人胆汁蛋白质组双向电泳图谱的建立与初步分析

目的建立人胆汁蛋白质组双向电泳图谱,用于胆汁比较蛋白质组学研究。方法A、B两例胆汁标本分别取自于一例肝门部胆管癌及一例胆总管结石病人。标本经脱盐、脱脂、去除核酸纯化处理后,分别各取350μg以固相pH梯度等电聚焦(IEF)为第一向,SDS-PAGE垂直电泳为第二向进行双向电泳(2-DE)。应用图像分析软件对银离子染色的2-DE图谱进行图像分析。结果经纯化处理的胆汁样本双向电泳图谱中的各个蛋白质点分离清晰,无明显的横向及纵向拖尾;A、B两例胆汁样本2-DE图谱中分别分离出250和216个蛋白质点。其中仪在A例出现的有187个,仅在B例出现的有153个;A、B两例均出现但表达量存在明显差异的有63个。结论本实验建立了一种较为理想的人胆汁蛋白质纯化制备及双向电泳技术;通过对良、恶性阻塞性黄疸胆汁2-DE图谱的匹配分析发现了大量的差异蛋白质点,为开展胆汁比较蛋白质组学研究筛选胆道疾病相关标志物奠定了前期实验基础。     

应用双向电泳技术初步建立人精子头部蛋白质图谱

目的 :利用人类精子蛋白质组分析的双向蛋白电泳 (2 DE)技术建立正常人精子头部蛋白质图谱。　方法 :先用固相pH梯度 SDS电泳技术 (IPG DALT)对全精子和精子头部蛋白质抽提物进行蛋白质分离 ,然后用图像分析软件比较精子头部蛋白质图像与精子蛋白质图像的蛋白质斑点组成差异。其中 ,全精子蛋白质的抽提比较了硫脲 /尿素 /盐酸胍和Kit/盐酸胍两种抽提方法。　结果 :硫脲 /尿素 /盐酸胍法与Kit/盐酸胍法所得的全精子 2 DE图像蛋白质斑点分别为 80 2个和 797个 ,其中相同的有 4 92个 ,将两种方法获得的图像整合而得到的全精子蛋白质图像有1 1 0 7个蛋白质斑点 ;精子头部图像蛋白质斑点有 4 2 8个 ,经匹配 ,全部来源于全精子蛋白质图像。　结论 :综合采用两种蛋白质提取方法初步建立了精子头部蛋白质图谱。     

特发性弱精子症精子与正常精子蛋白质双向电泳图谱分析

目的:探讨双向电泳技术在人类精子差异表达蛋白研究中的应用。方法:运用固相pH梯度双向凝胶电泳分离4例正常人和4例弱精子症患者精液标本的总蛋白质,凝胶银染后,用PDQuest软件进行分析,分辨出差异表达蛋白。结果:按照5倍的表达量计算,发现有差异表达的蛋白质点7个,2个点在弱精子症精子中高表达,而在正常精子为低表达;相反,在正常精子中高表达的5个点,而在弱精子症为低表达。结论:初步建立了正常精子和弱精子症患者精子的双向电泳图谱,并发现两者之间存在一些差异表达蛋白,为进一步研究特发性弱精子症精子差异表达蛋白的分离及鉴定奠定了良好基础。     

人肾小管上皮细胞蛋白质组的双向电泳及计算机图像分析

目的 双向电泳(two—dimensional gel electrophoresis，2DGE)技术是蛋白质组研究中最为重要的蛋白质分离方法。建立并优化人肾小管上皮细胞蛋白质组分析所需的固相pH梯度等电聚焦双向电泳及相关技术。方法 由于不同的细胞系特殊性，样品处理亦不同，因此以人肾小管上皮细胞：HK-2为研究对象，对样品液组成、样品处理、上样方式、上样量、IPG胶条和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法等相关技术进行了研究和条件优化后，以固相pH梯度等电聚焦为第一向和SDS均一胶(T=12．5％)的水平电泳为第二向，研究人肾小管上皮细胞蛋白质组。结果成功地得到了人肾小管上皮细胞双向电泳图谱，并通过ImageMaster 2D Elite 3．01软件进行图像分析，输出初步的检测结果。结论 建立蛋白质组研究的技术平台，为从更高的水平来寻找肾脏疾病的功能蛋白和特异性蛋白，阐明肾脏疾病发生发展的网络机制等后续研究工作奠定基础。     

干酪乳杆菌蛋白质双向电泳条件优化及图谱建立

采用超声波法和液氮研磨法提取了干酪乳杆菌菌体蛋白质,通过固相pH梯度等电聚焦双向电泳对蛋白质进行分离,并分别利用硝酸银和考马斯亮蓝方法进行染色.对上述不同方法比较结果显示,超声-三氯乙酸/丙酮提取蛋白质方法简便易行,适用于快速制备蛋白质样品,液氮研磨-三氯乙酸/丙酮沉淀法更适合干酪乳杆菌大规模蛋白质提取及组学检测,并且在制备的过程中不发生明显的蛋白质降解的现象.利用液氮研磨-三氯乙酸/丙酮沉淀法制备的干酪乳杆菌蛋白质样品分离效果良好,可获得重复性好和高分辨率的双向电泳图谱,便于后续的质谱及差异蛋白质组的分析,值得同行及相关研究者参考和借鉴.     

人胰液蛋白质组的双向电泳方法初步研究

目的 在已有实验基础上进一步建立优化的用于人胰液差异蛋白质组研究的双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)方法;探讨利用混合胰液进行胰腺疾病的胰液差异蛋白质组学的可行性.方法 通过ERCP术中放置鼻胰管引流收集5例胰腺癌(其中2例手术病理分别为胰腺中分化导管腺癌及导管内乳头状瘤癌变,另外3例经影像学检查结合临床诊断)和6例慢性胰腺炎胰液标本,取其中一例慢性胰腺炎胰液标本,通过改进胰液标本的处理方法、泡胀液的组成和一向等电聚焦条件后进行双向凝胶电泳,并和先前实验条件下的胰液2-DE图谱进行比较分析;同时利用优化后的双向凝胶电泳方法比较单份胰液和同病种混合胰液标本的2-DE图谱.结果 应用优化的2-DE方法,在胰液蛋白质加样量为200 μg时,可见凝胶上约有280个蛋白质点,有较好分辨率,较原条件下电泳图谱有较大改进.单份胰液和同病种混合胰液标本的2-DE图谱有较高程度的相似性(>75%).结论 优化后的胰液2-DE方法切实可行,通过各不同胰腺疾病混合胰液的2-DE图谱差异比较可为胰腺疾病的胰液差异蛋白质组学研究建立良好的基础.     

应用双向电泳分析精子冻融前后蛋白改变的初步研究

目的：精子蛋白双向电泳的建立，并利用其初步研究冻融前后精子蛋白的改变，为进一步筛选差异表达的蛋白奠定基础。方法：来源于同一个人的冻融前后精子样品经溶解液溶解，并以等电聚焦（IEF）作为第一向电泳，以变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）作为第二向，对上述样品进行分离，凝胶银染后进行比较。结果：建立了精子蛋白的双向电泳，并用其分析了冻融前后精子蛋白的改变。结论：冻融前后精子蛋白发生不止一种蛋白的改变，本研究的实验方法是一种研究精子冻融蛋白改变的有效手段，但仍有待进一步优化。     

利用蛋白质组技术进行胃癌差异蛋白质研究

目的分离胃癌蛋白质组，找出胃癌组织的差异蛋白质点。方法利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-DE）分离胃癌组织和正常对照组织的总蛋白质，并通过质谱分析技术对9个差异蛋白质点进行检测，以确定胃癌的差异蛋白质。结果在胃癌组织中点检测共有蛋白质点1147个，正常胃黏膜组织中点检测共有蛋白质点1079个。胃癌和正常胃黏膜组织两者共有164个差异蛋白质点，其中41个点仅在胃癌组织中表达，27个点仅在正常胃黏膜中表达；39个点在胃癌组织中高表达，57个点在胃癌组织中低表达。确定了7种在胃癌组织中明显高表达的蛋白质。结论利用蛋白质组技术获得了胃癌蛋白质组与正常对照组的差异蛋白质点，并获得了7种两者的差异蛋白质，为寻找胃癌的特异蛋白质奠定了基础。     

肾必宁对大鼠系膜增生性肾小球肾炎肾小球细胞凋亡及bax、bcl-2表达的影响

目的：探讨中成药肾必宁对慢性血清病性系膜增生性肾炎肾小球细胞凋亡与调控基因bax、bcl—2表达的影哨。方法：应用大鼠慢性血清病性系膜增生性肾炎模型；造模第4周起，灌服中成药肾必宁，以等量生理盐水为对照；24h定量测定尿蛋白；TUNEL法检测实验大鼠肾小球细胞凋亡；免疫组化SABC法观察bax、bcl—2表达的改变。结果：肾必宁治疗组肾小球细胞凋亡率较病理组升高(P＜0．01)，bax表达增强(P＜0．01)，bcl—2表达下降(P＜0.01)。结论：肾必宁可能通过影哨凋亡调控基因bax、bcl—2的表达，诱导肾小球细胞凋亡，进而抑制系膜增生性肾小球肾炎系膜细胞增殖。     

大鼠脊髓横断后蛋白质的双向电泳分析及质谱鉴定

目的建立急性脊髓损伤双向电泳图，分析损伤后脊髓内蛋白质的差异表达。方法使用裂解液提取脊髓蛋白，以双向电泳技术分离蛋白质，凝胶染色、图象分析后选取蛋白点，通过质谱技术获取肽质量指纹谱，在蛋白质数据库中查询蛋白质。结果成功建立重复性较好的脊髓蛋白质组双向电泳图，找出13个表达明显变化的蛋白点并获得这些蛋白质的肽质量指纹谱，成功鉴定出11个蛋白质。结论成功构建大鼠正常脊髓与损伤脊髓双向电泳图，用质谱技术鉴定了部分蛋白质。这些蛋白质的有些功能最近才被人们认识。相信在脊髓损伤后的继发性损伤中这些蛋白质可能会起到重要的作用。     

特发性高草酸尿症大鼠空肠蛋白质组二维电泳可行性研究

目的：在正式进行双向凝胶电泳实验前需要进行二维电泳的可行性评价,为双向凝胶电泳实验的顺利进行奠定实验基础。方法：取1只特发性高草酸尿大鼠（IH）和正常对照大鼠的空肠组织300mg,匀浆提取组织总蛋白,以双向电泳技术分离蛋白质,银染后扫描获得图谱,并以ImageMaster^TM 2D Platinum software（Version5．0）软件进行分析。结果：获得了清晰、稳定的凝胶蛋白图谱,正常大鼠凝胶图谱可检测到2541个蛋白点,IH大鼠凝胶图谱可检测到2654个蛋白点。结论：从获得的二维电泳图谱来看,2个蛋白质样品的蛋白质点的迁移基本稳定,从而保证后续正式的双向凝胶电泳实验有较好的重复稳定性和可行性。     

双向凝胶电泳结合激光捕获显微切割技术成功构建人正常前列腺细胞的双向电泳图谱

目的:建立正常前列腺细胞的蛋白质组学研究的技术体系,全面展示正常前列腺细胞的蛋白质表达谱。方法:用激光捕获显微切割(LCM)技术获取正常前列腺组织中的上皮细胞,提取细胞中的蛋白质,建立固相pH梯度双向凝胶电泳图谱,应用图像扫描仪及ImageMaster 2D Evolution分析软件获得蛋白质点的数字化和匹配性信息,挑选匹配良好的高丰度蛋白点,进行基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定。结果:成功构建出正常前列腺细胞的双向电泳图谱,并用MALDI-TOF-MS成功鉴定出正常前列腺细胞的一个蛋白质点。结论:正常前列腺细胞的蛋白质样品双向电泳图谱重复性良好,初步建立了正常前列腺细胞的蛋白质组学研究技术并验证了该技术的可行性。     

双向凝胶电泳结合激光捕获显微切割技术成功构建人正常前列腺细胞的双向电泳图谱

目的：建立正常前列腺细胞的蛋白质组学研究的技术体系，全面展示正常前列腺细胞的蛋白质表达谱。方法：用激光捕获显微切割（LCM）技术获取正常前列腺组织中的上皮细胞，提取细胞中的蛋白质，建立固相pH梯度双向凝胶电泳图谱，应用图像扫描仪及ImageMaster 2D Evolution分析软件获得蛋白质点的数字化和匹配性信息，挑选匹配良好的高丰度蛋白点，进行基质辅助激光解析／电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定。结果：成功构建出正常前列腺细胞的双向电泳图谱，并用MALDI-TOF-Ms成功鉴定出正常前列腺细胞的一个蛋白质点。结论：正常前列腺细胞的蛋白质样品双向电泳图谱重复性良好，初步建立了正常前列腺细胞的蛋白质组学研究技术并验证了该技术的可行性。     

人精子膜蛋白的二维电泳实验研究

目的 :利用二维电泳技术对人精子膜蛋白进行分离 ,为建立正常人精子膜蛋白的蛋白质图谱打下基础。　方法 :使用Percoll密度梯度离心筛选精子 ,用等电聚焦结合聚丙烯酰胺凝胶电泳对人精子膜蛋白进行二维电泳分析。　结果 :图像分析软件共可识别出约 80 0个蛋白质斑点 ,绝大多数蛋白的相对分子质量为 2 0 0 0 0～ 10 0 0 0 0 ,等电点为 3.0～ 7.0。　结论 :精子膜上至少有 80 0种蛋白 ,二维电泳可以对精子膜蛋白进行较精确的分离     

特发性高草酸尿大鼠肝脏蛋白质组的电泳分析

目的：建立稳定的特发性高草酸尿大鼠肝脏蛋白质组的双向电泳图谱.探讨其差异蛋白质组与特发性高草酸尿的关系.方法：取特发性高草酸尿大鼠及正常对照大鼠的肝组织300 mg.匀浆提取肝组织总蛋白,分别用Cy3或Cy5标记,每一对Cy3和Cy5标记样品均与一个Cy2标记的内标等量混合,采用凝胶内差异显示电泳（DIGE）技术进行电泳分离,经过不同激光下扫描得到不同样品的蛋白质组图谱.获得的图谱经DeCyderTM v6.5软件进行分析.结果：在特发性高草酸尿大鼠肝组织中共筛选出21个差异表达蛋白质点,有11个蛋白质表达水平显著增加,另外10个蛋白质表达水平显著下降.结论：利用DIGE技术可以作胶内对比分析,并可根据内标消除胶与胶之间的差异,从而提高统计可信度.分析出的21个差异蛋白质可能与特发性高草酸尿的发生有密切关系.     

大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立和体外分离的实验研究△

目的探讨以2-乙酰氨基芴（2-AFF）灌胃与2／3肝切除法联合运用建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型的适宜剂量,并探讨肝卵圆细胞的体外分离培养方法。方法将174只Wistar大鼠随机分为4个实验组（各30只）、未处理组（24只）和生理盐水组（30只）。4个实验组大鼠分别给予5、10、15及20mg／（kg·d）2-AAF灌胃（分别对应第1、2、3及4实验组）,于第5天行2／3肝切除,术后继续灌胃至处死大鼠;生理盐水组大鼠以生理盐水灌胃,其余操作同实验组;未处理组大鼠不做任何处理。6组分别于肝切除术后第4、8、12及16天各随机处死6只大鼠,取肝组织行HE染色和免疫组化染色,观察肝卯圆细胞的增殖情况[第4天时同时检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AsT）水平];并采用二步胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心法对大鼠肝卵圆细胞进行分离和培养。结果肝切除术后第4天,未处理组、生理盐水组、第1、2、3及4实验组大鼠的存活率分别为100％（24／24）、93％（28／30）、93％（28／30）、90％（27／30）、90％（27／30）及80％（24／30）。肝切除后第4天,与未处理组及生理盐水组比较,第2、3和4实验组大鼠的血清ALT及AST水平均升高（P〈0.05）。HE染色结果显示,第2、3及4实验组大鼠的肝组织均出现不同程度的肝损伤,其中第3和第4实验组均可见明显的肝卵圆细胞增殖反应;免疫组化染色结果显示,第2、3及4实验组卵圆细胞标志6（OV-6）表达阳性细胞数在术后第4、8、及12天,随2．AAF剂量的增加逐渐升高,与2-AAF间呈剂量嫩应关系（P〈0.05）。大鼠肝卵圆细胞进行体外分离和培养后,经OV-6免疫组化染色鉴定,有80％的细胞表达呈阳性。结论联合运用15mg／（kg·d）2-AFF灌胃加2／3肝切除,于术后第12天,有效诱导了肝卵圆细胞的增殖,且造模大鼠的耐受性较好、死亡率低。采用二步胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心法较成功地分离出了大鼠肝卵圆细胞。     

Goto—Kakizaki大鼠十二指肠空肠旷置术模型的建立

目的探讨以Goto-Kakizaki（GK）大鼠建立保留全胃的十二指肠空肠旷置术（DJB）模型的可行性及操作要点。方法将16只GK大鼠随机分为实验组（n=8）和对照组（n=8）。在规范的术前、术中及术后操作下,对实验组和对照组大鼠分别行DJB术和假手术,比较2组大鼠术前,术后1、2、3及4周空腹血糖和体质量的变化情况,评价手术造模是否成功,并观察2组大鼠的存活情况。结果术后4周2组大鼠均全部存活。与术前比较,实验组术后1周空腹血糖即下降（P〈0．05）,术后2、3及4周血糖趋于稳定;对照组术后各时相空腹血糖水平无明显变化（P〉0．05）。术后各时相实验组的空腹血糖水平均低于对照组（P〈0．05）,提示成功建立了模型。实验组术后4周体质量的增加值低于对照组（P〈0．05）。结论DJB是一种可行的、安全有效的降糖术式。规范实验操作程序可以降低术中风险,建立稳定的GK大鼠DJB模型。