人角质形成细胞培养的实验研究

目的：探讨实验室条件下人体角质形成细胞的培养技术，为角质形成细胞的多方面研究提供可靠的细胞来源。方法：采用改良的无血清培养技术进行人体角质形成细胞的培养，用显微镜及电子显微镜观察角质形成细胞的形态特征。结果：培养的角质形成细胞在多次传代后仍保持了正常的形态。结论：用改良的培养角质形成细胞的技术可为角质形成细胞进一步的实验和临床提供可靠的、丰富的细胞来源。     

血竭提取物对角质形成细胞增殖的影响

目的:观察血竭提取物对体外培养角质形成细胞增殖的影响,探讨血竭促进创面愈合的机制。方法:将血竭经过氯仿、乙酸乙酯、乙醇回流提取得到三种提取液,进行角质形成细胞的培养,噻唑蓝(MTT)法检测不同血竭提取物在不同浓度以及不同时间点对体外培养角质形成细胞增殖的影响,并绘制最适浓度下细胞生长曲线。利用流式细胞仪分析最适浓度培养条件下角质形成细胞的细胞周期变化。结果:血竭乙酸乙酯提取物在0.0625～0.5mg/ml浓度范围内,促进角质形成细胞增殖,且呈剂量依赖性,在0.5mg/ml浓度值时促进作用最显著,此条件下细胞DNA合成S期较对照组增加25.7%(P<0.01)。结论:血竭乙酸乙酯提取物具有显著促进角质形成细胞增殖作用,提示血竭可能具有促进创面愈合中再上皮化的作用。     

人角质形成细胞基因导入效率的影响因素研究

目的 了解不同大小质粒和不同基因转染法对人KC基因导入效率的影响.方法 采用脂质体转染法、阳离子多聚物转染法、电穿孔联合细胞核转染试剂转染法、慢病毒感染法,分别将不同大小的质粒[pSUPER-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、pEGFP-N2、pHSER-绿色荧光蛋白(GFP)、ploxP-EGFP]导入人永生化KC株HaCaT细胞和人胚肾细胞株293FT细胞(后者为对照).于倒置荧光显微镜下观察GFP的表达,计算转染率.结果 (1)采用脂质体转染法可将4种质粒导入HaCaT细胞(转染率1.0%～3.3%)及293FT细胞(转染率80.0%～84.7%).(2)阳离子多聚物转染法亦可将4种质粒导入HaCaT细胞(转染率为1.0%～3.7%)和293FT细胞(转染率81.3%～86.7%).(3)采用电穿孔联合细胞核转染试剂转染法,可以将2种较小片段质粒pSUPER-EGFP和pEGFP-N2导入HaCaT细胞,转染率分别为22.3%和19.0%;而2种较大片段质粒pHSER-GFP和ploxP-EGFP的转染率分别为4.0%和3.3%.(4)pHSER-GFP经慢病毒包装后,导入HaCaT细胞的转染率高达97.0%,明显优于前3种转染法.结论 脂质体转染法、阳离子多聚物转染法较难将外源性基因导入人KC,慢病毒感染法的转染率明显优于电穿孔联合细胞核转染试剂转染法;不同大小质粒对转染率有明显影响.     

白芷活性提取物对人角质形成细胞生物学特性的影响

目的体外观察白芷活性提取物对人皮肤角质形成细胞(keratinocytes,KC)生物学特性的影响,初步探讨其促进创面愈合的可能机制。方法取人皮肤KC的HaCaT细胞株,复苏培养取第5代细胞进行实验。取白芷生药95%乙醇提取后,将其活性提取物溶解于含0.25%FBS的DMEM培养液中,稀释至5×10-2、5×10-3、5×10-4、5×10-5g/L,分别与KC培养5 d后采用MTT法测定细胞增殖活性,以含0.25%FBS的DMEM培养作为对照。根据细胞增殖活性确定最佳浓度后,取KC分别采用最佳浓度白芷活性提取液(实验组)及含0.25%FBS的DMEM(对照组)培养。培养48 h后流式细胞仪测定细胞周期,实时荧光定量PCR检测细胞周期相关基因细胞周期素D1(cyclin D1)、凋亡相关基因天冬氨酸半胱氨酸酶3(Caspase-3)mRNA的表达。结果培养5 d后,MTT测定5×10-4、5×10-3、5×10-2g/L浓度可促进KC增殖,吸光度(A)值与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中5×10-3g/L浓度组A值最高,确定为最佳浓度。实验组S期及G2/M期细胞数量较对照组明显增多,G0/G1期细胞数量明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组cyclin D1及Caspase-3 mRNA相对表达量均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论白芷活性提取物能促进KC增殖,同时下调cyclin D1的表达加快细胞周期进程,下调Caspase-3的表达抑制细胞凋亡,以加快上皮化进程促进创面愈合。     

角质形成细胞源IL-1α对成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响

目的：研究角质形成细胞分泌的IL-1α对成纤维细胞生物学行为的影响。方法：组织块法培养成纤维细胞，消化法培养角质形成细胞，采用免疫组化方法检测角质形成细胞分泌的IL-1α；成纤维细胞中加入含不同浓度IL-1α抗体（0．04μg／ml，0．2μg／ml，1μg／ml）的角质形成细胞条件培养液为实验组，含DMEM的条件培养液为对照组，采用Cell counting kit-8、放免法测定成纤维细胞增殖、胶原合成。结果：细胞爬片可见大量染色阳性角质形成细胞，细胞增殖测定，各实验组吸光度（A）值与对照组比较，差异均有统计学意义（P（0．01）；随抗体浓度增高，A值减小，0．2μg／ml及1μg／ml浓度组与0．04μg／ml浓度组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；胶原分泌浓度测定，各实验组与对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）：随抗体浓度及胶原浓度增高，0．2μg／ml及1μg／ml浓度组与0．04μg／ml浓度组比较，差异有统计学意义（P（0．01）。结论：正常角质形成细胞分泌大量IL-1α，可促进成纤维细胞增殖，抑制胶原分泌。     

α-生育酚对精索静脉曲张大鼠生殖细胞凋亡的影响

目的:探讨α-生育酚对精索静脉曲张(VC)大鼠睾丸生殖细胞损害的保护作用。方法:采用成年雄性Wistar大鼠10只复制精索静脉曲张疾病模型,4周后开始每日肌注α-生育酚0.5mg/(100g体重),共4周(生育酚组)。同时设手术组及假手术组进行对照。8周后用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)检测睾丸生殖细胞凋亡指数(AI)。结果:生育酚组动物左侧睾丸重量显著高于手术组(P<0.05),低于假手术组(P<0.05);生育酚组细胞凋亡率[左侧(5.34±1.28)%,右侧(5.87±1.25)%]高于假手术组[左侧(4.72±1.02)%、右侧(4.88±1.28)%](P<0.05),而显著低于手术组[左侧(9.05±2.51)%,右侧(7.22±1.35)%](P<0.05)。结论:α-生育酚能降低精索静脉曲张大鼠生殖细胞的凋亡指数,延缓睾丸细胞损害的病程,对精索静脉曲张导致的睾丸损害具有一定的保护作用。     

气-液面培养对角质形成细胞分化的影响

目的 研制角质形成细胞-胶原-猪去细胞真皮基质(PADM)组织工程皮肤,观察气-液面培养对角质形成细胞分化及细胞因子基因表达的影响.方法 将角质形成细胞种植在真皮基质胶原面进行气-液面培养和浸没式培养.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对比研究两种培养方法获得的细胞膜片bFGF基因表达差异.结果 气-液面培养获得的角质形成细胞层结构与正常皮肤相似,细胞分化良好.单纯浸没式培养角质形成细胞层较薄,分化较差.气一液面培养获得的细胞膜片bFGF mRNA表达量明显高于单纯浸没式培养(t=3.825,P<0.01).结论 气-液面培养可促进角质形成细胞的生长、分化及复层表皮结构形成,影响细胞因子的基因表达.     

缓激肽对人角质形成细胞增殖凋亡及分化影响的实验研究

目的观察缓激肽(BK)对体外培养的人角质形成细胞(HKC)增殖、凋亡和分化的影响并探讨其机制。方法以1×10-4~1×10-9mol/LBK作用于体外培养的HKC,采用噻唑蓝法、台盼蓝染色法观察到1×10-4mol/LBK抑制作用最强,以此浓度BK进行余下实验。当HKC达对数生长期后,一部分加入1×10-4mol/LBK作为实验组,另一部分不加BK作为对照组,分别培养24、48h后采用流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况及细胞周期,用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)免疫细胞化学法检测HKC分化标志物角蛋白10(K10)及内披蛋白的表达情况。用含1×10-4mol/LBK的无血清培养基KC-SFM培养HKC作为实验组,对照组细胞仅加KC-SFM,分别用激光扫描共聚焦显微镜结合钙荧光探针Fluo-3/AM技术检测细胞内游离Ca2 浓度即[Ca2 ]i的变化。结果与对照组比较,实验组G0/G1期细胞比例相对上升34.57%,S期相对下降58.91%,其细胞早期凋亡率为15.34%,明显高于对照组(5.60%,P<0.05)。实验组HKCK10阳性细胞百分比为2.20%,明显低于对照组(6.89%,P<0.05)。BK作用3min后实验组HKC[Ca2 ]i较对照组上升163.0%,之后开始下降,5min后接近对照组。结论高浓度BK可抑制HKC周期进程、明显促进其凋亡及诱导[Ca2 ]i升高,这可能是其使HKC体外生长受抑的部分机制。BK还可抑制表皮再生和HKC分化。     

异体角质形成细胞免疫原性的初步研究

目的观察组织工程皮肤的种子细胞角质形成细胞体外培养后的免疫原性变化情况。方法取自愿捐献的健康儿童、青少年包皮,采用分离酶、胰蛋白酶两步消化法进行体外培养并传代至5代,行苔盼蓝计数细胞活性。SP法标记各代角质形成细胞中的朗格汉斯细胞和黑色素细胞,计算其占总细胞数的百分比。各代角质形成细胞与从外周血中分离培养淋巴细胞进行混合培养,观察淋巴细胞增殖情况,闪烁仪计数cpm值。结果培养的细胞生长良好,原代及传代后的细胞融合后呈铺路石样生长。细胞冻存后复苏,苔盼蓝染色细胞活力>80%。原代中朗格汉斯细胞占5.8%,黑色素细胞占8.1%;1代中朗格汉斯细胞占2.1%,黑色素细胞占2.8%;2代后二者均消失。cpm值原代482.13±46.61,1代362.50±35.12,2代228.38±51.46,3代171.86±34.63,4代143.63±15.95,5代123.25±14.39,与对照组53.67±8.61比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。原代、1代与其他各代比较,2代与4、5代比较,差异均有统计学意义(P<0.05);2代与3代间,3、4代及5代间,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论异体角质形成细胞经体外培养后不断传代,细胞免疫原性逐渐下降。     

中波紫外线对人角质形成细胞MMP-9 mRNA的影响

目的：研究中波紫外线（UVB）诱导的永生化人角质形成细胞中MMP-9 mRNA的表达,探讨其与UVB照射所致的细胞损伤的关系。方法：绘制细胞生长曲线,采用MTT方法测定UVB照射后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定UVB照射后HaCaT细胞中MMP-9 mRNA的表达。结果：UVB照射后,HaCaT细胞的增殖活性受到抑制,MMP-9 mRNA表达增强;随UVB剂量增加,照射组的MMP-9 mRNA表达逐渐增多,与未照光组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论：UVB照射可引起HaCaT细胞中MMP-9 mRNA表达显著增加,且与UVB照射剂量呈正相关,与光老化的发生有一定的关系。     

Effect of GSH on cerebral vasospasm in dogs

Reduced glutathinone (-glutamylcysteinglycine, GSH) is a scavenger for oxygen radicals and plays in important role in protection of cells from ischemia and from the harmful effects of free oxygen radicals. Free oxygen radicals due to cerebral vasospasm increase in both vasospasm and proliferative vasculopathy. This experiment was performed to determine whether GSH plays a role in cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage by preventing the harmful effects of free oxygen radicals. In this study, GSH was administered intraarterially and intracisternally following vasospasm of the canine basilar artery. Less vasospasm was observed in the group treated with GSH intraarterially following subarachnoid hemorrhage than in the one treated with GSH intracisternally and in the control group. The arterial wall was investigated ultrastructurally. We evaluated the effect of the anti-oxidating substance through the activity of superoxide dismutase in the arterial wall. We compared the effect of glutathione reductase in the two groups treated with GSH intraarterially and intracisternally. Arterial degeneration was more prominent in the group in which GSH was used intracisternally, while the superoxide dismutase levels were low. In contrast, arterial degeneration was less in the other group in which GSH was used intraaterially, while the superoxide dismutase levels were high.     

虾青素对HaCaT细胞氧化应激损伤的保护作用

目的：探讨虾青素对长波紫外线（UVA）辐射诱导的HaCaT细胞氧化应激损伤的保护作用。方法：采用人角质形成细胞HaCat细胞构建体外模型,MTT法测定细胞活力,酶生化法测定细胞超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—px）的活性和丙二醛（MDA）的含量。结果：虾青素能提高受UVA辐射的HaCaT细胞的增殖活力,提高胞质SOD和GSH-px的活性,降低细胞内MDA的含量。结论：虾青素对受UVA辐射的HaCaT细胞氧化应激损伤有一定的保护作用。     

CSH、SOD和ATP-MgCl_2对静脉皮瓣成活的影响

在兔胸腹部以胸腹壁静脉为轴形成4cm×6cm的静脉皮瓣。经静脉注射GSH,SOD,ATP-Mg-Cl_2,分别观察这三种药物对静脉皮瓣成活的影响。结果表明这三种药物使用后静脉皮瓣成活面积百分率分别为:GSH组86.56％、SOD组85.52％、ATP-mgcl2组76.25％,均显著高于对照组68.75％。文中对这三种药物提高静脉皮瓣成活面积的机制进行了探讨。     

表皮生长因子对肿瘤坏死因子α致HaCaT细胞凋亡的抑制作用

目的了解肿瘤坏死因子α（TNF-α）导致HaCaT细胞凋亡过程中过氧化物酶体增殖物激活受体B（PPAR[3）的表达情况，探讨表皮生长因子（EGF）对HaCaT细胞的保护机制。方法将培养的HaCaT细胞分为正常对照组（不作任何处理）、TNF—α小剂量组（10ng／ml TNF-α处理）、TNF—α大剂量组（20ng／mlTNF-α处理）、EGF＋TNF—α小剂量组、EGF＋TNF—α大剂量组，后2组先用20ng／mlEGF培养4h后，再分别予以10、20ng／ml TNF—α处理。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（easpase．3）荧光检测试剂盒测定caspase-3的活性，噻唑蓝比色法检测细胞存活率。以5、10、20、40ng／ml的EGF处理HaCaT细胞，采用反转录．PCR和蛋白质印迹法检测PPAR[3mRNA及其蛋白的表达。结果与TNF-α小剂量组[（32±6）％]、TNF-ct大剂量组[（57±6）％]比较，EGF＋TNF—α小剂量组、EGF＋TNF-α大剂量组细胞凋亡率[（20±3）％、（28±4）％]明显下降（P〈0．01），caspase-3活性降低、存活率上升（P〈0．01）。20ng／mlEGF处理细胞时，PPAR[3mRNA及其蛋白表达最强。结论EGF在抑制TNF-α导致的HaCaT细胞凋亡的同时，亦增强细胞中PPARβ的表达。     

玉竹对UVB诱导HaCaT细胞损伤的保护作用

目的:探讨玉竹水提液对中波紫外线(UVB)诱导人皮肤角质形成细胞损伤的保护作用及其可能机制。方法:用64mJ.cm-2的UVB照射人皮肤角质形成细胞建立光老化细胞模型,以不同浓度玉竹提取物处理光老化细胞,羟胺法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性,比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,TBA法检测丙二醛(MDA)含量,酶联免疫法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)分泌量。结果:UVB照射角质形成细胞后,SOD、GSH-Px活性降低,MDA含量升高,TNF-α、IL-6分泌量增加(P<0.01),玉竹水提液中(100μg.ml-1)、高(200μg.ml-1)剂量组能显著提高SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量,减少TNF-α、I L-6分泌(P<0.05或P<0.01)。结论:玉竹水提液可在一定程度上减轻UVB对角质形成细胞的损伤,其机制可能与其抑制氧化损伤,增强细胞抗氧化能力,减少炎症细胞因子分泌有关。     

The effects of chronic exposure to ethanol and cigarette smoke on the level of reduced glutathione and malondialdehyde in rat kidney

The aim of this study was to investigate the effects of chronic ethanol intake and cigarette smoke exposure on rat kidney. The animals were divided into four experimental groups: (1) the control group (C), (2) the ethanol group (E), (3) the cigarette smoke group (CS), and (4) the cigarette smoke plus ethanol group (CS+E). Apart from the control group, these were treated with ethanol and/or cigarette smoke for 6 months. The animals were killed and the kidneys removed to determine the levels of reduced glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) and for histopathological analysis. The levels of GSH/g wet tissue were 1.58±0.09 µmol, 0.91±0.05 µmol, 1.14±0.06 µmol, and 0.82±0.04 µmol for C, E, CS, and CS+E, respectively. In groups of E, CS, and CS+E, the GSH values were significantly lower than that of group C animals (P<0.05). Although, we detected lower GSH levels in the CS+E than the CS group (P<0.05), a significant difference in GSH levels between CS+E and E was not observed. The levels of MDA/g wet tissue were 40.1±3.4 nmol, 71.4±2.8 nmol, 64.0±3.6 nmol, and 76.5±4.3 nmol, for C, E, CS and CS+E, respectively. In E, CS, and CS+E, the MDA values were significantly higher than in group C (P<0.05). The increase in MDA levels in CS+E were not significantly different from groups E or CS. Histopathological analysis of the kidney slices showed severe degeneration of the tissues. Advanced hydropic degeneration of kidney tubules was clearly observed in the CS group. In group E, advanced tubular and interstitial damage, mononuclear cell infiltration and tubular thyroidization were clearly visible. In group CS+E, an intense inflammatory cell infiltration was detected under the transitional epithelium. We conclude that chronic exposure to ethanol and cigarette smoke may cause an oxidative burst in rat kidney by increasing the formation of reactive oxygen species.     

还原型谷胱甘肽对糖尿病大鼠阴茎海绵体氧化损伤的影响

目的探讨氧化损伤在糖尿病性ED发病机制中的作用,以及还原型谷胱甘肽（GSH）对氧化损伤的干预作用,为临床治疗提供新的手段。方法成年雄性SD大鼠50只,随机分为4组：A组为对照组（n=10）,B组为糖尿病无干预组（n=13）,C组为糖尿病胰岛素干预组（n=13）和D组为糖尿病胰岛素＋GSH干预组（n=14）。采用腹腔注射STZ法制作糖尿病模型并进行筛选。8周后取大鼠阴茎海绵体组织进行组织匀浆,采用黄嘌呤氧化法测定阴茎海绵体组织中超氧化物岐化酶（SOD）活性;用TBA法测定丙二醛（MDA）含量;RT—PCR法检测胞外型SOD基因（SODEX基因）的表达;Western-blot法检测CuZnSOD蛋白含量。结果A组大鼠海绵体组织基本无过氧化产物蓄积。与A组相比,B、C、D组的SOD活性显著下降（P〈0．05）,MDA含量均显著升高（P〈0．05）,B、C、D组SODEX基因的表达、CuZnSOD蛋白含量显著下降（P〈0．05）;与B组相比,C、D组的SOD活性显著升高（P〈0．05）,MDA含量显著下降（P〈0．05）,SODEx基因的表达及CuZnSOD蛋白含量显著升高（P〈0．05）。与C组相比,D组SODEX基因的表达及CuZnSOD蛋白含量显著升高（P〈0．05）。结论糖尿病性雄性大鼠阴茎海绵体组织自由基代谢明显障碍,脂质过氧化产物增加,同时氧自由基清除能力下降;而抗氧化剂GSH的应用能部分减弱氧化损伤。提示氧化损伤可能在糖尿病性ED的发生发展中起一定作用。本研究为糖尿病性ED的预防和治疗提供新的策略。     

C端甲状旁腺相关肽的克隆及其对骨骺干细胞的调控作用

目的 探讨C端甲状旁腺相关肽(PTHrp107-139)对体外培养的骨骺干细胞的调控作用以及与其他调控因子的关系.方法 采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)方法克隆大鼠PTHrp全长中的107～139片段,并将其亚克隆至质粒pTRE2hyg上,构建新的质粒pTRE2hyg-PTHrp107-139并将其与质粒pTet-on共转染分离纯化的骨骺干细胞,放入含有维生素C和地塞米松的全培养基中进行培养,分别加入0.1、0.5、2.0mg/L的强力霉素(Doxycycline)进行诱导,并设置空白对照.48～72 h后抽提各组细胞的RNA进行逆转录,然后通过半定量PCR的方法检测增殖细胞核抗原(PC-NA、SOX9等基因的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡.结果 加入DOX组的PCNA、ColⅡ、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Sox9表达增加,骨骺干细胞数量明显增多,而Ptc、Col X、骨形态发生蛋白(BMP)-6表达减少.结论 C端甲状旁腺相关肽可能有促进骨骺干细胞增殖并抑制其分化的作用,但对细胞凋亡无明显影响.     

Photodynamic effects of di-sulphonated aluminium phthalocyanine on human epidermal keratinocytes in vitro

The photosensitizing effects of di-sulphonated aluminium phthalocyanine (AlS₂Pc) on proliferation of normal human epidermal keratinocytes of the established line UP were studied in cultures in 96-well microtitre plates using the MTT-microculture tetrazolium assay as a method of assessing viable cell number. It was found that the cytotoxic effects of AlS₂Pc were dose-dependent. A cooled slow-scan CCD (charge-coupled device) imaging system with computerized image processing was used for fluorescence measurements in cell cultures after administration of 25 μg ml⁻¹ AlS₂Pc. Fluorescence was at a peak at 24 h and this time was therefore considered to be the most appropriate for light sensitization. Treatment with 25 μg ml⁻¹ AlS₂Pc for 24 h followed by exposure to total red light (660–700 nm) energy dose of 0.6 J cm⁻² reduced cell survival by 100%. It seems that the photokilling capacity of AlS₂Pc on keratinocytes is very effective and this may make it particularly suitable for the treatment of surface epithelial tumours.     

c-jun对离体睾丸间质细胞睾酮分泌作用的机理研究

目的本研究拟通过c-jun反义寡脱氧核苷酸(ASODNs)观察c-jun在调节hCG促进睾丸间质细胞(leydigcells,LC)睾酮分泌中的作用机制。方法用c-junASODNs拮抗c-jun,再加用cAMP观察其对睾酮分泌的影响,用放射免疫方法检测睾酮水平。结果hCG可刺激LC睾酮分泌,是LC功能研究的有用模型。c-junASODNs呈剂量依赖性地抑制hCG诱导下的离体LC的睾酮分泌(P<0.01)。加用cAMP后睾酮分泌增加。结论c-jun促进hCG诱导的大鼠LC的睾酮分泌,c-jun表达可能与cAMP相关。