肝素酶反义寡核苷酸转染的人食管癌EC9706细胞中肝素酶mRNA的表达

目的:探讨肝素酶反义寡核苷营酸对肝毒酶mRNA表达的影响。方法:食管癌EC9706细胞分6组培养,5组分别用设计合成的4条封闭肝素酶不同基因位点的反义寡核苷酸(ASODN1、ASODN2、ASODN3、ASODN4)及1条无关寡核苷酸(N-ODN)转染,另1组不转染。采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中肝素酶mR-NA表达情况。结果:4条肝素酶反义寡核苷酸转染的EC9706细胞中肝素酶mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),但均显著低于无关寡核苷酸组(P<0.05)。结论:肝素酶反义寡核苷酸序列可抑制食管癌EC9706细胞中肝素酶mRNA表达。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠食管癌移植瘤组织中VEGF蛋白表达的影响

目的:探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠食管癌移植瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。方法:用4条乙酰肝素酶反义寡核苷酸及1条无关寡聚核苷酸(N-ODN)分别体外培养、转染食管癌EC9706细胞。用上述细胞注射到模型左前腿腹侧皮下,构建裸鼠食管癌动物模型,饲养5周后采用免疫组化SP法对裸鼠食管癌移植瘤组织中VEGF蛋白的表达进行了检测。结果:4条乙酰肝素酶反义寡核苷酸(20mol/L)影响裸鼠体内食管癌移植瘤中VEGF蛋白表达表现出不同程度的抑制作用,实验组中VEGF蛋白表达与N-ODN转染组、未经转染的空白对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:乙酰肝素酶反义寡核苷酸通过影响裸鼠食管癌移植瘤组织中VEGF蛋白表达,从而抑制肿瘤的浸润转移。     

真核起始因子4E反义寡核苷酸对人食管癌EC-1细胞中真核起始因子4E表达的影响

目的:探讨真核起始因子4E(eIF4E)反义寡核酸(ASODN)对人食管癌EC-1细胞中eIF4E表达的影响.方法:将针对eIF4E不同基因位点的2条反义寡核苷酸(ASODN1、2)和1条无义寡核苷酸(N-ODN)转染EC-1细胞(设5、10、15 μmol/L 3个转染浓度),分别培养24、48、72 h,并设空脂质体转染作为空白对照,采用免疫细胞化学和原位杂交方法检测转染后细胞中eIF4E蛋白和mRNA表达的变化.结果:ASODN 1、2转染EC-1细胞培养24、48、72 h后,各组中eIF4E蛋白和mRNA的表达均降低,2者分别与空白对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05);ASODN1、2组每个时间段内随浓度增加ASODN抑制效应增强,差异具有统计学意义(F=9.423、10.284、10.496、7.621、8.420和9.089,P＜0.05),组间相同时间点、相同浓度的抑制效应比较差异无统计学意义(P＞0.05);N-ODN组和空白对照组对eIF4E的表达均无抑制效应.结论:特异性的ASODN能有效抑制人食管癌EC-1细胞中eIF4E的表达.     

不同基因位点的人端粒酶RNA反义寡核苷酸对食管癌EC9706细胞增殖及端粒酶活性的影响

目的:探讨封闭人端粒酶RNA不同基因位点的硫代修饰性反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌细胞增殖及端粒酶活性的影响.方法:采用阳离子脂质体介导的方法,将不同浓度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20μmol/L和30 μmol/L)的5条ASODN(ASODN-1、ASODN-2、ASODN-3、ASODN-4和ASODN-5)和无关序列寡核苷酸(N-ODN)分别导入食管癌EC9706细胞中,应用MTT法及端粒酶活性的定性及定量检测法,测定ASODN对食管癌EC9706细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用.结果:5条ASODN和1条N-ODN按照N-ODN、ASODN-4、ASODN-5、ASODN-2、ASODN-1和ASODN-3的顺序,对细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用逐渐增高(P＜0.05).结论:封闭hTR功能区的反义寡核苷酸可有效抑制食管癌细胞增殖及端粒酶活性.     

PTEN反义寡核苷酸对EC9706细胞增殖、凋亡和PTEN、mTOR表达的影响

目的:探讨PTEN反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡和PTEN、mTOR表达的影响.方法:利用阳离子脂质体介导PTEN的ASODN和无义寡核苷酸(N-ODN)转染食管癌EC9706细胞,终浓度为3、6和12μmol/L的ASODN为实验组,终浓度12 μmol/L的N-ODN为N-ODN对照组,不进行转染的为空白对照组.运用MTT法、TUNEL检测空白对照组、N-ODN对照组及3种浓度的ASODN作用24、48及72 h后食管癌EC9706细胞增殖和凋亡情况;采用免疫细胞化学技术及原位杂交方法检测各组EC9706细胞中PTEN蛋白、mTOR蛋白和mRNA的表达.结果:①随PTEN ASODN转染浓度(F3μmol/L=784.774,F6μmol/L=242.884,F12μmol/L=412.105,P均＜0.001)和时间(F24 h=60.676,F48 b=57.703,F72 h=51.841,P＜0.001)的增加,食管癌EC9706细胞的增殖增强.②随PTEN ASODN转染浓度(F3μmol/L=36.655,F6μ=mol/L47.594,F12μmol/L=85.264,P均＜0.001)和时间(F24h=4.860,F48 h=4.901,F72 h=8.153,P＜0.001)的增加,食管癌EC9706细胞的凋亡下降.③随PTENASODN转染浓度(F3μmol/L=45.634,F6μmol/L=66.399,F12μmol/L=72.763,P均＜0.001)和时间(F24h=4.065,F48 h=3.985,F72 h=5.446,P＜0.001)的增加,PTEN的蛋白表达降低;mRNA的表达也降低(F3μmol/L=23.357,F6μmol/L=43.272,F12μmol/L=51.402,P均＜0.001;F24h=3.933,F48 h=4.084,F72 h:4.528,P＜0.001).④mTOR蛋白(F3μmol/L=19.422,F6 μmol/L=30.000,F12 μmol/L=62.168,P＜0.001;F24 h=5.340,F48 h=9.150,F72 h=21.056,P＜0.001)和mRNA(F3μmol/L=19.414,F6 μmol/L=46.571,F12μmol/L=68.634,P＜0.001;F24 h=4.815,F48 h=12.165,F72 h=7.858,P＜0.001)的表达随PTEN ASODN转染浓度和时问的增加而增强.⑤上述各指标中均以12 μmol/LASODN作用72 h的效应最强(P均＜0.05).结论:PTEN ASODN促进食管癌EC9706细胞增殖、抑制凋亡,下调PTEN蛋白和mRNA的表达,上调mTOR蛋白和mRNA的表达.     

hTR反义寡核苷酸对食管癌细胞端粒酶活性、细胞凋亡及凋亡诱导因子表达的影响

目的:探讨封闭端粒酶RNA功能区的反义寡核苷酸(hTR ASODN)对食管癌EC9706细胞端粒酶活性、细胞凋亡及凋亡诱导因子(AIF)表达的影响.方法:应用hTR ASODN 1次/d、连续7 d转染EC9706细胞,以未加ASODN的脂质体对照组为空白对照,分别于转染后1 d、3 d、5 d、7 d采用TRAP-银染法检测EC9706细胞的端粒酶活性,原位末端转移酶标记法及吖啶橙荧光染色法检测EC9706细胞的凋亡及免疫细胞化学法检测AIF蛋白的表达.结果:与空白对照比较,hTR ASODN转染后EC9706细胞端粒酶活性受到抑制,细胞凋亡率及凋亡指数明显升高,AIF蛋白阳性表达率升高(P＜0.05).结论:hTR ASODN可有效抑制EC9706细胞的端粒酶活性,诱导肿瘤细胞凋亡,在此凋亡过程中,AIF可能发挥着重要作用.     

转染人端粒酶RNA不同基因位点反义寡核苷酸的食管癌细胞在裸鼠体内生长情况观察

目的:观察不同基因位点的人端粒酶RNA(hTR)硫代修饰性反义寡核苷酸(ASODN)对裸鼠食管癌移植瘤的抑制作用.方法:40只裸小鼠随机等分为8组.将20μmol/L不同基因位点的hTR ASODN(ASODN-1、ASODN-2、ASODN-3、ASODN-4及ASODN-5)和无关序列寡核苷酸(N-ODN)分别转染食管癌EC9706细胞,72 h后采用裸鼠背部皮下注射的方法进行裸鼠体内成瘤实验,连续5周观察裸鼠体内食管癌移植瘤的生长情况.结果:空白对照和N-ODN组最早长出肿瘤,ASODN-4和ASODN-5组次之,ASODN-2、ASODN-1和ASODN-3组肿瘤长出最晚.35 d时ASODN-1组、ASODN-2组、ASODN-3组、ASODN-4组、ASODN-5组、N-ODN组及空白对照组肿瘤体积(V/mm3)分别为450.1±58.2、581.1±69.7、237.7±140.5、1 323.2±148.9、1 187.3±258.0、1 331.4±240.2及1 476.2±131.8,前3组与后4组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).与ASODN-1、ASODN-2及ASODN-3组比较,ASODN-4、ASODN-5、N-ODN及空白对照组细胞异型性明显.结论:封闭hTR功能区的反义寡核苷酸可有效抑制裸鼠食管癌移植瘤的增殖及恶性表型的产生.     

ANGPTL3反义寡核苷酸对EC9706细胞侵袭黏附能力的影响

目的:观察ANGPTL3反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌细胞EC9706侵袭黏附能力的影响.方法:根据GenBank收录的ANGPTL3 mRNA序列,设计ASODN,并制成脂质体-ASODN混合液转染EC9706细胞,观察转染后EC9706细胞黏附率、细胞侵袭穿膜细胞数及侵袭抑制率.结果:ANGPTL3 ASODN...     

hTR反义寡核苷酸诱导食管癌细胞凋亡过程中Bcl-2,Bax,P16和P21表达的变化

目的:探讨封闭人端粒酶RNA功能区的反义寡核苷酸(hTR ASODN)诱导食管癌EC9706细胞凋亡过程中Bcl-2、Bax、P16及P21的表达.方法:应用hTR ASODN 1次/d、连续7 d转染EC9706细胞,以未加ASODN的脂质体对照组为空白对照,分别于转染后1、3、5、7 d采用原位末端转移酶标记法检测EC9706细胞的凋亡,免疫细胞化学法检测Bcl-2、Bax、P16及P21蛋白的表达.结果:与空白对照比较,hTR ASODN转染后肿瘤细胞凋亡率及P16与P21蛋白阳性表达率均明显升高(P＜0.05或0.01);而Bcl-2及Bax蛋白的表达未见明显改变.结论:hTRASODN可能通过上调EC9706细胞周期调控基因P16、P21蛋白的表达调控细胞周期,进而影响EC9706细胞的增殖与凋亡.     

反义NF-κBp65寡核苷酸对食管鳞癌细胞EC9706增殖及凋亡的影响

目的:探讨反义NF-κB p65寡核苷酸对食管鳞癌细胞EC9706增殖、凋亡及细胞周期的影响.方法:利用转染试剂KeyGenl介导将反义NF-κB p65寡核苷酸片段体外转染人人食管鳞癌EC9706细胞株.转染72 h后.应用RT-PCR、流式细胞术检测EC9706细胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达;MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞增殖周期.以单纯转染试剂为阴性对照,未转染的EC9706细胞为空白对照.结果:转染72 h后,反义组EC9706细胞中NF-κB p65 mRNA的表达及蛋白标记率与阴性对照和空白对照组比较,下降明显.差异具有统计学意义(P<0.05);反义组EC9706细胞的增殖能力与阴性对照和空白对照组相比明显受抑,抑制率为15.0%;反义组EC9706凋亡细胞数较阴性对照、空白对照组升高,差异具有统计学意义(P<0.05);反义组G.期的EC9706细胞数较阴性对照、空白对照组升高,而S期细胞数较阴性对照、空白对照组降低,差异均具有统计学意义(P均<0.05).结论:特异性阻断NF-κB p65的转录.可以抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,参与细胞周期调控.NF-κB p65有望成为肿瘤基因治疗的靶点.     

佛波酯对食管癌EC9706细胞NDRG_1表达及细胞增殖影响的研究

目的:探讨12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)作用于食管癌细胞EC9706后,对NDRG1mRNA表达、细胞增殖、细胞周期的影响。方法:采用50nmol/L的TPA作用于EC9706细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期的变化,原位杂交法检测NDRG1mRNA水平。结果:TPA能上调NDRG1mRNA水平,抑制EC9706细胞增殖,细胞周期发生G1→S期阻滞。结论:TPA可能通过上调NDRG1mRNA的表达而抑制EC9706增殖,促进其分化。     

HOXA1基因反义寡核苷酸对食管癌细胞生长的影响

  目的  探讨同源异形盒A1(HOXA1)基因反义寡核苷酸（ASODN）对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及机制。  方法  采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测正常食管上皮细胞Het-1A和人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白的表达,筛选高表达的食管鳞癌细胞进行后续实验;设计合成HOXA1 ASODN链、正义寡核苷酸(SODN)链及无义寡核苷酸（N-ODN）链;将筛选出的高表达的食管鳞癌细胞分为HOXA1 ASODN组（5、10、15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞）、对照组（细胞常规培养,不进行细胞转染）、SODN组（细胞转染15 μmol/L的SODN）和N-ODN组（细胞转染15 μmol/L的N-ODN）。采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术、Transwell小室分别检测细胞活力、凋亡率及侵袭迁移能力;Western blot检测HOXA1、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶（p-AKT）、细胞增殖核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、B细胞淋巴瘤-2蛋白（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。  结果  与正常食管上皮细胞Het-1A比较,人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白表达均升高,差异有统计学意义（P<0.05）。HOXA1蛋白在Eca109细胞表达最高,因此选用Eca109细胞进行后续实验。转染HOXA1 ASODN的Eca109细胞HOXA1蛋白表达降低（P<0.05）。随着Eca109细胞转染HOXA1 ASODN浓度及时间增加,Eca109细胞活力降低,与对照、SODN、N-ODN组比较差异有统计学意义（P<0.05）。15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞后,与对照组比较,细胞侵袭和迁移能力降低,凋亡率升高,p-AKT、PCNA和MMP-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高（P<0.05）。  结论  HOXA1基因反义寡核苷酸可抑制食管癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,并诱导凋亡,机制与抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路可能有关。     

姜黄素对食管癌EC-9706细胞增殖的影响

目的观察姜黄素对人食管癌EC-9706细胞增殖的影响并探讨其分子机制。方法应用50～200txmol／L姜黄素处理食管癌EC-9706细胞株12—48h后,应用四甲基偶氮唑蓝（MTF）法检测细胞增殖抑制率、逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测热休克蛋白70（Hsrv0）mRNA的表达。结果经姜黄素干预后,人食管癌EC一9706细胞生长减慢,MTT法检测结果显示增殖抑制率达18．3％～77．5％（P〈0．05）,呈良好的时间一剂量效应关系,HSP70mRNA的表达下调。结论姜黄素能够有效抑制人食管癌细胞EC-9706的增殖．其机制可能与抑制HSP70mRNA的表达有关。     

靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖和凋亡的影响。方法:分别用0、1、5和10μmol/L靛玉红甲肟处理EC9706细胞12、24和48h后,采用MTT法检测细胞增殖抑制率;用10μmol/L靛玉红甲肟处理EC9706细胞0、24、48和72h后,采用流式细胞术法检测凋亡率;分别用0、1、5和10μmol/L靛玉红甲肟处理EC9706细胞48h后,采用RT-PCR法检测细胞Sox-2mRNA的表达。结果:靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖具有明显的抑制作用,且表现为剂量依赖性和时间依赖性(F剂量=135.237,F时间=96.488,F交互=189.544,P均<0.001)。靛玉红甲肟作用EC9706细胞后,细胞凋亡率呈时间依赖性上升(F=195.350,P<0.001),Sox-2mRNA的表达呈剂量依赖性下调(F=87.552,P<0.001)。结论:靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞具有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用,其作用机制可能与下调Sox-2mRNA表达有关。     

体外hEGF对食管癌EC9706细胞增殖影响的研究

目的:研究人表皮生长因子(hEGF)对食管癌EC9706细胞增殖的影响作用,探讨hEGF不同浓度、不同时间对食管癌细胞生长的影响。方法:体外正常条件培养EC9706食管鳞癌细胞株,无血清饥饿细胞,加入hEGF,通过镜下形态观察、MTT染色、流式细胞技术等观察细胞增殖变化情况。结果:hEGF在200ng/ml浓度、24h作用时间点,对EC9706细胞有明显刺激增殖作用;倒置显微镜下观察,hEGF刺激细胞呈长梭形改变,细胞连接紧密;细胞周期分析,hEGF刺激细胞30.03%处于增殖活跃的S期,较之对照组15.52%,有极显著性差异。结论:hEGF能够刺激食管癌EC9706细胞增殖,其对细胞增殖的刺激作用呈量效、时效关系。     

沉默CXCR4基因对食管鳞癌EC9706细胞中VEGF基因表达的影响

目的探讨沉默CXCR 4基因对食管鳞癌EC9706细胞中VEGF基因表达的影响,初步阐明CX-CR 4在食管鳞癌细胞系EC9706浸润转移中的作用机制。方法利用R T-PCR检测转染有两对CXCR 4siR NA的食管鳞癌EC9706细胞中VEGF基因mR NA的表达,Western Blot和免疫细胞化学技术检测转染有两对CXCR4 siRNA的食管鳞癌EC9706细胞中VEGF基因蛋白的表达,同时以未转染细胞和转染阴性siR-NA细胞作为空白对照和阴性对照。结果转染两对CXCR 4 siR NA后48 h,R T-PCR结果显示,转染组VEGF mR NA的表达较未转染空白对照组和转染阴性对照siR NA组相比明显下降,差异具有显著性(P<0.05);Western Blot结果显示CXCR 4 siR NA转染后48 h,CXCR 4 siR NA不仅能抑制VEGF mR NA的表达,对VEGF蛋白的表达同样有明显的抑制作用,差异具有显著性(P<0.05);免疫细胞化学技术检测结果进一步证实,与未转染空白对照组和转染阴性对照siRNA组相比,CXCR siRNA对VEGF蛋白表达具有显著抑制作用,差异有显著性(P<0.05)。结论特异性阻断CXCR4基因的表达可以抑制VEGF基因的表达,说明CX-CR 4基因有可能通过调控VEGF的表达参与食管鳞癌的浸润转移,CXCR 4有望成为肿瘤基因治疗的新靶点。     

PTPN14对食管癌的抑制作用及其机制研究

目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶14（PTPN14）对食管癌的抑癌作用及其机制。方法通过转染PTPN14质粒过表达食管癌细胞EC9706 中PTPN14 的表达,实时荧光定量聚合酶链反应及Western blot检测其过表达效果;四甲基偶氮唑盐比色法检测过表达PTPN14对EC9706细胞增殖的影响;流式细胞术检测过表达PTPN14对EC9706 细胞周期的影响;Western blot检测过表达PTPN14 对YAP 蛋白表达的影响。结果转染PTPN14质粒可上调食管癌细胞系EC9706 中PTPN14 的表达;过表达EC9706 细胞中PTPN14 可以抑制食管癌细胞的增殖,使细胞周期阻滞在G1期;过表达EC9706 中PTPN14 可以下调细胞中YAP的表达水平。结论PTPN14可通过下调YAP,阻滞食管癌细胞周期,抑制细胞增殖。     

姜黄素抑制耐紫杉醇食管癌细胞的上皮间质转化作用及机制探讨

目的 建立耐紫杉醇食管癌(EC)细胞系EC9706/PTX,观察姜黄素对EC9706/PTX细胞上皮间质转化(EMT)的抑制作用并探讨其机制,为耐药EC的治疗提供理论依据.方法 用中等浓度间歇作用法建立耐紫杉醇EC细胞EC9706/PTX,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞耐药指数及交叉耐药性,检测不同浓度姜黄素对EC9706/PTX细胞增殖的抑制.使用细胞骨架染色、划痕实验、Transwell侵袭实验检测姜黄素对EC9706/PTX细胞形态变化、迁移和侵袭能力的影响.荧光定量PCR及蛋白免疫印迹(Western blot)检测姜黄素对EC9706/PTX细胞中EMT相关分子标志物E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白在mRNA和蛋白水平的表达影响.Western blot检测姜黄素对EC9706/PTX细胞中转录因子NF-κB p65及Snail在蛋白水平的表达影响.结果 EC9706/PTX对紫杉醇的耐药指数为28.4,对顺铂、阿霉素产生交叉耐药性,姜黄素能够抑制EC9706/PTX细胞的增殖.在20 μmol/L浓度的姜黄素作用下,EC9706/PTX细胞的迁移和侵袭能力明显降低.荧光定量PCR及West-ern blot检测显示,细胞耐药后E-钙黏蛋白的表达明显下调,而N-钙黏蛋白表达则明显上调,姜黄素逆转了这一现象.Westernblot检测提示,EC细胞发生耐药及EMT后,NF-κB p65及Snail蛋白的表达增强,姜黄素阻断了这一作用.结论 姜黄素能够抑制紫杉醇耐药EC细胞的增殖并且能够逆转紫杉醇耐药EC细胞的EMT现象,其机制可能是通过抑制NF-κB-Snail信号通路实现的.