丁酸钠对大鼠小肠上皮细胞株-6基质金属蛋白酶-3表达的影响

目的 探讨丁酸钠对大鼠小肠上皮细胞株-6(intestinal epithelial cell line No.6,IEC-6)细胞基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)和组织金属蛋白酶抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)表达的影响,为预防新生儿NEC提供理论依据.方法将对数生长期IEC-6细胞分3组进行实验,低浓度丁酸钠组:培养液中加入终浓度为2 mmol/L的丁酸钠;高浓度丁酸钠组:丁酸钠终浓度为14 mmol/L;另设不含丁酸钠的对照组.共培养24 h后获取细胞,采用逆转录聚合酶链反应技术检测MMP-3和TIMP-1 mRNA的水平.培养48 h后,采用Western印迹法检测MMP-3和TIMP-1蛋白的表达水平.组间差异比较采用单因素方差分析及Dunnett-t和Dunnett's T3进行两两检验.结果 高浓度丁酸钠组MMP-3 mRNA水平为0.566±0.140,MMP-3酶原水平为0.756±0.128,MMP-3活性形式蛋白水平为0.255±0.057,均较对照组(分别为0.166±0.041、0.312±0.057和0.042±0.038)明显升高,差异均有统计学意义(P均＜0.01).低浓度丁酸钠组MMP-3 mRNA水平(0.213±0.039)、酶原水平(0.407±0.088)和活性形式蛋白水平(0.103±0.050)与对照组差异均无统计学意义(P＞0.05).高、低浓度丁酸钠组和对照组TIMP-1 mRNA为0.427±0.042,0.383±0.043和0.355±0.048;蛋白水平分别为0.576±0.140,0.524±0.123和0.355±0.062,组间差异均无统计学意义(F=1.97和3.10,P均＞0.05).结论高浓度丁酸钠能选择性诱导IEC-6细胞MMP-3的表达,而低浓度丁酸钠对其没有明显影响.     

BV6诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡定量蛋白组学研究

目的:通过定量蛋白组学技术探讨Smac类似物BV6影响人卵巢癌SKOV3细胞生长的可能机制。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各浓度梯度BV6干预SKOV3细胞48 h后的生长抑制率,计算抑制率为50%时的药物浓度为半数抑制浓度(IC50),以0.05、0.1、0.2μmol/L BV6进行后续实验;光镜下观察对照组与0.05μmol/L BV6处理组48 h后的细胞形态变化,应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术结合液相串联质谱策略筛选差异蛋白并行生物信息分析;蛋白质印迹(Western blotting)检测对照组、不同浓度BV6处理组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达。结果:BV6可以抑制SKOV3细胞的生长增殖,且呈剂量依赖性,多组间方差分析及任意组间两两比较,差异均有统计学意义(均P0.05)。按公式计算BV6作用于SKOV3细胞48 h的IC50为0.40μmol/L。基于发现错误率(FDR)1%,对照组与0.05μmol/L BV6处理48 h组筛选到349个差异蛋白,其中251个蛋白表达上调、98个蛋白表达下调,经生物信息学分析显示差异蛋白与RNA转录、蛋白质翻译、细胞分裂增殖、凋亡信号调节及肿瘤血管生成密切相关。Western blotting结果显示高、中、低浓度BV6干预SKOV3细胞48 h后与对照组相比,Caspase-3蛋白表达增加,其中高BV6组的Caspase-3蛋白表达最高,组间差异有统计学意义(均P0.05)。结论:BV6通过抑制RNA转录、蛋白质翻译进程、细胞分裂增殖及肿瘤血管生成,促进Caspase-3凋亡信号活化介导SKOV3细胞死亡。     

人参皂甙Rg1对压力性尿失禁患者尿道旁筋膜成纤维细胞增殖的影响

目的 研究人参皂甙Rgl对体外培养的压力性尿失禁(SUI)患者的尿道旁筋膜成纤维细胞增殖的影响.方法 选择2006～2007年行尿道中段悬吊术的SUI患者术中切取的阴道前壁组织4份.剔除黏膜层,组织块培养法于体外培养尿道旁筋膜成纤维细胞,胰蛋白酶消化传代3-5代后,将细胞分为4组,分别加入5、10、20μmol/L人参皂甙Rg1及培养液,采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测不同浓度人参皂甙Rg1培养24、48、72 h后的细胞增殖率,采用免疫组织化学法检测人参皂甙Rg1培养48 h后增殖细胞核抗原(PCNA)的表达.结果 (1)加入5、10、20 ttmol/L人参皂甙Rg1培养72 h后,各组的细胞增殖率分别为(29±5)%、(40±5)%、(26±4)%,分别与对照组(0)比较,差异均有统计学意义(P<0.01);10 μmol/L组分别与5 μmol/L组、20 μmol/L组比较,差异也均有统计学意义(P<0.01);但5 μmol/L组与20 μmol/L组比较,差异无统计学意义(P>0.05).(2)同一浓度人参皂甙Rg1组培养48 h后的细胞增殖率与培养24 h时比较,差异均有统计学意义(P<0.01);培养72 h后与培养48 h时比较,差异也均有统计学意义(P<0.01).(3)5 μmoL/L组、10 μmol/L组及20 μmol/L组培养48 h后的PCNA阳性率分别为49.24%、83.48%和54.50%,分别与对照组(28.77%)比较,差异均有统计学意义(P<0.01);10 μmol/L组与5μmol/L组、20 μmol/L组分别比较,差异也有统计学意义(P<0.01).结论 人参皂甙Rg1可促进体外培养的SUI患者尿道旁筋膜成纤维细胞的增殖.     

顺铂增强TRAIL蛋白诱导Caski细胞凋亡机理研究

目的:观察顺铂对TRAIL蛋白诱导子宫颈癌Caski细胞株凋亡的调节作用,并探讨其作用机理。方法:传代培养宫颈癌Caski细胞,依照所加药物不同,将细胞分为TRAIL组、顺铂组、TRAIL+顺铂组、TRAIL序贯顺铂组、顺铂序贯TRAIL组以及空白对照组,分别于加药后不同时间应用:(1)倒置显微镜观察细胞的生长状态;(2)MTT法检测TRAIL蛋白与顺铂单用、联用以及序贯应用对Caski细胞的生长抑制率;(3)Caspase-8活性检测试剂盒检测不同用药方式对Caski细胞Caspase-8活力的影响;(4)流式细胞术检测Caski细胞TRAIL受体DR4,DR5,DcR1,DcR2的表达,以及1.0mg/L顺铂作用细胞24h后表达量的变化;(5)半定量RT-PCR分析顺铂作用细胞8h后4种受体mRNA水平的变化。结果:(1)TRAIL蛋白和顺铂对Caski细胞有不同程度的生长抑制作用;(2)100ng/mlTRAIL蛋白和1.0mg/L顺铂单用作用24h细胞生长抑制率分别为35.44%、50.26%,联合应用后增至89.66%,联合用药与单独用药差异有统计学意义(P<0.05);(3)顺铂序贯TRAIL蛋白生长抑制率79.88%,TRAIL蛋白序贯顺铂55.73%,两实验组的差异有统计学意义(P<0.01);(4)Caspase-8活力在顺铂序贯TRAIL组的表达最强,为单用TRAIL组的1.52倍;(5)Caski细胞4种TRAIL受体均有表达,但表达丰度不同,顺铂可以上调死亡受体的表达;(6)顺铂处理细胞8h后DR4,DR5mRNA表达水平明显升高,DR4为对照组的1.40倍,DR5为对照组的1.57倍,差异有统计学意义(P<0.05);(7)用顺铂处理前后DcR1,DcR2表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Caski为TRAIL蛋白敏感细胞,顺铂通过上调死亡受体4、5表达、提高Caspase-8活性,增强TRAIL蛋白抑制子宫颈癌Caski细胞生长的作用;顺铂序贯TRAIL的配伍方式具有更强的诱导Caski细胞凋亡的作用。     

不同浓度白藜芦醇激动SIRT1对卵巢颗粒细胞凋亡的调控

目的:研究SIRT1激动剂白藜芦醇(RES)调控卵巢颗粒细胞凋亡的最佳作用浓度。方法:选取人卵巢颗粒细胞瘤细胞系COV434细胞,分别采用不同浓度20、50、75μmol/L和100μmol/L RES激动SIRT1,qRT-PCR法检测RES对SIRT1基因的激活作用,Western blot法检测凋亡相关蛋白Caspase-3及Bcl-2表达,CCK-8毒性实验检测细胞增殖状况,Annxin V-FITC/PI双染流式细胞术测定细胞凋亡。结果:随着RES作用浓度的增加,COV434细胞数增多,SIRT1表达增高,细胞凋亡抑制因子Bcl-2表达增加,促凋亡因子Caspase-3表达降低,细胞凋亡率降低,细胞增殖率升高;RES作用浓度达50μmol/L时,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论:50μmol/L RES作为研究SIRT1对卵巢颗粒细胞凋亡作用的有效激活浓度,可作为研究早发性卵巢功能不全的药物干预浓度依据。     

罗格列酮抑制卵巢癌生长的体内外实验研究

目的:探讨罗格列酮(RGZ)对人卵巢浆液性乳头状囊腺癌SKOV3细胞生长的抑制作用。方法:应用噻唑蓝法(MTT)检测RGZ对卵巢癌细胞增殖的影响;应用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染色观察细胞凋亡形态学变化;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测RGZ对SKOV3细胞PPARγ、Bcl-2及Caspase-3 mRNA表达的影响;建立卵巢癌裸鼠移植瘤模型,分为RGZ治疗组及对照组,观察RGZ对移植瘤体积和重量变化的影响。结果:①MTT法检测不同浓度RGZ组(1、10、50、100、200μmol/L)细胞生长抑制率与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),并呈浓度依赖性抑制;②DAPI荧光染色发现,RGZ作用24小时后,细胞核浓缩,着色较深呈亮蓝色,部分细胞核破裂呈碎片状或多边形;③RT-PCR检测发现,不同浓度RGZ(10、50、100μmol/L)作用于SKOV3细胞24小时后PPARγ、Caspase-3 mRNA表达水平上调,而Bcl-2 mRNA表达水平下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);④细胞接种26天后,RGZ各用药组(4、12、60、120mg/kg)裸鼠移植瘤体积增长缓慢,其抑瘤率与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:RGZ可明显抑制SKOV3细胞的生长,诱导其凋亡,并呈浓度依耐性,通过激活PPARγ-Bcl-2-Caspase-3细胞凋亡信号通路而实现抑制肿瘤细胞生长的作用。     

轴突导向因子netrin-1在滋养层细胞侵袭中的作用

目的 探讨轴突导向因子netrin-1在滋养层细胞侵袭中的作用及其机制.方法 采用RT-PCR技术检测绒毛膜外滋养细胞株TEV-1中netrin-1的6种受体(UNCSA、UNCSB、UNCSC、UNCSD、DCC和neogenin)mRNA的表达.将培养的细胞按照加入netfin-1蛋白浓度的不同分为10μg/L组、50μg/L组、100 μg/L组、500 μg/L组、1000μg/L组、5000μg/L组和阴性对照组(netrin-1的浓度为0 μg/L)共7组,分别用细胞计数试剂盒8检测各组细胞的增殖能力[以吸光度(A)值表示],体外侵袭实验检测各组细胞的侵袭能力.结果 (1)RT-PCR技术检测结果显示,netrin-1的6种受体中,仅检测到neogenin和UNC5B mRNA的表达.(2)培养72 h后,10μg/L组、50μg/L组、100μg/L组、500μg/L组、1000μg/L组和5000 μg/L组细胞的A值分别为1.55±0.29、1.72±0. 31、2. 15±0.35、1.42±0.25、1.50 ±0.27和1.38±0.23,分别与阴性对照组(1.00±0.16)比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(3)培养6 h后,10μg/L组、50μg/L组、100μg/L组、500μg/L组、1000μg/L组和5000 μg/L组细胞的穿膜细胞数分别为(41±4)、(47±5)、(55±6)、(44 ±5)、(43±5)和(42±5)个,分别与阴性对照组[(30±4)个]比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(4)neogenin mRNA的表达水平,10μg/L组、50μg/L组、100μg/L组、500μg/L组、1000μg/L组和5000 μg/L组分别为1.50±0.16、1.83±0.19、2.24±0.25、2.12±0.24、2.12±0.23和2.13±0.23,分别与阴性对照组(1.00±0.11)比较,差异均有统计学意义(P<0.05);10 μg/L组与50μg/L组比较,50μg/L组与100μg/L组比较,差异也均有统计学意义(P<0.05);100 μg/L组与500 μg/L组、1000 μg/L组和5000μg/L组之间两两比较,差异均无统计学意义(P>0.05).(5)UNCSB mRNA的表达水平,10μg/L组、50μg/L组、100 μg/L组、500 μg/L组、1000 μg/L组和5000 μg/L组分别为1.09±0.11、1.47±0.14、1.61±0.16、1.85±0.19、2.21±0.21和2.42±0.23,分别与阴性对照组(1.00 ±0.07)比较,差异均有统计学意义(P<0.05);各组之间分别比较,差异也均有统计学意义(P<0.05).结论 netrin-1能促进入绒毛膜外滋养细胞的增殖和侵袭能力,这种促进作用受到其受体neogenin及UNCSB的调控.     

BV6诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡定量蛋白组学研究

目的：通过定量蛋白组学技术探讨Smac类似物BV6影响人卵巢癌SKOV3细胞生长的可能机制。方法：四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各浓度梯度BV6干预SKOV3细胞48 h后的生长抑制率,计算抑制率为50%时的药物浓度为半数抑制浓度（IC50）,以0.05、0.1、0.2 μmol/L BV6进行后续实验;光镜下观察对照组与0.05 μmol/L BV6处理组48 h后的细胞形态变化,应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术结合液相串联质谱策略筛选差异蛋白并行生物信息分析;蛋白质印迹（Western blotting）检测对照组、不同浓度BV6处理组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的表达。结果：BV6可以抑制SKOV3细胞的生长增殖,且呈剂量依赖性,多组间方差分析及任意组间两两比较,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。按公式计算BV6作用于SKOV3细胞48 h的IC50为0.40 μmol/L。基于发现错误率（FDR）＜1%,对照组与0.05 μmol/L BV6处理48 h组筛选到349个差异蛋白,其中251个蛋白表达上调、98个蛋白表达下调,经生物信息学分析显示差异蛋白与RNA转录、蛋白质翻译、细胞分裂增殖、凋亡信号调节及肿瘤血管生成密切相关。Western blotting结果显示高、中、低浓度BV6干预SKOV3细胞48 h后与对照组相比,Caspase-3蛋白表达增加,其中高BV6组的Caspase-3蛋白表达最高,组间差异有统计学意义（均P＜0.05）。结论：BV6通过抑制RNA转录、蛋白质翻译进程、细胞分裂增殖及肿瘤血管生成,促进Caspase-3凋亡信号活化介导SKOV3细胞死亡。     

不同剂量黄芪注射液对病毒性心肌炎小鼠Caspase-3活性的影响

目的观察黄芪注射液对病毒性心肌炎小鼠发生细胞凋亡及对半胱天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性的影响。方法 4~6周龄雄性Balb/c小鼠60只,随机分为正常对照组、模型对照组、黄芪低剂量组、黄芪中剂量组、黄芪高剂量组5组,每组各12只。制备小鼠急性病毒性心肌炎模型后黄芪低、中、高剂量组分别腹腔注射黄芪注射液0.1、0.2、0.4mL/(g·d),正常对照组及模型对照组分别给予腹腔注射生理盐水0.1mL/(g·d),每日1次,连用14d。在第3、7、10、14天取心脏及血清标本,进行病理学检查、Caspase-3表达活性的检测、肌酸肌酶同工酶(CK-MB)及心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的检测。结果 (1)模型对照组小鼠心肌病理积分、CK-MB、cTnⅠ值显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P0.05);(2)黄芪低、中、高剂量组Caspase-3表达活性、CK-MB、cTnⅠ值、心肌病理积分均明显低于模型对照组,差异有统计学意义(P0.05);(3)黄芪低、中、高剂量组各组间心肌病理积分、CK-MB及Caspase-3表达活性差异无统计学意义(P0.05)。结论 (1)细胞凋亡参与了病毒性心肌炎发生时小鼠的心肌损伤,Caspase-3在其中起到重要作用;(2)小剂量的黄芪注射液即可以通过下调心肌细胞Caspase-3活性减少病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡,减轻心肌细胞损伤。     

二甲双胍对卵巢癌细胞侵袭迁移及MTA1表达的影响

目的:体外细胞培养实验检测二甲双胍对卵巢癌细胞SKOV3侵袭迁移能力的影响,以及其对转移相关因子1(MTA1)表达的影响。方法:用不同浓度二甲双胍处理卵巢癌细胞,采用划痕实验和transwell实验检测二甲双胍对细胞侵袭迁移能力的影响,Western blot法检测二甲双胍对细胞中MTA1蛋白表达的影响,qRT-PCR检测二甲双胍对细胞中MTA1 mRNA表达的影响。结果:与对照组(0mmol/L)相比,二甲双胍干预组的细胞迁移速度明显下降(P0.01);作用24h时,2.5mmol/L与5mmol/L组未见差异(P0.05);作用48h时,卵巢癌细胞的迁移速度随着二甲双胍浓度的增加而减弱(P0.01)。随着二甲双胍浓度的增加,穿膜细胞数减少(P0.01);二甲双胍干预组的MTA1 mRNA及MTA1蛋白表达明显降低(P0.05),不同药物浓度之间无差异。结论:二甲双胍抑制SKOV3细胞侵袭迁移,抑制作用与浓度呈正相关,其机制可能与抑制MTA1表达有关。     

丁内酯-Ⅰ对小鼠卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

目的:观察丁内酯-Ⅰ(BL-Ⅰ)对小鼠未成熟卵的体外成熟及发育能力影响。方法:用不同浓度的BL-Ⅰ培养液培养小鼠未成熟卵3h或6h,观察卵母细胞生发泡破裂(GVBD)的发生率。将6.25μmol/L和100μmol/L的BL-Ⅰ培养液分别培养未成熟卵3h和6h,以抑制其核的成熟,然后移入成熟培养液继续培养成熟,行体外受精,观察受精率和胚胎发育至囊胚的能力,并与对照组进行比较。结果:BL-Ⅰ培养液培养3h时,6.25μmol/LBL-Ⅰ就可抑制未成熟卵发生GVBD;培养6h时,100μmol/L才能抑制未成熟卵的GVBD。两种情况下,各组间的成熟率无差异。6.25μmol/L组卵母细胞的受精率(83.1%)和囊胚形成率(25.4%)虽低于体内成熟组(93.3%和46.4%),但显著地高于体外成熟组(59.9%和4.9%)。结论:BL-Ⅰ能可逆性地抑制小鼠未成熟卵的核成熟且不影响其成熟能力,适量的BL-Ⅰ对核成熟的短暂性抑制可显著提高小鼠未成熟卵的发育能力。     

低葡萄糖高乳酸环境对Hela细胞生存的影响

目的:探讨低糖高乳酸环境对宫颈癌细胞生存的影响,以及对EGFR-m TOR通路的调节作用。方法:将Hela细胞培养于常糖(葡萄糖10mmol/L)、低糖(葡萄糖3mmol/L)、高乳酸(葡萄糖10mmol/L,乳酸2.5mmol/L)、低糖高乳酸(葡萄糖3mmol/L,乳酸2.5mmol/L)4种环境下,CCK-8法测定Hela细胞的生长抑制率,流式细胞术测定细胞周期。荧光实时定量PCR法检测EGFR和m TOR mRNA水平表达。结果:与常糖组相比,高乳酸组的细胞抑制率显著升高(P0.01),48h细胞G1/G0期比例显著升高(P0.01),细胞凋亡率、EGFR和m TOR mRNA表达水平均无变化。与常糖组相比,低糖组的细胞抑制率显著升高(P0.01),48h细胞凋亡率显著降低(P0.01),细胞各周期比例变化与常糖组无差异,EGFR表达水平降低(P0.05)。与常糖组相比,低糖高乳酸组的细胞抑制率显著升高(P0.01),但低于低糖组(P0.01)和高乳酸组(P0.05),48h G1/G0期比例显著升高(P0.01),细胞诱导凋亡率显著升高(P0.01),EGFR和m TOR mRNA表达水平均显著升高(P0.01)。结论:Hela细胞在低糖高乳酸环境中的存活状况好于单纯低糖和单纯高乳酸环境,且伴随着EGFR和m TOR基因表达水平上升。     

氧化低密度脂蛋白及其受体与子痫前期发病的关系

目的 探讨氧化低密度脂蛋白(oxLDL)及血凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)与子痫前期发病的关系.方法 选择2007年6月至2008年1月在青岛大学医学院附属医院产科住院分娩的子痫前期孕妇73例,其中轻度子痫前期孕妇35例(轻度子痫前期组),重度子痫前期孕妇38例(重度子痫前期组).选取同期正常晚期妊娠妇女45例为对照组.采用酶联免疫吸附试验检测各组孕妇血浆中oxLDL水平;采用RT-PCR、蛋白印迹法分别检测各组孕妇胎盘组织中LOX-1 mRNA及蛋白表达水平;采用RT-PCR检测各组孕妇胎盘组织中半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达水平.结果 (1)轻度及重度子痫前期组孕妇血浆中oxLDL水平分别为(0.42±0.11)及(0.68±0.12)mg/L,明显高于对照组的(0.35±0.14)mg/L,差异有统计学意义(P<0.01);重度子痫前期组又明显高于轻度子痫前期组(P<0.01).(2)轻度及重度子痫前期组孕妇胎盘组织中LOX-1mRNA表达水平分别为0.70±0.10及0.84±0.08,明显高于对照组的0.58±0.11,差异有统计学意义(P<0.01);重度子痫前期组又明显高于轻度子痫前期组(P<0.01).(3)轻度及重度子痫前期组孕妇胎盘组织中LOX-1蛋白表达水平分别为0.79±0.15及0.90±0.12,明显高于对照组的0.68±0.11,差异有统计学意义(P<0.01);重度子痫前期组又明显高于轻度子痫前期组(P<0.01).(4)轻度及重度子痫前期组孕妇胎盘组织中caspase-3 mRNA表达水平分别为3.82±0.18及5.39±0.14,明显高于对照组的2.19±0.20,差异有统计学意义(P<0.01);重度子痫前期组又明显高于轻度子痫前期组(P<0.01).(5)轻度及重度子痫前期组孕妇血浆中oxLDL水平与胎盘组织中LOX-1 mRNA表达水平呈正相关(r=0.93,P<0.05);胎盘组织中LOX-1 mRNA表达与胎盘组织caspase-3 mRNA表达水平呈正相关(r=0.84,P<0.05).结论 子痫前期孕妇血浆中oxLDL水平升高,并上调胎盘组织中的LOX-1表达水平,从而参与子痫前期的病理生理过程.     

氯化锶不同浓度及作用时间对小鼠孤雌胚类原核数量的影响

目的:探讨不同浓度及作用时间的氯化锶(SrCl2)对小鼠卵母细胞孤雌激活胚胎中出现类原核数量及发育潜能的影响,建立能模拟精子效应的小鼠孤雌的激活体系。方法:分别用5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L浓度的SrCl2激活小鼠卵母细胞,观察激活胚的类原核数量及发育潜能,然后在最佳刺激浓度的SrCl2的激活液中分别处理4 h、6 h、8 h,观察类原核数目及形态,分析SrCl2浓度对小鼠卵母细胞激活效果的影响。结果:hCG注射后18 h取小鼠卵母细胞,在10 mmol/L SrCl2浓度下激活6 h,出现双原核(2PN)百分比显著高于其它浓度SrCl2处理组(P0.01),且与小鼠体外受精6 h后的2PN率及囊胚形成率无统计学差异(P0.05)。结论:10 mmol/L SrCl2条件下激活小鼠卵子6 h产生的孤雌胚胎中出现2PN率及发育潜能最高,提示10 mmol/L SrCl2激活处理6 h可以模拟精子对卵子的激活条件。     

脂氧素对滋养细胞氧化损伤的保护作用及其机制

目的研究脂氧素(lipoxinA4,LXA4)在孕妇血清中的表达及其对滋养细胞氧化损伤的保护作用和作用机制.方法 细胞实验分为6组,对照组;脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)组:10 μg/ml LPS作用24 h;干预组:10 μg/ml LPS+100 nmol/L LXA4作用24 h;LXA4组:100 nmol/L LXA4作用24 h;拮抗组:10 μg/ml LPS+100 nmol/L LXA4+100 μmol/L N-叔丁氧羰基吡咯烷(N-tert-butoxycarbonyl-2-pyrrolidine,BOC-2)作用24 h;BOC-2组:10μg/ml LPS+100 μmol/L BOC-2 作用24 h.采用酶联免疫吸附试验检测正常孕妇与子痫前期患者血清LXA4含量;以2,7-二氢二氯荧光素二乙酸酯为荧光探针检测滋养细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;逆转录-聚合酶链反应检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD) mRNA的表达;Western印迹分析SOD、转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor,Nrf2)的蛋白表达水平;黄嘌呤氧化酶法测定滋养细胞中SOD活性.结果 (1)子痫前期患者血清LXA4水平为(165.53±18.89) pg/L,与正常孕妇[(545.67±30.91) pg/L]相比明显下降(t=40.64,P<0.01).(2)LPS组与对照组相比,滋养细胞内二氯荧光素(dichlorofluorescein,DCF)密度值明显升高(P<0.01),DCF密度值从53.00±3.08 上升至77.00±5.83( t=8.14,P<0.01);胞核中Nrf2蛋白、SOD mRNA和蛋白表达均显著下降(t分别为34.11、25.61和17.93,P均<0.01);滋养细胞上清中的SOD含量明显下调(t=12.16,P<0.01).(3)干预组与LPS组相比,滋养细胞内DCF密度值明显下降,DCF密度值从77.00±5.83降至62.00±3.39(t=4.97,P<0.01),胞核中Nrf2蛋白、SOD mRNA表达显著上升(t分别为11.74和13.17,P均<0.01),SOD蛋白表达也有所升高(t=4.67,P<0.05),滋养细胞上清中的SOD含量明显增加,酶活力上升至(8.93±0.53) U/ml(t=14.76,P<0.01).(4)拮抗组与干预组相比,滋养细胞上清中SOD含量下降至(6.23±0.41) U/ml(t=9.03,P<0.01),但仍高于LPS组(t=6.10,P<0.01);BOC-2组SOD含量为(4.90±0.32) U/ml,与LPS组相比差异无统计学意义(t=0.79,P>0.05).结论 LXA4可明显减轻LPS引起的胎盘滋养细胞氧化损伤,且LXA4可通过脂氧素受体(lipoxinA4 receptor,ALX-R)激活Nrf2/抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)信号通路来发挥抗氧化损伤的作用.

Abstract：

Objective To explore lipoxinA4 (LXA4) expression in maternal serum of pregnant women and the protective effect and mechanism of LXA4 on trophoblastic cells from oxidative injury. Methods Trophoblastic cells were randomized into six groups: Control group; Lipopolysaccharides (LPS) group, cells were stimulated by 10 μg/ml LPS for 24 h; Intervention group, cells stimulated by LPS were treated with 100 nmol/L LXA4 for 24 h; LXA4 group, cells were treated with 100 nmol/L LXA4 for 24 h; Antagonistic group, cells stimulated by LPS were treated with 100 nmol/L LXA4 plus 100 μmol/L N-tert-butoxycarbonyl-2-pyrrolidine (BOC-2) for 24 h; BOC-2 group, trophoblastic cells stimulated by LPS were treated with 100 μmol/L BOC-2 for 24 h. The serum concentration of LXA4 in normal group and preeclampsia group was detected by ELISA. The intracellular formation of reactive oxygen species (ROS) was detected by 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) as a fluorescent probe. SOD mRNA was analyzed by RT-PCR. SOD and Nrf2 protein expressions were analyzed by Western blot. The levels of SOD in trophoblastic cells were detected by using detection kit. Results (1) The serum concentration of LXA4 was significantly lower in preeclampsia group (165.53±18.89) pg/L than in the control [(545.67±30.91) pg/L, P<0.01]. (2) Compared with control group, the levels of ROS in LPS group were significantly higher, DCF density of trophoblastic cells increased from 53.00±3.08 to 77.00±5.83 (P<0.01). The expression of nuclear Nrf2 protein, SOD mRNA and protein in LPS group were obviously decreased (P<0.01). The levels of SOD in LPS group were also significantly lower (P<0.01). (3) Compared with LPS group, the levels of ROS in intervention group were significantly lower, DCF density of trophoblastic cells decreased from 77.00±5.83 to 62.00±3.39 (P<0.01). The expression of nuclear Nrf2 protein, SOD mRNA in intervention group were obviously increased (P<0.01), so did the SOD protein expression (P<0.05). The levels of SOD were significantly increased from (4.77±0.34) U/ml to (8.93±0.53) U/ml (P<0.01). (4) The levels of SOD in antagonistic group were lower than in intervention group, but still higher than LPS group. [(6.23±0.41) U/ml vs (8.93±0.53) U/ml (P<0.01) or (4.77±0.34) U/ml (P<0.01)]. No significant difference was found in the levels of SOD between BOC-2 and LPS group (P>0.05). Conclusions LXA4 can significantly reduce the oxidative stress of placental trophoblastic cells stimulated by LPS. LXA4 can bind to lipoxin receptors and activate Nrf2-ARE signaling pathway playing a protective effect. So LXA4 in pregnant women can affect the oxidative stress of placenta.     

人脐静脉内皮细胞中肿瘤坏死因子-α诱导NOSTRIN基因表达上调的实验研究

目的:探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中内皮型一氧化氮合酶运输介导物(NOSTRIN)基因表达的诱导作用以及二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)对此诱导作用的抑制。方法:将培养的内皮细胞分为3组:第1组为无任何处理的HUVEC,第2组为子痫前期(PE)患者血清作用的HUVEC,第3组为正常晚孕妇女血清作用的HUVEC。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测3组细胞中NOSTRIN mR-NA的表达。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测PE患者和正常孕妇血清中TNF-α含量。用1,3,5ng/ml3种浓度的TNF-α分别作用3组细胞6h,以及用浓度3ng/ml的TNF-α作用3组细胞分别达6h、12h、24h,RT-PCR检测NOSTRIN mRNA的表达;将PDTC(5mmol/ml)与TNF-α(3ng/ml)同时作用以及TNF-α(3ng/ml)单独作用3组细胞6h,RT-PCR检测NOSTRIN基因mRNA的表达。结果:3组细胞中都有NOSTRIN表达,第2组表达量显著高于第1组和第3组(P0.01)。ELISA结果显示,PE患者血清中TNF-α含量显著高于正常晚孕妇女(P0.01)。TNF-α作用HUVEC细胞后NOSTRIN显著高表达,呈时间和剂量依赖关系(P0.01)。PDTC和TNF-α同时作用的HUVEC与TNF-α单独作用的HUVEC相比,其NOSTRIN表达显著降低(P0.01)。结论:TNF-α可上调NOSTRIN在HUVEC中的表达。     

血清IL-6检测与胎膜早破相关性研究

目的探讨孕妇血清IL6与胎膜早破及绒毛膜羊膜炎的关系。方法2004年1～10月中山大学附属第三医院对46例胎膜早破孕妇和50例正常孕妇,采用ELISA法测定血清IL6质量浓度,分娩时胎盘胎膜送病理检查。结果胎膜早破孕妇血清IL6质量浓度明显高于对照组,并随破膜时间的延长其含量升高(P<0.05),而且有绒毛膜羊膜炎者血清IL6高于无绒毛膜羊膜炎者及对照组(P<0.01);38例自然临产的胎膜早破孕妇中,血清IL6≥30ng/L者,其取样距临产时间短于血清<30ng/L者(P<0.05)。结论血清IL6含量升高对早期诊断胎膜早破合并绒毛膜羊膜炎及预测分娩具有重要意义。