北京市1998-2004年婴幼儿A3型流感病毒分离株HA1基因序列分析

目的 了解1998-2004年北京地区婴幼儿中流行的A3（H3N2）亚型流感病毒血凝素基因HA1区的基因变异特点。方法 提取该期间采集的呼吸道标本中H3N2亚型流感病毒的RNA，经逆转录多聚酶链反应扩增得到HA1区基因片段。通过目的基因的克隆、测序或PCR产物直接测序，进行序列分析。结果 19982004年问北京地区婴幼儿中流行的H3N2亚型流感病毒血凝素HA1区基因均为987bp，编码一个含329个氨基酸的蛋白质。这些H3N2亚型流感病毒血凝素HA1区的核苷酸和氨基酸同源性分别在95．5％～100．0％和93．0％～100．0％之间，分离年份越近同源性越高。在HA1区有7个糖基化位点非常保守，分别位于8、22、38、63、126、165和285位氨基酸。与1997年以前的毒株相比，1997年以后的毒株均在122和133位增加了一个糖基化位点。自1999年以后的毒株均在144位增加了一个糖基化位点。每年流行的毒株都较前一年的毒株出现了位于不同抗原决定簇或者受体结合位点的氨基酸替换。进化分析显示，每年分离的毒株均与以前的毒株出现了不同程度的变化，不断出现新的进化分支。结论 1998—2004年间北京地区婴幼儿中流行的H3N2亚型流感病毒持续不断地发生着点突变，导致抗原性不断发生漂移。加强监测和密切关注其变异动向对防控流感流行有极其重要的意义。     

2010-2012年长沙市流感流行情况及B型流感病毒基因特性分析

目的分析2010-2012年长沙市流感流行情况,并探讨B型流感病毒分离株血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的分子流行病学特征。方法采集长沙市流感网络监测哨点医院及暴发点流感样病例(ILI)咽拭子样本,狗肾传代细胞(MDCK)进行病毒分离,血凝和血凝抑制实验进行型别和亚型鉴定;提取B型流感病毒核酸,一步法RT-PCR扩增HA和NA基因片段,双向测定扩增产物核苷酸序列,对基因序列和氨基酸序列进行分析。结果 2010-2012年间,长沙市甲型H1N1、H3N2、B型流感交替流行,流行高峰为冬春季。3年间共分离到B型流感病毒78株,其中79.5%为Victoria系,20.5%为Yamagata系,以Victoria系为主。与WHO推荐疫苗株B/Brisbane/60/2008相比,HA基因的同源性在87.2%~98.4%之间,NA基因的同源性在94.5%~97.5%之间。氨基酸序列分析发现,与疫苗株相比,HA蛋白主要存在单个氨基酸的突变;种系进化分析发现,所有毒株HA和NA蛋白位于相应的谱系内,无抗原重排发生。结论 2010-2012年间长沙市甲型H1N1、H3N2、B型流感交替流行,B型流感病毒HA基因出现抗原漂移,但无重组毒株的出现。     

黑龙江省甲型H1N1流感病毒HA基因特性分析

目的测定流感病毒HA基因序列,从分子水平分析黑龙江省第1例甲型H1N1流感死亡病例病毒株以及2例2011年甲型H1N1流感病毒株HA基因的特点。方法采用MDCK细胞和Real-time PCR方法对甲型H1N1流感病毒HA基因片段进行分离、鉴定,并进行核苷酸序列测定和分析。结果将3例标本序列拼接后分别截取开放读码框内核苷酸同甲型H1N1代表株进行系统进化分析和同源性分析,结果显示新甲型H1N1流感病毒HA蛋白氨基酸与WHO推荐的疫苗株A/California/07/2009(H1N1)及中国的代表株A/Sichuan/1/2009(H1N1)亲缘关系最近,聚在一个分支上,同源性也较高,为98.6%～99.1%。结论目前的新甲型H1N1流感病毒的HA蛋白变异还很小,但应密切关注该病毒的变异情况。     

甲1亚型流感病毒A/河北/44/97株血凝素基因特性分析

[目的]探索新分离到的甲1亚型(H1N1)流感病毒血凝素(HA)基因特性。[方法]鸡胚、传代狗肾细胞(MDCK)分离流感病毒;血凝抑制试验鉴定型别。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增血凝素重链区(HA1)基因片断,产物纯化后双脱氧链末端终止法测定基因序列,并与1977年来的6个国际、国内代表株比较。[结果]抗原性分析:新分离的H1N1株与国家代表株A1/北京/262/95有大变异(64)。基因分析:HA1区有104个核苷酸的替换或缺失,导致40个氨基酸的改变,涉及到4个重要抗原决定簇区。新分离株与代表毒株相比核苷酸、氨基酸同源性逐年增加。[结论]分子生物学和血清学研究证实1997年河北省出现了新变异株,并在人群中造成广泛流行。     

四川省2006年B型流感病毒抗原性及基因特性研究

[目的]阐明2006年四川省流行的B型流感病毒血凝素抗原性及其基因变异情况。[方法]对2006年分离的B型毒株进行单向血凝抑制实验,再将病毒株进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因进化特性分析。[结果]2006年四川省人群中同时流行着B型Victoria系和Yamagata系毒株。Victoria系毒株与B/Hongkong/330/2001比较,病毒单向血凝抑制效价均有4倍以上差异,并且在HA1区发生8个氨基酸替换,在197位增加一个糖基化位点。Yamagata系毒株与B/Shanghai/361/2002比较,病毒单向血凝抑制效价均有4倍以上差异,并且在血凝素基因HA1区有7个氨基酸位点发生改变,在196位增加一个糖基化位点。[结论]四川省2006年B型流感病毒的抗原性与B/Hongkong/330/2001、B/Shanghai/361/2002相比已经发生了变化。     

宁波市2003年以来乙型流感病毒监测结果与HA1序列分析

目的：了解近年来宁波市乙型流行性感冒病毒流行和抗原性的变异情况及种系分布。方法：采用狗肾传代细胞（MDCK）培养分离流感病毒，经血清学鉴定后提取病毒RNA，经聚合酶链式反应扩增目的基因后进行乙型流感病毒的HA1区域基因片段的核苷酸序列测定。结果：2003～2005年6月共分离到乙型流感病毒22株，血清学鉴定结果除2株为Victoria系的毒株以外，其余20株均为Yamagata种系。在时间的分布上2003及2004年都有Yamagata和Victoria系的毒株出现。血凝素基因重链区（HA1）基因片段的核苷酸序列测定结果，两个系列的毒株都有一些小的变异，但Yamagata系的毒株变异更明显些。2005年分离到的Yamagata系乙型流感与Shanghai／01／2000株相比已经有7个氨基酸被替代，它们的同源性只有97．6％。结论：宁波市乙型流感病毒大多以散发存在为主，抗原性有一定的漂移。     

昆明地区流感病毒血凝素的蛋白质结构分析

目的 对从昆明地区分离10株流感病毒的血凝素(HA)基因进行蛋白质结构分析,与WHO推荐株进行比较,分析其异同.方法 从流感病毒中提取RNA,进行RT-PCR扩增血凝素基因,对扩增产物测序进行蛋白质结构分析.结果 蛋白质结构分析表明A/Kunming/01/2008(H1N1),A/Kunming/07/2008(H1N1)测出的序列大部分位于HA1,包括一小部分HA2和WHO 2007-2008年推荐株EU 100724.1对比,主要是第226位点不同,分别被Arg和Gln取代;A/Kunming/02/2008(H3N2)、A/Kunming/04/ 2008(H3N2)和WHO2007-2008年推荐株CY034116.1相比,变异位点为154 Asp→Asn,188 Gln→His,218 Val→Gly,248 Asn→Asp,255 Ile→Val,均位于蛋白表面,但对蛋白的结构没有产生大的影响;B/Kunming/10/2008和B/Kunming/09/2008有3点突变,分别为221Ala-Ile、281 Arg-Gly、550 Asp-Ile,但未引起蛋白质表面形状和电荷的变化;另外4株(两株H1N1和两株B型)与推荐株基本一致.结论 两株A(H1N1)与推荐株EU 100724.1的抗原性基本一致,另外两株A(H1N1)与流行株代表株的同源性相对前两株要略低,HA基因已有位点发生突变;两株A(H3N2)与分离年代较近的全国流感病毒流行株代表株同源性较高,高氨基酸的突变只有一个,突变对蛋白的结构没有产生大的影响;4株B型毒株属于Victoria系和国外地区及近年国内流行株代表株同源性相对较低,存在地区差异和抗原性差异,有必要对毒株的变异加强监测.     

2003年广东省流感病毒的流行概况及特征

目的了解2003年广东省流感病毒的流行特点和抗原变异情况。方法根据广东地区流感监测资料进行分析；用交叉血凝抑制试验检测病毒的抗原性；用逆转录-聚合酶链反应扩增病毒HA1基因，纯化产物进行核苷酸序列测定。将序列和Genebank中相关序列进行比较，用MegAlign软件绘制种系发生树。结果全年分离到510株流感病毒，其中H3N2亚型流感481株，占92．4％；乙型流感29株，占7．6％。实验室证实流感爆发52起，其中50起暴发是由H3N2亚型流感病毒引起，2起暴发是由乙型流感病毒引起。H3N2亚型流感病毒抗原性和疫苗侏A／Panama／2007／99（H3N2）有所不同。类似干A／Fujian／411／02（H3N2）。在HAl区氨基酸序列上，和疫苗株A／Panama／2007／99（H3N2）同源性为92．1％，存在有25个氨基酸差异。28株乙型流感病毒属于Victoria系，抗原性类似疫苗侏B／HongKong／330／01，1株乙型病毒属于Yamagata系，抗原性不同干B／sichuan／379／99。结论2003年广东省流感活动比2002年要强；同时流行着甲型（H3N2）和2个谱系的乙型流感病毒，H3N2亚型毒侏是优势侏，抗原性发生了漂移。     

湖南省2007-2008年A/H3N2亚型流感病毒血凝素基因特性研究

目的了解2007-2008年湖南省流感病毒优势流行毒株A(H3N2)亚型的基因变异特征。方法取病原学监测中分离到的29株A(H3N2)亚型流感病毒毒株,对其血凝素基因进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物纯化后测序;测序结果与WHO全球流感疫苗株序列进行同源比对,绘制种系发生树。结果2007年的分离株与2007-2008年北半球疫苗株A/Wisconsin/67/05比较,变异位点主要为G50E,S138A,K140I,R142G以及N144D。2008年分离株与北半球疫苗株A/Wisconsin/67/05比较,变异位点主要为G50E,S138A,K140I,L157S;而与2008-2009年北半球疫苗株A/Brisbane/10/07比较显示,变异位点主要为K140I,L157S。结论湖南省2007-2008年A(H3N2)亚型流感流行毒株的HA1基因发生了变异,可能是导致其流行的重要原因。     

2013-2018年度滨州市B型流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因进化特征分析

目的  分析滨州市2013-2018监测年度B型流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)、神经氨酸酶(neuraminidase, NA)基因突变及其抗原变异特征。 方法  采集滨州市2013-2018年的流感监测哨点医院流感样病例(influenza-like illness, ILI)咽拭子标本进行病毒分离, 选取29株B型流感分离代表毒株进行HA、NA基因序列测定, 通过基因分析软件进行同源性比对、构建HA、NA基因进化树。 结果  2013-2018各年度B型流感占比分别为47.0%、23.0%、31.0%、7.2%和65.1%, 差异有统计学意义(χ²=1 485.143, P < 0.001)。2013-2014年度分离株与当年世界卫生组织推荐的疫苗株匹配度差。2013-2014年度流行的B型流感病毒为Yamagata系HA与Victoria系NA基因的重配株。 结论  2013-2018监测年度, 滨州市B型流感病毒的进化是通过系间基因重配、不同谱系共流行、连续不断的不同抗原谱系的更替来完成的。     

湖州市乙型流感病毒HA1基因分析

目的:了解湖州市乙型流感病毒的基因变异情况和WHO推荐流感疫苗株对湖州市人体的保护情况。方法:采集类流感样本进行流感病毒的分离和鉴定,并对分离到的乙型流感病毒进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒基因后进行病毒血凝素HA1。基因核苷酸序列测定,用DNAMAN和MegAlign生物软件对测序结果进行分析处理,并与WHO推荐疫苗株基因进行比对。结果:分离到的毒株为Victoria系的乙型流感病毒,未发现核苷酸的丢失和插入,糖基化位点没有太大改变。毒株HA1区域的核苷酸序列长度为1015 bp,推导的氨基酸序列长度为339个,相比Yamagata系毒株在163位上都多1个天冬酰胺(N)。结论:2010年WHO推荐乙型流感疫苗株与湖州市的流行株为同一谱系毒株,预防保护效果较好。     

珠海市2011年连续发生5起乙型流感疫情的病毒HA1基因分析

目的分析珠海市2011年多起连续发生的流感疫情中分离的乙型流感毒株HA1基因特性,阐述流感暴发的原因。方法用MDCK细胞分离培养流感病毒,提取病毒核酸,采用RT-PCR扩增病毒HA基因并测定核苷酸序列,用ClustalX和MEGA4.1分析结果。结果珠海市2011年多起连续发生的流感疫情中分离的乙型流感病毒属Victoria系,与2011年流感监测分离株2011C-IN-0056-7相比,没有核苷酸的丢失和插入,没有糖基化位点的改变,核苷酸同源性在97.3%以上,氨基酸有1~3个位点发生了变异,属于同一变异株。与2010-2011年北半球乙型流感疫苗株B/Brisbane/60/2008相比较,核苷酸同源性在98.5%以上,氨基酸有1~4个位点发生变异,也属于同一变异株。结论引起本市流感连续暴发疫情的原因可能是本地流行株抗原漂移所致,与疫苗株B/Brisbane/60/2008核苷酸和氨基酸同源性都很高,吻合性较好,如果能够在儿童中普遍接种,应该能够起到很好的预防作用。     

2005年-2009年大连市季节性甲型H1N1流感病毒HA基因序列分析

目的:分析大连市2005年-2009年流感病毒H1N1亚型血凝素抗原性及其基因变异情况,为流感防治提供技术支持。方法:采集流感样病例的鼻咽拭子标本,用MDCK细胞进行流感病毒的病原分离,采用红细胞凝集实验测定病毒的滴度,用血凝抑制试验和RT-PCR进行流感病毒型别鉴定,通过RT-PCR扩增血凝素HA片段的基因,电泳、纯化后进行基因序列测定,利用生物信息学进行序列分析。结果:2005年-2009年共分离到季节性甲型H1N1流感病毒39株,其中28株进行了测序。与当年的疫苗株相比,2005年、2006年、2007年和2008年分离株的HA1区分别发生了11个、9个、15、15个突变。结论:在近几个年度的流行季节中,该地区有H1N1亚型流感的存在。该地H1N1流感病毒分离株有多处氨基酸发生替换,氨基酸的替换导致毒株的抗原性发生了漂移。     

嘉兴市2011—2012年乙型流感监测与HA1序列分析

[目的]了解2011—2012年嘉兴市乙型流感的流行状况及病毒序列特性、变异特点和WHO推荐流感疫苗株对人体的保护情况。[方法]将采集的流感样病例的咽拭子标本用MDCK细胞培养分离流感病毒,用标准血清及荧光定量RT-PCR方法鉴定。随机选取6株乙型流感病毒株进行HA1基因核苷酸序列测定,并进行特性分析。[结果]2011—2012年嘉兴市乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系同时存在。随机抽取4株Victoria系和2株Yamagata系毒株,在糖基化位点上没有变化。4株Victoria系毒株核苷酸同源性为98.6%～99.7%,氨基酸同源性为98.8%～100.0%,其中2株与2009—2012年疫苗株相比,在L58P、N129S、I146V、N171D发生了氨基酸的替换。2株Yamagata系毒株核苷酸和氨基酸同源性为99.4%,与2012—2013年疫苗株极为接近。[结论]嘉兴市流行的Victoria系乙型流感病毒与2009—2012年疫苗代表株同源性较高,当年度的流感疫苗株对本市Victoria系乙型流感病毒流行的防治有一定保护作用。但本地同时也还活跃着Yamagata系的乙型流感病毒,当年度的流感疫苗株对Yamagata系乙型流感病毒不能提供最佳保护。     

郴州市2007年流感病原学监测及A/H3N2亚型血凝素基因特性研究

目的对郴州市2007年流行性感冒的病原学监测结果进行分析,了解流感病毒优势流行毒株A(H3N2)亚型的基因变异特征。方法采用流感样病例(ILI)的咽拭子标本用狗肾细胞(MDCK)进行病毒分离培养,采用血凝(HA)及血凝抑制(HI)方法进行流感病毒初筛及分型鉴定;取病原学监测中分离到的4株A(H3N2)亚型毒株,对其血凝素基因进行逆转录-聚合酶链反应,扩增产物纯化后测序,测序结果与WHO全球流感疫苗序列进行同源比对。结果共检测4所哨点医院ILI咽拭子标本1435份,分离到流感病毒277株;阳性率19.30%,其中A(H3N2)亚型毒株156株。2007年分离株与北半球疫苗株A/Wisconsin/67/05比较,发生了变异。结论 A(H3N2)亚型流感病毒为郴州市2007年优势毒株,A(H3N2)亚型流感流行株的HA1基因发生了变异,可能是导致其流行的重要原因。     

引发脑膜脑炎流行的柯萨奇B5病毒的序列分析

安徽省明光市 2 0 0 1年 6～ 7月发生了一起无菌性脑膜脑炎流行 ,从病人脑脊液和粪便标本中分离到 17株柯萨奇 (Coxsackie ,Cox .)B5病毒 ,血清学实验证明所分离的病毒为此次无菌性脑膜脑炎流行的病因。对其中的 2株病毒 (MG/ 18/ 2 0 0 1和MG/ 39/ 2 0 0 1)测定了VP1区全基因核酸序列并做了比较分析。结果显示 :所测 2株病毒VP1区核苷酸长度均为 849bp ,两毒株之间仅有 1个核苷酸不同。这两株病毒与从 (GenBank)检索到的Cox B5病毒的核苷酸同源性约为 82 %,氨基酸序列亦有改变。从进化树上看 ,这两株病毒同在一个小分支上 ,与它们亲缘关系最近的是从一疑似脊髓灰质炎的儿童分离到的AF114383 -Cox B5病毒 ,而与从手足口病患者分离到的X6 770 6-Cox B5病毒相对较远。表明此次脑膜脑炎的病因病毒与同是侵犯中枢神经系统的Cox B5的原型株 -AF114383 -Cox B5病毒亲缘关系最近 ,但核苷酸已经发生了 >18%的变异 ,可以认为其是Cox B5新亚型病毒。     

甲型H1N1病毒HA、NA氨基酸序列比较及抗原性表位预测

目的：比较新型甲型H1N1流感病毒分离株HA、NA氨基酸序列之间的差异,分析HA、NA蛋白可能的抗原性细胞表位。方法：从GenBank中选取28株世界各地的新型甲型H1N1流感病毒分离株并下载各株HA、NA的氨基酸序列;使用ClustalX和MEGA2.0软件对氨基酸序列的进行进化树分析;用Protean软件预测HA、NA蛋白的B细胞表位;用NetMHCⅡ2.2预测T细胞抗原表位。结果：世界范围的毒株之间氨基酸序列相对保守,HA及NA均只有少数位点的变异,HA蛋白氨基酸序列之间较NA蛋白氨基酸序列之间变异较大;预测HA蛋白具有8个B细胞表位和10个T细胞表位;NA蛋白有12个B细胞表位和7个T细胞表位。结论：HA、NA蛋白的少数区域抗原性相对比较稳定,可以作为检测以及疫苗研究的靶区域。     

2005～2006年宁波市流行性感冒病毒的流行与优势株转换分析

目的：分析2005—2006年宁波市流行性感冒病毒的流行与流感病毒优势株的转换情况。方法：常年监测宁波市流感病毒的流行情况，选取不同时间的各种型别流感毒株进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定，并推导出其氨基酸序列进行基因进化特性分析。结果：2005年1—9月份宁波市的甲型流感以H3N2亚型为流行优势株，而乙型流感在2005年初以Yamagata系占优势。到2005年9月份以后至2006年底甲型流感的H1N1亚型替代了H3N2亚型占据优势株地位，乙型流感也以Victoria系成了优势株。结论：在2005年流感病毒甲、乙型的流行株均发生了亚型或种系的优势转换。流行株的基因特征及抗原性发生了明显的变异，并造成了一定规模的暴发流行。     

保健食品氨基酸水解方法的研究

[目的]保健食品组方复杂，氨基酸分析检测有一定困难，样品中蛋白质的水解是整个检验过程中的重要环节，国家标准分析方法中使用的水解方法未能全部满足实际工作需要，保健食品的氨基酸分析需要一种有效可行的水解新技术。[方法]采用大体积试管，抽真空充氮气并密封，低温烘热盐酸水解法，可达到水解率高、安全、样品代表性好、准确度高的目的。[结果]经日常工作中260份样品的分析检验证明本法是复杂样品氨基酸水解的较好方法。[结论]可推荐各有关实验室应用。