扩增．产物稀释后进一步纯化扩增，在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T，然后TA克隆于pGEM T easy载体中，经酶切鉴定得到阳性克隆并经测序验证。然后亚克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000载体。结果通过PCR得到420左右目的DNA片段，获得了hGM—CSF和pNCSF阳性克隆。其DNA测序结果与设计序列完全一致。结论 运用基因拼装及克隆技术成功拼装了hGM—CSF基因及构建了载体pNCSF，为乳酸链球菌表达重组hGM—CSF奠定了基础。     

应用抑制消减杂交（SSH）克隆肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因

目的 克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异性表达基因。方法 将肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDDP）作为实验组。肺腺癌细胞（SPC-A-1）作为对照组,应用抑制消减杂交技术,构建实验组特异表达cDNA消减文件;用斑点杂交初步筛选cDNA消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序序和同源性分析（Genebank）。结果 建立了一个肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDPP）特异表达cDNA消减文库,斑点杂交初步筛选显示23个克隆中有SPC-A-1/CDPP特异表达cDNA片断,测序和同源性分析表明2个cDNA片断为新序列,其余cDNA片断与已知基因有96%～100%的同源性。结论 2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列;抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法。     

菌落PCR差异筛选cDNA片段文库

目的探索菌落PCR差异筛选cDNA片段文库的可行性。方法在用抑制性PCR构建cDNA片段文库的同时，分别制备正、反向减法杂交探针并用碱性磷酸酶直接标记。随后用这些探针与菌落PCR的产物杂交，从而筛选出差异表达克隆，并再次用RT-PCR证实其差异表达。结果建立的菌落PCR反应体系经济实用．方法稳定．并成功地从500个克隆中筛选出差异表达克隆。结论菌落PCR可用于差异筛选构建于质粒载体的cDNA片段文库。     

Cloning of Chinese obese cDNA and its expression in E. coli

Ｏｂｅｓｉｔｙ,ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆａｄｉｓｏｒｄｅｒｉｎｔｈｅｂｏｄｙｅｎｅｒｇｙｂａｌａｎｃｅｔｈａｔｏｃｃｕｒｓｗｈｅｎｅｎｅｒｇｙｉｎｔａｋｅｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙｅｘｃｅｅｄｓｅｎｅｒｇｙｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅｂｙｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｆａｃｔｏｒｓ ,ｈａｓｂｅｃｏｍｅａｃｏｍｍｏｎｗｏｒｌｄｗｉｄｅｈｅａｌｔｈｐｒｏｂｌｅｍ Ａｌｔｈｏｕｇｈａｌｏｔｏｆｗｏｒｋｈａｓｂｅｅｎｄｏｎｅｆｏｒｍａｎｙｙｅａ…     

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的基因修饰及其在大肠杆菌中 …

目的 对人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ,ＧＭ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ５′端进行修饰以实现在大肠杆菌中的高效表达。方法 采用ＰＣＲ方法进行插入和定点突变,转化大肠杆菌实现原核系统表达。通过细胞和生物学方法对表达产物进行鉴定。结果 修饰后基因的氨基酸序列与文献报道完全一致,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的２５％;重组蛋白可     

hHGF-αcDNA的克隆及表达载体的构建

目的定点突变法扩增制备完整hHGF-α cDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果以含有人HGF cDNA全序列的质粒pRC/CMV-hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应(PCR),扩增hHGF-α cDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增得到了1.34 kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶Xho Ⅰ酶将其切为386 bp、954;bp两个片段,分别以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ与pBSKS载体连接重组,对目的基因分段克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGF cDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ从pBSKS-HGF-α 386、pBSKS-HGF-α 954中切出的386 bp、954 bp两个片段以EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220-HGF-α,限制性内切酶图谱分析显示HGF-α cDNA插入到载体pBV220的EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS-PAGE显示一分子量与单体hHGF-α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论设计制备了hHGF-α链cDNA,克隆建立了hHGF-α链原核表达质粒。     

人GM-CSF基因的克隆及其稳定表达细胞系的建立

目的研究和建立人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（gramulocyte／macrophase colony-stimulating factor,GM—CSF）造血生长因子的高效表达细胞系,以降低生产成本。方法GM—CSF cDNA基因的扩增采用RT—PCR方法;基因转移采用电转移方法;细胞系采用小鼠B淋巴细胞系（L1／2）;表达产物鉴定采用Western blotting、ELISA及其生物活性测定方法。结果将扩增出的GM-CSF cDNA克隆到pcDNA3．1A载体上,构建成GM—CSF基因的重组表达载体（pcDNA—GMCSF）;经电转移将GM—CSF cDNA转移L1／2细胞中,通过G418的筛选,得到稳定表达重组人GM—CSF的细胞系。经过分析证明表达的重组人GM-CSF具有生物学活性,平均表达水平可达850ng／10^6细胞。结论本文建吐的细胞系能够高效表达具有生物学活性的重组人GM—CSF。     

重组hGM-CSF乳酸链球菌的构建及初步验证

目的 运用基因克隆技术将自行合成的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)转化于乳酸链球菌.并筛选获得高表达重组hGM-CSF的乳酸链球菌稳定株.方法 将经过优化适合在乳链菌表达的hGM-CSF基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽、终止密码子的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF,然后将pNCSF进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,获得乳链菌表达载体pTRCSF,通过电穿孔转化于乳链菌,并通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳验证hGM-CSF的表达.结果 获得了重组质粒pNCSF并经酶切鉴定和测序证实.酶切鉴定显示构建乳链菌表达载体pTRCSF及重组hGM-CSF乳链菌成功,蛋白电泳初步验证获得了高表达重组hGM-CSF的乳链菌株LL-CSF.结论 运用基因克隆技术成功构建了重组乳酸链球菌LL-CSF,为进一步研究重组hGM-CSF的生物学特性及评价其潜在临床.应用价值打下了基础.     

prk基因非融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建prk基因的非融合表达载体，并诱导表达。方法：PCR扩增并回收prk基因片段，将其与亚克隆载体pMDl8-T重组，通过蓝／白斑筛选、酶谱分析和序列测定鉴定出重组质粒，然后从该重组质粒上切下prk基因片段，再克隆至非融合表达载体pBV220中，酶谱分析鉴定出正向重组质粒，诱导含有正向重组质粒的宿主菌表达蛋白，提取全菌总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果：成功构建并筛选出pBV220正向重组质粒，经热诱导表达，得到一可溶性的相对分子质量为65ku的重组蛋白。结论：pBV220-prk表达载体的成功构建和表达，说明扩增所得的基因具有正确的阅读框架，使获得天然Prk蛋白成为可能．为进一步研究prk基因的生物学功能奠定了基础。     

大鼠血红素加氧酶-1基因在乳酸乳球菌中的表达

目的:在乳酸乳球菌中表达大鼠血红素加氧酶-1(HO-1)基因。方法:采用RT-PCR技术从大鼠脾总RNA中分离扩增血红素加氧酶HO-1基因,将该基因克隆进pGEM-Teasy质粒中,转化大肠杆菌DH5α提取质粒,鉴定HO-1基因。酶切后与pSEC质粒连接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养。用nisin诱导HO-1表达,SDS-PAGE、Westernblot鉴定表达产物,并采用分光光度法测定HO-1活性。结果:表达产物相对分子量约为32kU,表达量约为7.0mg/L,HO-1活性为2.386U/(mg·h)。结论:乳酸乳球菌能够表达具有生物活性的大鼠HO-1。     

HBV-S基因四环素调控双表达载体的构建及其调控表达研究

目的:构建在同一载体中含乙肝病毒表面抗原基因(Hepatitis B virus surface gene,HBV-S)和四环素阻抑蛋白基因的双表达载体,研究在真核细胞中四环素对S基因表达的调控。方法:在双表达载体pVITRO3一个启动子后的多克隆位点插入四环素阻抑蛋白基因,用含四环素操纵子的启动子取代另一个启动子,并在其多克隆位点插入S基因,在同一载体中构建成S基因的四环素调控表达系统。用脂质体将重组质粒转染HepG2细胞,潮霉素400μg/ml进行抗性筛选,20 d形成抗性克隆,建立在四环素诱导下能稳定表达S基因的细胞系。以不同浓度的四环素(0.5、1.0、2.0、3.0μg/ml)进行诱导,用逆转录PCR和微粒子酶免疫分析法检测S抗原的表达,以确定四环素的最佳浓度。结果:转染了重组质粒的HepG2细胞,在无四环素环境下,表达HBsAg水平极低,72 h时S/N值平均为1.57,在不同浓度的四环素诱导下,HBsAg表达量明显增加,72 h时S/N平均值分别为4.24、4.23、4.18、4.20,未发现与四环素的浓度之间有剂量关系。结论:成功构建了在同一质粒中表达HBV-S基因和四环素阻抑蛋白基因的双表达...     

HCV核心和截短的包膜蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性

目的:构建含HCV全长核心基因和截短的包膜蛋白E2基因的重组杆状病毒表达载体,研究其表达和抗原性.方法:以含HCV全长cDNA克隆的pGEM-HCJ4质粒为模板,PCR扩增全长的HCV核心抗原基因和截短的E2基因片段,插入转座载体pFastBacHTa构建重组转座质粒pFB-CE2t,转化DH10Bac大肠杆菌,获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-CE2t,以之转染昆虫Sf 9细胞进行外源基因的表达,并对其抗原性进行ELISA检测.结果:SDS-PAGE和Western blot分析表明Bacmid-CE2t在Sf 9细胞表达了HCV C-E2蛋白,并能利用细胞内蛋白酶将其裂解为单独的C蛋白和截短的E2蛋白.纯化后的蛋白能分别与HCV C蛋白、E2蛋白单抗以及慢性丙型肝炎患者血清反应.结论:HCV核心蛋白和截短的E2蛋白在昆虫细胞中成功表达并具有抗原性.