线粒体功能障碍在尿酸损伤肾小管上皮细胞中的作用

目的:探讨线体功能在尿酸损伤肾小管上皮细胞中的作用。方法:体外培养大鼠肾小管上皮细胞,将其分为对照组(N)、尿酸0.1 mmol/L组(U1)、尿酸0.2 mmol/L组(U2)、尿酸0.4 mmol/L组(U3)、尿酸0.6 mmol/L组(U4)。观察细胞形态的改变,计算细胞凋亡率;检测细胞内活性氧(ROS)的生成情况;观察线粒体膜电位变化。结果:尿酸干预组肾小管上皮细胞形态较对照组发生明显变化。尿酸干预组肾小管上皮细胞凋亡率较对照组明显上升(P0.05)。尿酸干预组线粒体膜电位较对照组显著下降(P0.05),U2、U3、U4之间,随着尿酸浓度的增加线粒体膜电位逐渐下降(P0.05)。尿酸干预组活性氧的水平较对照组明显升高(P0.05),随尿酸浓度的增加活性氧的水平逐渐增加(P0.05)。相关性分析显示肾小管上皮细胞凋亡率与线粒体膜电位的降低和活性氧的生成显著正相关(r=0.964,r=0.932,P0.01)。结论:线粒体功能障碍参与了尿酸致肾小管上皮细胞损伤的过程,为尿酸性肾病的诊治提供新的靶点。     

表皮生长因子调节小鼠生发泡期卵母细胞发育成熟的实验研究

目的 :观察表皮生长因子 ( EGF)对生发泡期 ( GV期 )卵母细胞生发泡破裂( GVBD)、第一极体 ( FP)形成的影响。方法 :体外培养的昆明种雌性小鼠 GV期卵母细胞分为卵丘卵母细胞复合体 ( COC)组及去卵丘裸卵 ( DO)组 ,观察不同浓度 ( 0、2、5、1 0、1 5μg/ L ) EGF对体外培养 0、4、8、1 2、2 4、3 6、48h COC、DO各组 GVBD、FP形成的影响。结果 :( 1 ) EGF可促进 DO组的卵母细胞成熟分裂 ,培养 48h EGF各组与对照组相比 ,有显著性差异 ( P<0 .0 5) ;( 2 ) COC组培养 3 6h后 EGF各组成熟率均显著大于对照组 ( P<0 .0 5) ;( 3 )不论是否存在 EGF,COC组成熟分裂率均显著高于 DO组 ( P<0 .0 5) ;( 4)EGF作用呈剂量依赖性。结论 :EGF不仅可促进 COC组 GVBD发生、FP形成 ,而且可不通过卵丘细胞直接刺激卵母细胞成熟 ,EGF对 COC促进作用强于 DO,并呈剂量依赖性。     

内皮素-1调节小鼠生发泡期卵母细胞体外成熟作用的实验研究

目的研究内皮素-1(ET-1)对小鼠未成熟卵母细胞生发泡破裂(GVBD)、第一极体(PBⅠ)排出的影响。方法昆明系雌性小鼠生发泡(GV期)卵母细胞分为去卵丘裸卵(DO)组及卵丘卵母细胞复合体(COC)组,在体外培养条件下,观察ET-1对两组GVBD、PBⅠ形成的量效和时效关系。结果(1)DO在10-9、10-8、10-7、10-6mol/LET-1作用3、6、9、12、24h对其成熟分裂无明显影响(P>0.05);(2)COC在10-8mol/LET-1作用6h能显著抑制GVBD率(P<0.05),在10-7、10-6mol/LET-1作用6h极显著抑制GVBD率(P<0.01);在10-8mol/LET-1作用12h明显抑制PBⅠ率(P<0.05),10-7、10-6mol/LET-1作用12h极显著抑制PBⅠ率(P<0.01)。结论ET-1对COC体外成熟具有抑制作用并呈剂量依赖性,对DO体外成熟无明显影响。     

褪黑素对老化卵母细胞体外发育能力的改善效果评价

目的探讨体外培养阶段(IVC)添加褪黑素(MT)对卵母细胞老化引起发育受损的改善效果。方法采用不同浓度的过氧化氢(H_2O_2)处理小鼠MII期卵母细胞诱导老化,浓度分别为0(对照组)、10、50、100、150μmol/L,体外受精(IVF)后统计各组二细胞率、囊胚形成率,检测老化卵母细胞的线粒体活性及丰度(Mitotracker Red、JC-1)、活性氧(ROS)水平、线粒体拷贝数等指标;在100μmol/L H_2O_2处理条件下,老化卵母细胞在IVF后的培养阶段分别添加不同浓度褪黑素(10-5、10-7、10-9 mol/L),统计二细胞率、囊胚率,并且分别检测各组获得囊胚的细胞数及凋亡率。结果不同浓度H_2O_2诱导卵母细胞老化后,囊胚发育率随H_2O_2浓度的升高而降低,50μmol/L和100μmol/L H_2O_2组囊胚形成率分别为(26.27±0.06)%和(28.46±3.45)%,相比对照组的(34.90±1.77)%显著降低,差异有统计学意义(P0.05);在H_2O_2诱导老化卵母细胞中,100μmol/L、150μmol/L H_2O_2浓度时,ROS水平相比对照组显著升高,差异具有统计学意义(P0.05);而活性线粒体的丰度及拷贝数呈现下降趋势,膜电位呈上升趋势,但相比对照组无显著性差异(P0.05);100μmol/L H_2O_2处理诱导卵母细胞老化后,在培养液中添加10-9 mol/L褪黑素组与老化对照组相比,囊胚率[(29.42±2.39)%vs.(20.87±4.12)%]、囊胚细胞数(39.36±9.78vs.37.91±4.25)均显著升高,凋亡率显著下降(2.57%vs.3.18%),差异均有统计学意义(P0.05);并且这些指标均达到与未经老化处理组的相似发育水平。结论老化卵母细胞体外受精后发育率和发育质量偏低的现象,可以通过在受精后体外培养阶段添加褪黑素得到改善。     

线粒体DNA拷贝数对卵母细胞受精结局的影响

目的 研究线粒体DNA拷贝数对卵母细胞受精结局的影响,为提高卵子质量,改善体外受精结局提供新思路.方法 应用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测不同受精结局的卵母细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数,并对各组结果作比较分析. 结果 A组52枚未受精卵的平均mtDNA拷贝数为(80,547±37,314) copies/μl,B组46枚发生原核阻滞的正常受精合子平均mtDNA拷贝数为(104,311±43,074) copies/μl,C组61枚单原核(1PN)或三原核(3PN)胚胎平均mtDNA拷贝数为(192,681±51,394) copies/μl.拷贝数A组显著小于B、C两组(P＜0.01),B组显著小于C组(P＜0.05).C组中碎片率＞30％的较差胚胎(C1组)和碎片率＜5％、发育速度正常的良好胚胎(C2组)两个亚组,两组的平均mtDNA拷贝数分别为(146,836±36,585)copies/μl和(297,268±102,369) copies/μl,两组比较结果有显著性差异(P=0.000). 结论 线粒体DNA拷贝数可作为衡量卵母细胞和胚胎质量的重要指标,线粒体缺乏可能是部分体外受精失败的原因.     

卵丘细胞上AIFM2和FDX1的表达及其与小鼠卵母细胞成熟的关系

目的检测小鼠卵母细胞体外、体内成熟过程中卵丘细胞(CCs)上线粒体相关凋亡因子2(AIFM2)和铁氧化还原蛋白1(FDX1)的表达,探讨其在卵母细胞成熟中的作用。方法从3周龄ICR雌性小鼠获取体内成熟卵丘-卵母细胞复合体(IVV-COCs)以及GV期卵丘-卵母细胞复合体(GV-COCs),并将GV期体外培养至MⅡ期卵丘-卵母细胞复合体(IVMCOCs)。收集对应的CCs,分成GV-CCs、IVM-CCs和IVV-CCs 3组。实时定量逆转录聚合酶链反应检测AIFM2和FDX1mRNA水平的表达,以GAPDH为参照;激光共聚焦免疫荧光技术观察COCs的AIFM2和FDX1的亚细胞定位。结果IVM-CCs和IVV-CCs的AIFM2mRNA相对表达量[分别为(0.72±0.01)和(0.67±0.02)]显著高于GV-CCs组[(0.10±0.06)](P0.01);同样,IVM-CCs和IVV-CCs的FDX1mRNA相对表达量[分别为(1.58±0.35)和(1.82±0.34)]也显著高于GV-CCs组[(0.10±0.03)](P0.01);而IVM-CCs和IVV-CCs的AIFM2和FDX1表达水平均无显著性差异(P0.05)。免疫荧光显示,AIFM2和FDX1主要定位于CCs胞质中,在GV-COCs中各层均有表达,且GV期卵母细胞中也有表达;IVMCOCs和IVV-COCs中表达阳性的细胞数目较GV期增加。结论卵母细胞成熟后,其CCs上AIFM2和FDX1的表达升高,表明AIFM2和FDX1参与了卵母细胞成熟过程,有望作为预测卵母细胞成熟的生物标记物。     

线粒体氧化磷酸化抑制剂FCCP体外对人精子动力学和线粒体功能的影响

目的通过线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)特异性抑制剂FCCP对人精子活动力及其线粒体功能影响的研究,探讨氧化磷酸化在精子能量代谢中的作用。方法选择来自捐精志愿者的正常精液8份,优选后制备精子悬液,将每份精子悬液分为4组,分别与终浓度为0μmol/L(对照组)、2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L的FCCP共孵育1h、3h、5h,以精子动力学参数、线粒体膜电位、精子细胞内ATP含量、精子质膜完整性作为评价指标,分析比较各组间的差异。结果 (1)各组精子活动率和其他各项运动参数随着FCCP浓度增高呈下降趋势:孵育1h后,与对照组相比,仅10μmol/L组的精子活动率、前向运动百分率和精子头侧摆幅度(ALH)显著下降(P0.05),其余指标无显著性变化,而其余浓度处理组的各指标变化均无统计学意义(P0.05);孵育3h后,10μmol/L组的精子活动率、前向运动百分率、平均路径速率(VAP)、直线速率(VSL)、曲线速率(VCL)、ALH和鞭打频率(BCF)均显著降低(P0.05),5μmol/L组的ALH和BCF指标显著下降(P0.05);孵育5h后,与对照组相比,10μmol/L组的前述指标继续显著性下降(P0.05),5μmol/L组的精子活动率和前向运动百分率也出现显著降低(P0.05),而2.5μmol/L组各指标差异均无统计学意义(P0.05)。(2)精子线粒体膜电位(MMP)和ATP含量随FCCP浓度增加逐渐降低,10μmol/L组的MMP和ATP含量显著低于对照组(P0.05)。(3)质膜完整性比较中,10μmol/L组比对照组显著降低(73.94%vs.84.53%)(P0.05)。(4)随着FCCP孵育时间延长,各组精子活动率和前向运动百分率呈下降趋势。结论不同浓度的FCCP体外处理精子后,精子活动率和其他各项运动参数,以及反映线粒体活性的线粒体膜电位和ATP含量呈浓度依赖性下降,FCCP所抑制的线粒体氧化磷酸化是精子能量代谢的重要途径。     

褪黑素保护卵母细胞应对热应激损伤的研究

目的探讨褪黑素对热激条件下小鼠卵母细胞体外成熟的潜在影响。方法采用小鼠卵母细胞成熟的热激模型,将卵母细胞随机分成3组,分别是对照组、热激组和热激+褪黑素组,测定1×10-9 mol/L褪黑素对热激后卵母细胞质量的改善作用。结果与对照组相比,热激组小鼠卵母细胞成熟率显著下降[(33.00±0.07)%vs.(85.00±0.03)%,P0.01],纺锤体组装异常,早期凋亡比率显著增加[(59.7±4.5)%vs.(22.0±3.5)%,P0.01];热激+褪黑素组与热激组相比,卵母细胞成熟率显著上升[(70.00±0.05)%vs.(33.00±0.07)%,P0.01],纺锤体异常比率显著下降,发生早期凋亡的卵母细胞比率亦显著下降[(37.3±6.1)%vs.(59.7±4.5)%,P0.01]。热激+褪黑素组热休克蛋白70的表达水平与对照组和热激组相比显著上调(P0.01)。结论褪黑素能通过调节热激后热休克蛋白70过表达来改善热激对卵母细胞造成的成熟率下降、纺锤体组装异常和早期凋亡比率的增加。     

NMNAT3调节NAD~+水平对兔BMSCs线粒体功能及其抗氧化应激能力影响的研究

目的研究烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶3(nicotinamide mononucleotide adenylyl transferase 3,NMNAT3)调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD~+)水平对体外模拟氧化应激状态下兔BMSCs线粒体功能及其抗氧化应激能力的影响。方法取新西兰大白兔股骨及胫骨骨髓,采用密度梯度离心联合贴壁培养法体外分离培养BMSCs并传代。取第3代细胞经流式细胞仪、多向诱导分化鉴定后,采用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的NMNAT3基因过表达慢病毒(Lv-NMNAT3-EGFP)进行转染(BMSCs/Lv-NMNAT3-EGFP),采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)及Western blot检测BMSCs内NMNAT3基因及蛋白表达情况,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)方法检测细胞增殖能力;以阴性对照慢病毒转染BMSCs(BMSCs/Lv-EGFP)以及未转染BMSCs作为对照。另采用H2O2模拟氧化应激处理兔BMSCs,根据处理条件分为4组:A组为正常BMSCs,不加H2O2处理;B、C、D组分别取未转染的BMSCs、BMSCs/Lv-EGFP和BMSCs/Lv-NMNAT3-EGFP,采用H2O2模拟氧化应激处理。处理24 h后检测NMNAT3对氧化应激状态下BMSCs线粒体功能的影响[线粒体膜电位改变、NAD~+及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平]、BMSCs抗氧化应激能力变化[活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn-SOD)含量、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性]、对改善BMSCs衰老及凋亡的作用[衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-gal)染色及TUNEL染色]。结果经鉴定,体外成功分离培养兔BMSCs;经慢病毒转染技术获得高表达NMNAT3基因的兔BMSCs稳定株,细胞内NMNAT3基因及蛋白明显提高(P0.05),细胞增殖趋势与正常BMSCs无明显差异。使用H2O2处理后,各组线粒体功能均出现损伤、细胞凋亡增加,但D组与B、C组比较,线粒体功能改善,膜电位明显升高,线粒体NAD~+水平及ATP合成增加;抗氧化应激能力增强,细胞内ROS、MDA含量减少以及抗氧化酶Mn-SOD、CAT活性均增加;SA-β-gal染色阳性细胞比例及细胞凋亡率明显下降。上述指标差异均有统计学意义(P0.05)。结论 NMNAT3通过增加线粒体内NAD~+水平可有效改善氧化应激状态下兔BMSCs线粒体功能,并增强其抗氧化应激能力,提高BMSCs在应激条件下的存活。     

抗氧化剂半胱氨酸对小鼠卵母细胞体外成熟及发育潜能的影响

目的 研究抗氧化剂半胱氨酸对小鼠卵母细胞体外成熟及发育潜能的影响,为进一步优化卵母细胞体外成熟培养体系提供理论依据. 方法 对照组采用基础体外培养液,共培养101枚GV期小鼠卵母细胞;实验组采用基础体外培养液+0.6 mmol/L半胱氨酸,共培养115枚GV期小鼠卵母细胞.观察两组卵母细胞的成熟率、谷胱甘肽的含量和线粒体内膜电位. 结果 对照组和实验组卵母细胞的成熟率分别为68.3％和80.0％,差别具有统计学意义(P＜0.05)；对照组和实验组卵母细胞平均谷胱甘肽含量分别为0.48±0.6 μg/L和0.51±0.5 μg/L,实验组谷胱甘肽含量略高,但两者无统计学差异(P＞0.05).线粒体内膜电位,对照组与实验组分别为0.04±0.003 △Ψm与0.39±0.020△Ψm,实验组线粒体内膜电位明显高于对照组(P＜0.05). 结论 抗氧化剂半胱氨酸对体外培养小鼠卵母细胞成熟有一定的促进作用,并可能会提高卵母细胞的发育潜能.