十种中草药体外抗细粒棘球绦虫原头节的实验研究

本文在体外培养条件下观察了仙鹤草、槟榔、山楂、鹤虱、苦楝皮、骆驼蓬、榧子、使君子、雷丸、南瓜子等１０种中草药对细粒棘球绦虫原头节的杀伤作用。其中骆驼蓬作用最强，在骆驼蓬浓度为０．２％的培养液中４８小时内原头节的校正死亡率达９０％。本文还在体外培养条件下观察到骆驼蓬杀中心有效成分一生物硷可透过棘球蚴囊壁；另用光镜和电镜观察到骆驼蓬作用主要破坏原头节的皮层和膜结构。     

细粒棘球绦虫基因库的构建

细粒棘球绦虫DNA经Sau3AI部分水解,并用电洗脱方法从琼脂糖凝胶中回收15-23kb大小的片段。得到的片段与λ噬菌体置换载体EMBL3 DNA重组,采用体外包装系统构建了细粒棘球绦虫的基因库,获得了1.2×10~6个重组子。通过与探针的分子杂交,从库中分离到6个细粒棘球绦虫γDNA基因的阳性克隆。     

细粒棘球绦虫在人体内棘球蚴原头节、囊壁蛋白质表达谱分析

目的初步掌握流行于青海省细粒棘球绦虫幼虫棘球蚴（原头节、囊壁）在中间宿主人体内蛋白质表达情况。方法利用SDS-PAGE和western—blot分析棘球蚴原头节和囊壁蛋白质表达谱,进一步利用2DE和MALDI-TOF质谱分析技术对原头节和囊壁蛋白质构成情况进行全面的研究分析。结果在原头蚴、囊壁组织的双向电泳图中,各蛋白点通过MAL—DI—TOF—MS检测,原头蚴和囊壁分别有40个蛋白质点和8个蛋白质点得以初步鉴定,包括有：（1）细胞骨架蛋白：肌动蛋白、原肌球蛋白。（2）代谢相关酶类：苹果酸脱氢酶;磷酸丙糖异构酶;脯氨酸氧化酶;谷胱甘肽-S-转移酶;类胡萝卜脱氢酶;肽基脯氨酰顺反异构酶;（3）物质转运相关蛋白：载脂蛋白A-I;（4）应激反应蛋白（HSP70,HSP20相关蛋白）。结论初步鉴定了寄生人体细粒棘球蚴原头蚴、囊壁组织中的部分蛋白质点,其中,原头蚴中共有40个蛋白点,囊壁中有8个蛋白点。这些蛋白可能与细粒棘球蚴运动、生长、发育、代谢调控等方面有关。     

细粒棘球蚴在NIH小鼠体内发育的组织学及组织化学的进一步观察

本文继续观察感染后6～24个月的细粒棘球蚴在NIH小鼠体内发育的组织学及组织化学变化。结果表明,在鼠体内出现育囊的时间为感染后7～8个月,囊液内见到游离原头节及子囊的时间分别为8及10个月,并发现细粒棘蚴体内的糖原、DNA、RNA、碱性蛋白质的含量,AKP、ACP及ATP酶的活力,均以生发层的芽状突起部分及原头节内的较丰富和较强。     

细粒棘球蚴囊液蛋白对卵清蛋白诱导的小鼠变应性鼻炎效果

目的　观察细粒棘球蚴囊液蛋白（hydatid cyst fluid protein,HCFP）对卵清蛋白（ovalbumin,OVA）诱导的小鼠变应性鼻炎（allergic rhinitis,AR）的保护作用。方法　将24 只BALB/c小鼠（8～10周龄,体质量约20 g）随机分成A（空白对照组）、B（空白干预组）、C（AR模型组）、D （AR + HCFP干预组）4组,每组6只。在基础致敏阶段（实验第0、2、4、6、8、10、12天）,A、B、C、D组小鼠分别腹腔注射200 μL无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）,含20 μg HCFP的无菌PBS溶液,含50 μg OVA 和5 mg Al(OH)3凝胶的无菌PBS溶液,含50 μg OVA、5 mg Al(OH)3凝胶和20 μg HCFP 的无菌PBS溶液。在局部激发阶段（实验第14～20 天）,A、B、C、D组小鼠分别鼻腔滴注体积为40 μL的无菌PBS、含20 μg HCFP的无菌PBS、含2 mg OVA的无菌PBS、含2 mg OVA和20 μL HCFP的无菌PBS。观察各组小鼠行为学改变并进行行为学评分,采用酶联免疫吸附试验（enzyme⁃linked immunosorbent assay,ELISA）检测各组小鼠血清γ干扰素（interferon⁃γ, IFN⁃γ）、白细胞介素4（interleukin⁃4, IL⁃4）、IL⁃5、IL⁃10、转化生长因子⁃β（transforming growth factor⁃β, TGF⁃β）和OVA特异性IgE抗体（OVA⁃sIgE）水平,采用苏木精⁃伊红（HE）染色观察各组小鼠鼻黏膜病理学改变。结果　C组小鼠行为学评分[（6.83 ± 0.50）分]显著高于A组[（1.17 ± 0.52）分]和B组[（1.33 ± 0.52）分],D组小鼠行为学评分[（3.50 ± 0.50）分]较C组降低（P均 < 0.05）。4组小鼠血清IFN⁃γ（F = 4.08, P < 0.05）、IL⁃4（F = 275.90, P < 0.05）、IL⁃5（F = 96.82, P < 0.05）、IL⁃10（F = 77.67, P < 0.05）、TGF⁃β（F = 9.98, P < 0.05）及OVA⁃sIgE水平（F = 44.69, P < 0.05）差异均有统计学意义。C组小鼠血清IFN⁃γ水平低于A、B组和C组,且血清IL⁃4、IL⁃5、OVA⁃sIgE水平均高于A、B组和C组（P均 < 0.05）;D组小鼠血清IL⁃10、TGF⁃β水平高于C组（P均 < 0.05）。镜下观察显示,C组小鼠鼻黏膜纤毛脱落缺损明显,杯状细胞数量增多且体积增大,间质水肿,黏膜下见小血管扩张;D组小鼠鼻黏膜病变较C组轻。结论　HCFP对OVA诱导的小鼠AR具有保护效果。     

复频高强度聚焦超声对离体细粒棘球蚴囊壁超微结构的影响

目的 分别用单频和多频聚焦超声体外照射细粒棘球蚴包囊, 观察对其囊壁的损伤情况。 方法 用羊肝细粒棘球蚴原头节接种小鼠, 1年后处死, 自腹腔取出包囊, 选择直径约2 cm的包囊40只随机均分4组。对照组剪破包囊壁, 用3%戊二醛固定并立即冷藏。实验A组包囊用2号单频换能器（4 W）照射, 实验B组用2及3号双频换能器（功率分别为4和5 W）同时照射, 实验C组用1、2及3号3频换能器（功率分别为4、4及5 W ）同时照射。各组均照射 1 min, 然后立即用3%戊二醛固定并冷藏。用肉眼、扫描电镜及透射电镜观察其变化。 结果 肉眼见实验组囊壁变厚, 颜色浑浊。透射电镜观察显示, 随超声频数增加囊壁结构被破坏程度加重, 角皮层纤维增粗、紊乱, 生发层细胞核肿胀破裂, 线粒体明显受损, 微绒毛变短, 断裂或消失。部分区域仅剩细胞碎片和破裂的细胞核。扫描电镜观察显示, 随超声频数增加, 囊壁内外表面被破坏程度加重, 最终正常结构被完全破坏。 结论 在体外, 复频高强度聚焦超声对小鼠细粒棘球蚴囊壁损伤明显, 其损伤程度随超声频数的增加而加重。     

阿苯达唑和吡喹酮联合用药治疗小鼠继发性细粒棘球蚴的研究

本试验采用正交设计，在不同的药物处理，疗程、剂量和感染时间等多种因素作用下，以感染率，囊重（抑制率）、囊数及包虫病理改变为评价指标，观察了联合应用阿苯达唑与吡喹酮治疗小鼠腹腔感染的原头节及包虫囊的效果。结果表明：联合用药无论对感染的原头节还是发育的包虫囊均有明显疗效，优于单一用药，而且在原头节感染早期用药的效果较优，这一结果对临床化疗有一定意义。     

细粒棘球绦虫成虫的单克隆抗体制备

为建立抗细粒棘球绦虫成虫的单克隆抗体细胞株，采用经口感染狗肠壁上寄生的成虫制备抗原免疫BALB／c小鼠脾细胞与骨髓瘤sp2／0进行细胞融合。结果显示经筛选克隆后建立了一株分泌抗成虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2G5E8F4E4。腹水的抗体效价为1：12800。初步建立了分泌抗细粒棘球绦虫成虫的单克隆抗体杂交瘤细胞株。     

青海高原不同宿主源细粒棘球蚴的病原生物学考察

本文对我国青海高原牦牛和绵羊体内原发性细粒棘球蚴的病原生物学进行了考察。结果表明牦牛细粒棘球蚴的感染率和钙化率显著高于绵羊源(P<0.01);牦牛肝脏感染和肺脏感染无明显差异(各占34.14％和31.20％),绵羊则绝大多数寄生于肝脏(50.76％),肺脏较少(13.40％),肝、肺均感染者与牦牛相近(34.26％和32.58)。牦牛肝脏棘球蚴的钙化率高(73.00％),育囊率低(69.51％),但肺脏棘球蚴与绵羊肝、肺脏棘球蚴的钙化率相近(分别为20.15％、28.00％和18.04％),育囊率均高(分别为94.58％、91.76％和90.00％)。人体棘球蚴的育囊率达100.00％。对各源棘球蚴内的原头节测量结果表明不论原头节寄生在何种宿主,其肺脏原头节总是大于肝脏原头节(P<0.01);同源肝、肺脏原头节的吻钩大小无显著差异(P>0.05)。牦牛棘球蚴体积较绵羊的大,但原头节却小的多(P<0.01),且二者原头节吻钩的多项测量指标之间存在显著的差异(P<0.01或P<0.05)。上述结果提示对这种差异不应仅以棘球蚴寄生在不同宿主来解释,还应考虑到该地区是否存在不同宿主的细粒棘球绦虫虫株。     

细粒棘球绦虫精子形成的超微结构观察

用透射电镜观察了细粒棘球绦虫精原细胞、精母细胞、精细胞的发育变化和精子的主要形态结构特点，从而揭示了该虫精子的形成过程。结果显示细粒棘球绦虫的精子形成主要是由于精细胞内微管结构的多次排列组合形成的。精细胞和精子中无线粒体和顶体结构。成熟的精子可分为头部和尾部。头部色较淡，顶端有与精子轴丝呈30°角排列的明暗相间的带构成的帽状物包裹。完整精子结构为固有膜包统一条轴丝，轴丝向前伸入头部，向后延伸至尾部。固有膜内线有微管排列，尾部前段一例可有2层做管，多为“2×4＋1，”结构，后段为一层微管紧贴固有腹内缘。抽丝有一个中央微管和9对外周微管组成，中央微管的外围有一个纤维鞘包绕，由纤维鞘发出纤维丝与外周9对微管相连，形成一个车轮状的“9＋1”微管系统结构。     

细粒棘球蚴重组抗原B的表达提取及其血清学检测初探

用基因工程技术制备出的细粒棘球绦虫重组抗原B（rAgB）表达载体,经诱导表达、亲和层析纯化获得具生物活性的重组蛋白质rAgB,用Western-Blot法检测病人血清。结果显示rAgB敏感性为91．6％（44／48）,特异性为93．8％（30／32）,其中10例泡球蚴（AE）病人及10例肿瘤病人血清均无交叉反应。说明rAgB具有较高的敏感性及特异性,可用于包虫病的常规血清学诊断,rAgB在宿主菌JM109内稳定表达,因此可在实验室内大量制备用于血清学诊断的rAgB。     

细粒棘球蚴慢性感染阶段小鼠血清中炎症因子的变化及意义

目的研究细粒棘球蚴慢性感染阶段小鼠血清中细胞因子水平的变化,探索机体对抗寄生虫感染的免疫应答 机制。方法从病羊内脏分离细粒棘球绦虫原头节,注射入BALB/c小鼠腹腔（2 000个原头节/只）,建立细粒棘球蚴感染 小鼠模型,对照组小鼠腹腔注射等体积PBS。于感染5个月后,采集对照及感染组小鼠血清,采用流式液相多重蛋白定量 技术检测血清中多种细胞因子水平并分析。结果感染组小鼠腹腔、肝脏、肺脏等部位均出现多个单一性包囊;其血清 中IL?17A、IL?6、IFN?γ、MCP?1、IL?12P70、TNF?α等炎症因子水平均显著高于对照组（t = 2.713～9.255,P 均< 0.05）;而抑 炎因子IL?10水平亦显著升高（t = 3.936,P < 0.001）。结论细粒棘球蚴慢性感染阶段小鼠体内炎症因子水平较高,有助 于抑制虫体生长。     

高强度聚焦超声辐照后细粒棘球蚴囊壁的病理变化

目的 观察细粒棘球蚴囊壁在高强度聚焦超声（HIFU）辐照后的病理改变。方法 采集感染细粒棘球蚴的新鲜羊肝，选取囊壁较薄、触摸弹性较好的细粒棘球蚴30个。采用随机抽样方法等分为3组，每组10个包囊。对照组，用普通诊断超声照射2 min。处理组1和处理组2分别用150 W和250 W声功率对细粒棘球蚴包囊进行沿囊壁多层面的环形扫描，层面间距为5 mm，扫描速度为3 mm/s，照射时间2～10 min（根据包囊大小）。取出照射后先肉眼观察细粒棘球蚴包囊大体改变，后取囊壁组织分别制作病理切片和透射电镜切片，观察其病理改变。 结果 HIFU（250 W）辐照后，细粒棘球蚴包囊剪开处内囊壁立即发生卷曲，剥离出的内囊颜色变白、变硬、透光度降低。病理切片显示，HIFU辐照后细粒棘球蚴的内囊壁上角皮层与生发层大部分发生分离。电镜观察结果显示，HIFU辐照后细粒棘球蚴的角皮层纤维纹理明显改变，生发层细胞发生裂解性破坏。 结论 HIFU沿细粒棘球蚴囊壁的多层面的环形照射可明显损害细粒棘球蚴囊壁。