抗hTNF-α中和抗体识别表位的筛选和鉴定

目的:对噬菌体随机线性7肽库进行筛选,得到能与抗hTNF-α中和抗体特异性结合的表位肽.方法:以抗hT-NF-α中和抗体为靶,筛选噬菌体线性7肽库,双夹心ELISA,竞争抑制ELISA及MAP点杂交鉴定阳性噬菌体克隆.结果:经3轮筛选后随机挑取50个噬菌体克隆,经ELISA检测其中15个克隆显示与抗hTNF-α抗体有较强的结合能力,DNA测序结果得到的结构相似群为:WTFKMQP,WPFKMSP,WPYK-MIP和WNYKMLP,竞争性ELISA结果显示四个序列均能与TNF竞争性结合抗hTNF-α mAb,MAP点杂交结果显示筛选得到的多肽是能与抗hTNF-α抗体特异性结合的多肽.结论:筛选得到的7肽序列具有很高的同源性,并能与抗hTNF-α中和抗体特异性结合,为hTNF-α相关多肽疫苗的研究提供依据.     

噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽

目的 通过噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体,并进行特异性和亲和力鉴定.方法 建立稳定表达VPAC1的真核细胞系;利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选,随机挑取40个噬菌体克隆进行测序,初步鉴定确定阳性克隆,明确外源十二肽序列,固相合成该十二肽;利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析,鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力.结果 成功构建稳定表达VPAC1细胞系;经过4轮差减筛选,回收噬菌体逐轮得到富集,随机挑取40个克隆测序,共得到15条序列不同的多肽,经ELISA鉴定有7个克隆与细胞有特异性高结合能力;阳性噬菌体克隆与细胞结合通过多肽VP1介导;VP1能特异高亲和地与VPACl受体结合.结论 通过噬菌体展示肽库技术成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽.     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

从噬菌体展示肽库中筛选 PreS1抗原的结合肽

目的:从噬菌体随机七肽库中筛选能与PreS1抗原特异性结合的多肽。方法:利用噬菌体展示技术,以PreS1抗原为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和筛选,ELISA鉴定阳性克隆。结果:对肽库进行3 轮筛选后,通过ELISA和竞争抑制ELISA,获得了特异性的结合肽,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列。结论:利用噬菌体展示技术成功筛选到了PreS1抗原的结合肽,为乙肝的治疗和诊断探索新的途径。     

抗大肠杆菌LPS多克隆抗体的制备与LPS模拟肽的筛选

目的获得抗大肠杆菌脂多糖(LPS)多克隆抗体与模拟LPS表位的线性噬菌体展示肽克隆。方法制备兔抗鼠大肠杆菌抗血清,鉴定抗血清效价。以亲和纯化的多克隆抗体为靶,筛选噬菌体随机线性十二肽库。双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆。结果兔抗血清能与大肠杆菌LPS反应。用亲和层析纯化的多克隆抗体为靶分子进行三轮筛选,随机挑选17个克隆,其中6个克隆显示与多抗结合。大肠杆菌LPS可抑制阳性噬菌体克隆与多抗结合,所有克隆的IC50(达到50%抑制率的LPS浓度)为250ng/ml。结论获得能与大肠杆菌LPS反应兔多克隆抗体,筛选得到可模拟大肠杆菌LPS表位的噬菌体展示线性十二肽。     

噬菌体随机肽库筛选MUC1抗原模拟表位

目的噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位。方法利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,通过夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列并进行同源性及氨基酸分析,竞争性抑制实验鉴定噬菌体克隆。结果经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP。鉴定结果表明:4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论所得序列TAPDLRP、SAPDLRPAAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位。     

Endoglin特异性结合短肽筛选及功能分析

目的:对噬菌体随机12肽库进行筛选,寻求可与Endoglin结合的小分子短肽并测定其亲和常数.方法:经过3轮"吸附-洗脱-扩增"后,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定阳性克隆的DNA序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性,非竞争法ELISA固相法计算阳性噬菌体融合肽的亲和常数.结果:三轮生物筛选,噬菌体得到有效富集,竞争性ELISA显示6个阳性噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,测序获得5种多肽序列,优势序列为:AHKHVHHVPVRL,竞争抑制实验显示阳性噬菌体克隆与Endoglin有良好的亲和性,其亲和常数为:(1.431±0.293)×107 mol/L.结论:利用噬菌体肽库技术可以获得亲和力较强的Endoglin的结合肽,为今后进一步研究Endoglin在卵巢癌的早期诊断方面的作用奠定基础.     

全人源抗PSMA单链抗体的筛选及免疫活性鉴定

目的 从全人源单链噬菌体抗体库中筛选出抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)特异性单链抗体并进行免疫活性鉴定.方法 以合成的PSMA多肽为抗原,经过五轮吸附-洗脱-扩增,从单链噬菌体抗体库中筛选出特异性抗PSMA噬菌体抗体,ELISA检测其抗原结合能力,并对特异性较强的克隆提取质粒,表达可溶性抗体.Western Blott...     

整合素αvβ3特异性结合肽的筛选及初步鉴定

目的 应用噬菌体随机肽库展示技术筛选能与整合素αvβ3分子具特异性结合功能的小肽分子,并对其功能进行初步鉴定.方法 根据整合素αvβ3分子细胞外配体结合区域的品体结构及蛋白质序列设计①～⑤号5条短肽,并作为筛选配基,分别经过3轮"吸附-洗脱-扩增"后,ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序和分析,粘附试验进一步分析化学合成多肽的功能.结果 经3轮亲和筛选后,噬菌体克隆得到有效富集,以⑤号肽为代表,ELISA鉴定显示7个阳性克隆能与⑤号合成短肽有较强结合活性.进行DNA测序,多重序列分析获得2个多肽基序:****HRH,HWR****.粘附试验表明化学合成多肽FITC-HLPWHRH,FITC-HWRLHPH与表达整合素αvβ3的细胞株具有一定的亲和性,且结合能被αvβ3分子配体纤维连接蛋白所抑制.结论 通过噬菌体随机展示肽库技术在体外对合成的短肽进行筛选,可以获得与整合素αvβ3分子具特异性结合能力的小肽分子.     

噬菌体随机12肽库中VEGF模拟表位的筛选及初步鉴定

目的:从噬菌体随机12肽库中筛选能与抗血管内皮生长因子(VEGF)mAb阿瓦斯汀(Avastin)特异性结合的多肽.方法:用Avastin为靶分子,对噬菌体12肽库进行3轮生物淘洗,随机挑取80个克隆,ELISA法鉴定其亲和性,将亲和性高的阳性克隆进行DNA序列测定,推导与噬菌体外壳融合的12肽氨基酸序列.Fmoe固相法合成12肽,戊二醛交联12肽与血蓝蛋白(KLH),打点印迹(Dot blot)检测偶联物能否与Avastin结合.结果:ELISA显示,42个噬菌体克隆与Avastin有较强的亲和性,测序发现41个阳性克隆表达的融合12肽的序列一致,1个不同;化学合成的12肽能与Avastin特异性结合,12肽-KLH偶联物也能与Avastin特异性结合.结论:初步证明12肽模拟了VEGF部分表位.     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的：获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽，作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法：以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞，成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选，用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果：经三轮筛选，从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个特异性与骨肉瘤细胞os-732结合，而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论：得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆，提示骨肉瘤细胞表面结构复杂，具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性，为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽,作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞,成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选,用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选,从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个能特异性与骨肉瘤细胞os-732结合,而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆,提示骨肉瘤细胞表面结构复杂,具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTEIH)功能区表位。方法 应用差减筛选法，以抗hTERT多克隆抗体为靶筛选噬菌体12肽库，通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果 经3轮筛选，从随机挑取的24个噬菌体克隆中有13个克隆特异地与抗hTERT多抗结合，而不与正常小鼠IgG结合，其中11个克隆的氨基酸序列富含组氨酸(最高达41．6％)及亲水氨基酸(最高达91．67％)。结论 得到11个序列不同的hTERT表位，为研制针对hTERT的小分子抑制剂提供了实验依据。     

可结合细胞表面IL-2Rα的短肽分子的筛选

目的利用噬菌体肽库技术筛选可特异性结合IL-2Rα的短肽序列，探索获得IL-2Rα小分子拮抗剂的可能性。方法以高表达IL-2Rα的MT-2细胞为钓饵。筛选噬菌体线性12肽库。用抗IL-2Rα单克隆抗体竞争洗脱结合的噬菌体，细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆，并测序。结果随机挑选的17个克隆中有7个可与MT-2细胞结合。免疫组化显示阳性噬菌体克隆M15可与MT-2细胞及PHA刺激的PBMC结合。根据阳性克隆DNA序列，推导出氨基酸序列，共有6种序列，富含亲水氨基酸并包含Tyr、Phe、Leu保守残基。结论得到含Tyr、Phe保守残基的序列，阳性序列可结合细胞表面的IL-2Rα。     

人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)功能区表位。方法 应用差减筛选法,以抗hTERT多克隆抗体为靶筛选噬菌体12肽库,通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果 经3轮筛选,从随机挑取的24个噬菌体克隆中有13个克隆特异地与抗hTERT多抗结合,而不与正常小鼠IgG结合,其中11个克隆的氨基酸序列富含组氨酸(最高达41.6%)及亲水氨基酸(最高达91.67%)。结论 得到11个序列不同的hTERT表位,为研制针对hTERT的小分子抑制剂提供了实验依据。     

SELECTION OF NEW EPITOPES FROM MONOVALENT DISPLAYED PHAGE OCTAPEPTIDE LIBRARY

INTRODUCTIONOverthelastfewyears,enormousproteinsandpeptideshavebeenfusedtothecoatproteinsoffilamentousbacteriophage.Thesefusedproteinsandpeptidesweredisplayedontheviralsurfaceandretainedtheirbiologicalactivities.Suchasantibody(Ah)variabledabmains(l)fAhFabfragment(2),repeatsoftheCircumsporzoiteproteinofthehumanmalariaparasite(3)andfragmentOfHIV-1GagP24(4).MostoftheexperimentalreportsthusfarhavebeenbasedontheexpressionsystemoriginallydevisedbySmith(5),inwhichtheforeignproteinsandpeptide…     

利用噬菌体肽库筛选可结合TNF—α的短肽序列

目的 对噬菌体环七肽库进行筛选。寻求可拮抗肿瘤坏死因子a(TNF-α）活性的小分子短肽。方法 以rhTNF-α为靶筛选噬菌体环七肽库，双夹心ELISA鉴定阳性克隆。结果 ELISA鉴定随机挑选经3轮筛选后所得23个噬菌体克隆发现，其中11个克隆显示与TNF-α有较强的结合，DNA测序发现其中两个克隆的氨基酸序列为：c-ALWHWWH-c,另9个克隆序列为：c-(T/S)WLHWWA-c。结论 噬菌体克隆展示肽能够模拟TNF-α受体或抗体的结合表位，为TNFα结合肽。     

Screening and identification of mimotopes of LPS conservative epitope from random phage display peptide library

liPOpolysacchedde(ffe), or endototin, is a common component of the cell wall Of Grin negative bacterias, and is considered the initiative factor inducing endototic shock. The s~ture of LPS is so complicated thatthere is no ideal antagonist, anhbody or vaccine for thePunention and therapy of itS toxicity. Since LPS serotypesare abundant, the 'conservative anhgen epitopes includinglipid A and the inner core Oligosacchallde become the besttarget that may win a break~gh for developingnovel cr…     

能结合HCV E2蛋白的人CD81模拟肽的筛选与活性鉴定

目的用CD81单克隆抗体筛选噬菌体随机展示十二肽库,以期得到可模拟人CD81功能位点、能抑制HCVE2与其受体—人CD81分子结合的小肽。方法用CD81单抗从噬菌体随机展示十二肽库中筛选人CD81模拟肽,用ELISA鉴定阳性噬菌体克隆;以阳性噬菌体免疫BALB/c小鼠,分析小鼠免疫血清对阳性噬菌体与HCVE2结合的阻断作用;以HCVE2蛋白包被酶标板,检测阳性噬菌体对HCVE2与人CD81分子结合的抑制作用。结果对十二肽库进行3轮筛选后,经ELISA和DNA测序,鉴定出3个(C4,C13和C16)阳性克隆,与人CD81无同源序列。阳性噬菌体克隆C16免疫小鼠血清能阻断该克隆与HCVE2的结合。C16克隆能以剂量依赖的方式竞争性抑制HCVE2蛋白与人CD81的结合。结论用人CD81单抗从噬菌体随机展示肽库中筛选出的阳性噬菌体克隆所编码的小肽在功能上能模拟人CD81与HCVE2的结合活性,能竞争性抑制HCVE2与人CD81分子的结合,在抗HCV药物及疫苗研究中具有潜在应用价值。