牙本质基质蛋白1基因转染猪成纤维细胞的实验研究

目的评价牙本质基质蛋白1（dental matrix protein-1，DMP1）转基因修饰猪口腔黏膜成纤维细胞（porcine oral mucosa fibroblasts，POMF）后，对POMF生物学特性及DMP1表达的影响。方法构建pEGFP-DMP1绿色荧光融合蛋白真核表达载体，脂质体介导转染POMF，同时转染猪骨髓间质干细胞（mesenehymal stem cells，MSC）作为对照。检测转染后细胞的DMP1、釉鞘蛋白、牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）基因表达以及DMP1、DSP蛋白的表达情况，同时检测转染细胞矿化诱导后钙盐染色及转染细胞三维立体培养钙结节的形成情况。结果成功构建了DMP1真核表达载体pEGFP-DMP1，转基因后的POMF及MSC均可见有DMP1、釉鞘蛋白、DSP基因表达及DMP1、DSP蛋白表达阳性。DMP1转染POMF及MSC矿化诱导后钙盐染色，以及DMP1转染细胞三维立体培养石蜡切片HE染色，其矿化结节形成率均高于未转染细胞。结论POMF转基因表达DMP1能增强其矿化能力，诱导牙齿发育相关基因釉鞘蛋白及DSP的表达。     

重组人结缔组织生长因子对牙髓细胞增殖与成牙本质分化的影响

目的：研究重组人结缔组织生长因子（recombinant connective tissue growth factor, rCTGF）对牙髓细胞（human dental pulp cells,hDPCs）增殖及分化的影响。方法：利用不同浓度（0、1、10、100 ng/mL）rCTGF分别处理牙髓细胞,CCK8法检测牙髓细胞增殖情况;茜素红染色和半定量试验检测细胞矿化结节的形成变化,qRT-PCR测定成牙本质分化相关基因DMP-1、DSPP和OC的表达情况,Western 免疫印迹法测定rCTGF刺激牙髓细胞后,ERK1/2信号通路的磷酸化水平。采用SAS 9.3软件包对数据进行统计学分析。结果：高浓度的rCTGF（100 ng/mL）可以促进牙髓细胞增殖;经矿化诱导后,10 ng/mL rCTGF促进牙髓细胞矿化结节形成的效果最好,钙盐沉积量最明显（P<0.05）,成牙本质分化相关基因DMP-1、DSPP的表达显著上调（P<0.05）。Western 免疫印迹结果显示,10 ng/mL rCTGF刺激牙髓细胞后,p-ERK1/2蛋白的表达升高。结论：rCTGF可能通过激活ERK1/2信号通路,促进牙髓细胞的增殖与分化。     

重组腺病毒-骨形成蛋白7对骨髓间充质干细胞骨向分化影响的实验观察

目的观察骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）7重组腺病毒对大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）骨向分化的影响。方法构建重组腺病毒载体pAd-BMP-7，测定其滴度。应用pAd-BMP-7和空白载体pAdTrack—CMV分别转染MSC，检测外源基因转染效率，并应用RT-PCR、免疫细胞化学手段检测BMP-7的表达。将MSC分为3组，A组：转染pAd-BMP-7；B组：转染pAdTrack-CMV；C组：转染pAdTrack-CMV＋骨向分化液。观察其矿化结节形成，评价3组细胞骨向分化情况。结果重组腺病毒pad-BMP-7的滴度可达2．0×10^15 pfu／L；外源基因的转染效率为99％，表达时间持续5—7周，3周内表达水平较高。RT-PCR和免疫细胞化学检测证实了BMP-7在MSC中的有效表达。病毒转染后，A组和C组细胞均有矿化结节形成，其中A组矿化结节数目显著多于C组（P〈0．01）；B组无矿化结节形成。结论BMP-7重组腺病毒可有效转染大鼠骨髓MSC，并促进其骨向分化，转染的BMP-7得到了有效表达。     

不同细胞类型对cbf α1调控DSPP基因转录的影响

观察核心结合因子α1（core binding factor α1,cbf α1）对不同细胞中牙本质涎磷蛋（dentin sialophosphopmtein,DSPP）基因转录调控的影响。方法：选择Hela和小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞;DSPP基因上游2.6kb片段为启动子。采用瞬时转染、报告基因等方法观察在两种细胞中,cbfα1对DSPP基因启动子启动活性的影响。结果：在MDPC-23及Hela细胞中,pGL3-Enhancer-2.6K与pcDNA3-cbfα1共转染组荧光素酶的表达量均小于pGL3-Enhancer-2.6K与pcDNA3共转染组（P〈0.01）：在MDPC-23细胞中变化更为明显。结论：cbfα1对DSPP基因的转录调控作用受细胞类型的影响。     

TGF-β1/Smad3信号途径对牙本质涎磷蛋白基因表达的调控

目的：研究小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中TGF-β1及其信号分子Smad3对小鼠牙本质涎磷蛋白（dentinsialophosphoprotein，DSPP）基因表达中的调控作用。方法：PCR法制备DSPP引物、构建带有DSPP启动子片段的萤火虫荧光素酶基因报告载体，通过瞬时转染入MDPC-23细胞后，检测报告基因活性。结果：在TGF-β1的作用下，Smad3可以发生转位表达，由细胞浆转入细胞核内。同时，过表达野生型Smad3可以显著增强TGF-β1对DSPP启动子活性的下调作用。结论：TGF-β1可以通过Smad3信号通路对DSPP启动子进行调控；在DSPP启动子-2525-＋54bp之间，存在TGF-β1／Smad3信号途径的结合位点，从而发挥对DSPP基因的调控作用。     

血管内皮生长因子和转化生长因子β1基因调控人根尖乳头细胞矿化相关因子的研究

目的克隆人血管内皮生长因子（VEGF）异构体中的VEGF165,构建真核表达载体,探讨过表达VEGF165和转化生长因子β1（TGFβ1）对人根尖乳头细胞矿化相关因子的影响。方法提取人脐静脉内皮细胞系ECV304总RNA,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法扩增VEGF165基因,插入pcDNA3.1hisA,构建重组质粒pcDNA3.1hisA-VEGF165,经酶切及测序验证正确后,将其和pcDNA3.1hisA-TGFβ1转染人根尖乳头细胞,采用实时定量聚合酶链反应检测转染效率和骨涎蛋白（BSP）、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、骨钙素（OCN）、牙本质基质蛋白1（DMP1）的表达。结果插入表达载体的VEGF165基因序列与GenBank数据库中的序列具有100%同源性;转染后VEGF165及TGFβ1 mRNA显著增高;各实验组DSPP mRNA的表达均升高（P＜0.05）,实验2组和实验3组的OCN mRNA升高（P＜0.05）,各组间BSP mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05）,DMP1 mRNA均未见表达。结论成功构建VEGF165真核表达载体,VEGF165和TGFβ1均能促进人根尖乳头细胞多种矿化因子的表达,与根尖乳头细胞的分化相关。     

胎盘间充质干细胞牙向分化的体外研究

目的探讨胎盘间充质干细胞牙向分化的可能性。方法双酶(胶原酶和胰蛋白酶)消化法获得SD大鼠胎盘间充质干细胞,免疫细胞化学鉴定其表型、成脂成骨诱导鉴定其多向分化能力。SD大鼠胎鼠牙胚细胞条件培养基诱导胎盘间充质干细胞14 d,免疫细胞化学检测DSP和DMP-1,RT-PCR及凝胶电泳检测DSPP和DMP-1基因。结果胎盘间充质干细胞表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD31、C34和CD45。成骨和成脂诱导后形成钙结节以及脂滴。牙向诱导后的胎盘间充质干细胞形态无明显改变,表达成牙本质细胞特异性相关蛋白-DMP-1、DSP和特异性基因-DMP-1和DSPP。结论胎盘间充质干细胞具有牙向分化的潜能。     

人骨形成蛋白7荧光真核表达载体的构建及体外生物学活性检测

目的构建携带人骨形成蛋白7（hBMP-7）基因的绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-hBMP-7，体外转染小鼠基质细胞系W-20-17，检测相关生物学活性的变化。方法应用亚克隆法构建真核表达载体pEGFP-hBMP-7，酶切电泳鉴定。脂质体法转染W-20-17细胞，检测瞬时转染效率及目的基因的表达，观察细胞形态及生长情况，检测碱性磷酸酶（ALP）、钙结节及骨钙素等成骨细胞表型。结果48h后，基因转染效率达到4｜D％，报告基因及免疫荧光证明目的基因的表达。目的基因转染后细胞形态未见明显变化，增殖能力无明显改变，ALP活性明显增高，钙结节增多，骨钙素表达增强。结论成功构建了具有生物学活性的pEGFP-hBMP-7，基因转染后能诱导W-20-17细胞向成骨细胞表型转化。     

组蛋白去乙酰化酶8对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶8（histone deacetylase 8,HDAC8）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化的影响。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠 BMSCs,转染 HDAC8过表达慢病毒载体,并于矿化诱导液中培养7 d后,实时荧光定量PCR、Western blot检测BMSCs成骨分化能力的变化;矿化诱导14 d后,茜素红钙结节染色检测BMSCs矿化能力的变化。组蛋白去乙酰化酶抑制剂---曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）刺激转染HDAC8过表达慢病毒载体的 BMSCs,于矿化诱导液中培养7 d后,实时荧光定量 PCR及 Western blot检测 TSA刺激前后过表达 HDAC8的BMSCs成骨分化能力的变化。结果：HDAC8过表达组经矿化诱导7 d 后,成骨分化相关基因 mRNA、蛋白表达水平均低于空白对照组;经14 d矿化诱导后,HDAC8过表达组茜素红钙结节的着色程度及范围低于空白对照组。TSA 刺激的 HDAC8过表达组矿化诱导7 d后,成骨分化相关基因 mRNA及蛋白的表达均高于未加刺激组（P＜0．05）。结论：HDAC8对大鼠 BMSCs成骨分化具有抑制作用。     

含绿色荧光蛋白报告基因的TIMP-2真核表达载体的构建及其在人成釉细胞瘤中的表达

目的构建含有绿色荧光蛋白报告基因（GFP）的TIMP-2真核表达载体PcDNA3．1（＋）／GFP-TIMP-2，并探讨其在成釉细胞瘤（AB）中的表达情况。方法应用RT-PCR技术从体外培养的人AB中获得TIMP-2目的基因片段，采用分子克隆技术构建该基因的真核表达载体PcDNA3．1（＋）／GFP-TIMP-2，并以脂质体为介导转染至体外培养的人AB细胞。流式细胞仪测定转染效率，倒置相差荧光显微镜观察绿色荧光，RT-PCR检测转染前后TIMP-2mRNA的表达量的改变。结果构建的PcDNA3．1（＋）／GFP-TIMP-2经酶切和测序鉴定证明和预期结果一致。PcDNA3．1（＋）-TIMP-2转染人AM细胞后TIMP-2mRNA的表达量增加。结论成功构建TIMP-2真核表达载体PcDNA3．1（＋）／GFP-TIMP-2并转染至人AB细胞。     

Potential Roles of Bone Morphogenetic Protein 9 in the Odontogenic Differentiation of Dental Pulp Cells

IntroductionThe differentiation of dental pulp cells (DPCs) plays an important role in the repair of dental pulp injury. Bone morphogenetic protein 9 (BMP9) is one of the most effective BMPs to induce the differentiation of stem cells. However, the role of BMP9 in promoting the odontogenic differentiation of DPCs and dentinogenesis is worth knowing.MethodsFluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry staining were performed to detect the BMP9 expression in human dental pulp. BMP9 was overexpressed in human DPCs (hDPCs), and the mineralization of hDPCs was tested by alkaline phosphatase staining and alizarin red staining. The expression of odontogenic differentiation-related genes was examined by quantitative real-time polymerase chain reaction and western blotting. The subcutaneous transplantation experiment was performed to test the odonto-induction ability of BMP9 in vivo. The rat direct pulp-capping experiment was performed to test the function of BMP9 in promoting dentin formation.ResultsBMP9 showed an increased expression in odontoblast layer at both the mRNA and protein levels. BMP9 enhanced the mineralization and induced the expression of odontogenic differentiation-related genes in hDPCs. More mineralized nodules, and increased expression of dentin sialophosphoprotein (DSPP) and dentin matrix protein-1 (DMP1) were detected in the beta-tricalcium phosphate scaffold/cells composites of BMP9 group compared with the control group. Meanwhile, there was thicker reparative dentin formation in the BMP9 group in the rat pulp exposure experiment.ConclusionsBMP9 participates in the process of DPC differentiation and promotes DPC mineralization and dentinogenesis. BMP9 might be a potential therapeutic target in the repair of dental pulp injury.     

Refined mapping of the human dentin sialophosphoprotein (DSPP) gene within the critical dentinogenesis imperfecta type II and dentin dysplasia type II loci

Dentinogenesis imperfecta type II and dentin dysplasia type II are diseases resulting in abnormal dentin formation, which have been mapped to overlapping regions of human chromosome 4q defined by markers D4S2691 and D4S2692 (6.6 cM) and D4S3291 and SPP1 (14.1 cM), respectively. Recently, two of the major non-collagenous proteins of dentin, dentin sialoprotein (DSP) and dentin phosphoprotein (DPP, phosphophoryn) have been shown to be encoded by a single gene, termed dentin sialophosphoprotein (DSPP), which has been mapped to human chromosome 4. The purpose of this study was to perform refined mapping of DSPP related to these disease loci by gene content mapping, as well as to place the DSPP gene on the physical map of human chromosome 4 by sequence tagged site (STS) content mapping. Human genomic DSPP clones were isolated, and gene content mapping performed with specific primers for dentin matrix protein 1 (DMP1), bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (secreted phosphoprotein 1, SPP1). STS content mapping was then performed with flanking STS markers to these dentin/bone gene loci. Our results demonstrate that the DSPP and DMP1 genes are within a maximum distance of 110 kb. Both DSPP and DMP-1 have been placed on the physical map of human chromosome 4 within the interval defined by markers D4S564 and D4S1292. DSPP is thereby strengthened as a candidate gene for both DGI-II and DD-II.     

釉质基质蛋白通过miR-32对乳牙牙髓干细胞成骨与成脂分化的影响

目的:探讨釉质基质蛋白(EMPs)对乳牙牙髓干细胞(SHED)成骨和成脂作用的影响,并探讨其分子机制.方法:采用流式细胞术检测SHED表面抗原CD73、CD146、CD34和CD45的表达.通过OB成骨诱导液诱导SHED,采用茜素红染色检测其成骨分化能力.将SHED分为4组,NC组为无效序列shRNA干扰SHED,EM...     

Establishment of porcine pulp-derived cell lines and expression of recombinant dentin sialoprotein and recombinant dentin matrix protein-1

The major non-collagenous proteins in dentin have extensive post-translational modifications (PTMs) that appear to be odontoblast-specific, so expression of recombinant dentin proteins in other cell types does not achieve the in vivo pattern of PTMs. We established cell lines from developing porcine dental papillae and used them to express recombinant dentin sialoprotein (DSP) and dentin matrix protein-1 (DMP1). Pulp cells were immortalized with pSV3-neo and clonally selected. Cell lines were characterized by reverse transcruption-polymerase chain reaction (RT-PCR) and assayed for alkaline phosphatase activity and mineralized nodule formation. One of the five cell lines (P4-2) exhibited an odontoblastic phenotype, as determined by expression of tooth-specific markers, response to cytokines, and ability to form mineralized nodules. DSP and DMP1 expression constructs were transiently transfected into various cell lines. DSP, expressed by P4-2 cells, contained chondroitin 6-sulfate, which is a defining modification of the DSP proteoglycan. DMP1 was secreted and cleaved by proteases, even in human kidney 293 cells, which normally do not express DMP1, demonstrating susceptibility to non-specific proteolysis. Both recombinant proteins enhanced P4-2 cell attachment in a dose-dependent manner. We conclude that we have immortalized porcine odontoblast-like cells which express recombinant dentin extracellular matrix components with post-translational modifications that closely resemble those produced in vivo.     

可注射型富血小板纤维蛋白对人根尖牙乳头干细胞生物学行为的影响

目的 探讨可注射型富血小板纤维蛋白（injectable platelet rich fibrin，iPRF）对人根尖牙乳头干细胞（human stem cells from apical papilla，hSCAPs）生物学行为的影响。方法 酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定可注射型富血小板纤维蛋白提取液（injectable platelet rich fibrin extract，iPRFe）生长因子的含量；CCK 8、Transwell实验、茜素红染色分别检测iPRFe对hSCAPs增殖、迁移、矿化诱导的影响；荧光实时定量PCR检测与成骨/成牙向分化相关基因的mRNA表达水平。结果 iPRFe中可检测到血小板衍生生长因子 BB（platelet derived growth factor BB，PDGF BB)、胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor 1，IGF1）和转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGFβ1）；iPRFe能促进hSCAPs的增殖，且在1/4×浓度时hSCAPs增殖效果最佳；1/4×浓度的iPRFe对hSCAPs的迁移和矿化也有明显的促进效果；iPRFe还可明显促进碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）和骨钙素（osteocalcin，OCN） mRNA的表达（P<0.05）。结论 iPRF能够促进hSCAPs的增殖、迁移和矿化，有望为牙髓再生提供可能。     

三氧化矿物凝聚体对人乳牙牙髓细胞增殖和分化影响的实验研究

目的 对比三氧化矿物凝聚体(mineral trioxide aggregate,MTA)和氢氧化钙对人乳牙牙髓细胞增殖和分化的影响,为MTA应用于乳牙活髓保存治疗提供实验依据.方法 培养原代人乳牙牙髓细胞,采用噻唑蓝比色法检测乳牙牙髓细胞生长增殖的变化;von Kossa染色观察牙髓细胞钙结节形成情况,并计数分析;使用实时荧光定量聚合酶链反应法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因的表达.结果 氢氧化钙组牙髓细胞增殖率显著低于对照组和MTA组(F=1792.301,P<0.01),最大增殖率为89.7%;MTA组牙髓细胞增殖率显著高于氢氧化钙组和对照组(F=1835.065,P<0.01),最大增殖率为118.4%.氢氧化钙组和MTA组牙髓细胞von Kossa染色均呈阳性,两组间钙结节计数分析差异无统计学意义(P>0.05).三组间ALP基因表达量差异有统计学意义(F=349.651,P<0.01),氢氧化钙组显著低于对照组和MTA组,MTA组显著高于氢氧化钙组和对照组;三组间DSPP基因表达量差异也有统计学意义(F=1653.001,P<0.01),氢氧化钙组显著低于对照组和MTA组,MTA组显著高于氢氧化钙组和对照组.结论 从促进乳牙牙髓细胞的增殖和分化来看,MTA比氢氧化钙更适合作为乳牙的盖髓剂.     

人脐带间充质干细胞与牙髓细胞体外共培养对细胞生物学的影响

目的: 研究人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）与经骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）诱导后的人牙髓细胞（human dental pulp cells,hDPCs）共培养对细胞生物学特性的影响。方法: 分别取原代培养的hUCMSCs和hDPCs,分别通过流式细胞术、成骨诱导、成脂诱导以及免疫组织化学染色鉴定细胞;使用BMP2诱导hDPCs,14 d后检查其DSPP、ALP、DMP1的mRNA表达情况;按照1∶1、1∶5、5∶1的比例直接共培养hUCMSCs与经BMP2诱导后的hDPCs,实时定量PCR检测其DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF、Nanog的mRNA表达情况。根据实时定量PCR结果选取1∶1组与单独培养hUCMSCs组、hDPCs组比较,分别培养21 d后进行茜素红染色,在酶标仪上于562 nm处检测沉淀物形成情况。采用SPSS21.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 直接共培养14 d后,1∶1细胞组的DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF的mRNA表达量比单独培养的hUCMSCs组显著升高（P<0.05）,而Nanog mRNA表达量比单独培养的hUCMSCs组降低（P<0.05）。茜素红染色结果显示,1∶1组的OD值显著高于hUCMSCs组（P<0.05）。结论: 将hUCMSCs与经BMP2诱导后的hDPCs按照1∶1比例共培养,可以诱导细胞向成牙本质细胞方向分化,并促进血管生成因子的表达。