广防己提取物致大鼠慢性肾间质纤维化的机制研究

目的：探讨广防己提取物（RAFE）所致的大鼠慢性肾间质纤维化的作用机制。 方法：用广防己提取物（200 mg·kg^-1·d^-1）和马兜铃酸（AA,10.0 mg·kg^-1·d^-1）给予大鼠间断灌胃22周,造成大鼠慢性间质纤维化模型,通过免疫组化方法观察肾小管上皮细胞转分化标志性蛋白角蛋白(CK)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)以及致纤维化因子-转化生长因子（TGF-β₁）在大鼠肾小管间质的表达。 结果：经图像分析, RAFE和AA组肾小管上皮细胞CK较对照组表达减弱,而α-SMA在肾小管上皮细胞及肾间质细胞呈弱阳性表达、Vimentin表达较对照组明显增多；同时RAFE和AA组大鼠肾小管TGF-β₁表达较对照组明显增多,各项指标统计学均有显著性差异。 结论：RAFE参与了肾小管上皮细胞转分化,促进了大鼠慢性肾小管上皮纤维化的发生,其中TGF-β₁对肾小管上皮细胞转分化起到重要作用。RAFE所致大鼠慢性肾小管上皮细胞转分化机制与AA作用相似。     

丹酚酸B对马兜铃酸诱导的大鼠肾纤维化的拮抗研究

目的研究丹酚酸B对马兜铃酸诱导的肾纤维化的拮抗作用。方法用SD大鼠建立马兜铃酸肾病动物模型,通过检测尿β2-微球蛋白、尿NAG、血清肌酐、尿素氮,观察丹酚酸B对模型大鼠肾功能的改善情况;通过检测肾组织形态以及Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、α-平滑肌肌动蛋白在肾小管间质的表达,观察丹酚酸B抑制肾小管间质纤维化的作用。结果丹酚酸B能降低大鼠尿NAG和β2-MG水平,减少Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、α-平滑肌肌动蛋白在肾组织的表达。结论丹酚酸B对马兜铃酸肾病动物模型有较强的抗纤维化作用。     

马兜铃内酰胺I对肾小管上皮细胞的损伤作用

目的:了解马兜铃内酰胺I(AL-I)是否导致肾小管上皮细胞损伤.方法:以体外细胞培养的人类近端肾小管上皮细胞系(HK-2)为研究对象,以马兜铃酸I(AA-I)为阳性对照,采用LDH释放试验检测AL-I的直接细胞损伤作用;用相差显微镜、电子显微镜观察细胞形态变化,用流式细胞仪分析细胞DNA含量以及细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)表达水平,以了解细胞凋亡情况;采用ELISA法检测细胞培养上清液中细胞外基质成分纤连蛋白(FN)以及促纤维化细胞因子转化生长因子β1(TGF β1)的分泌水平.结果:AL-I(2.5～20 mg·L-1)具有浓度依赖的直接细胞损伤作用;细胞形态、DNA含量及PS表达水平分析表明,AL-I在上述浓度范围内能够导致HK-2细胞凋亡,并能够导致HK-2细胞分泌TGF β1及FN.与AA-I的作用进行比较发现:在相同浓度情况下,AL-I的直接细胞毒作用强于AA-I,但其导致细胞凋亡、TGF β1及FN分泌的能力弱于AA-I.结论:马兜铃酸的代谢产物AL-I能够造成肾小管上皮细胞的损伤,作用与AA-I相似.尽管其致损伤作用较AA-I弱,但仍有可能是含马兜铃酸中药导致肾脏损伤及其纤维化过程的毒性成分之一.     

黄芪对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织转化生长因子β1表达的影响

目的:动态观察黄芪(AM)对单侧输尿管梗阻(UUO)所致大鼠肾小管间质纤维化的拮抗作用及对转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响,初步探讨其可能的分子作用机制.方法:SD大鼠随机分为假手术组、UUO模型组和黄芪治疗组.在造模后3,7,14 d处死动物,观察肾脏病理改变.采用免疫组化方法检测肾组织中TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达.用实时荧光定量RT-PCR检测大鼠TGF-β1 mRNA和α-SMA mRNA表达量.用westem blot检测大鼠TGF-β1蛋白表达量.结果:与假手术组相比,各时间点的UUO大鼠肾脏病理损害进行性加重,TGF-β1和α-SMA mRNA和蛋白表达随梗阻时间延长逐渐增高:黄芪治疗后可明显减轻UUO大鼠肾组织的肾小管损伤及.肾间质纤维化,使UUO大鼠肾组织中高表达的TGF-β1和α-SMA降低(p<0.05).结论:黄芪可能通过从核酸和蛋白水平抑制TGF-β1的表达,抑制肾小管上皮细胞转分化,减轻和改善UUO大鼠肾间质纤维化.     

三种外源物诱导兔原代肾小管上皮细胞构建体外肾毒性模型的研究

目的:采用庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ诱导兔原代肾小管上皮细胞构建体外肾毒性细胞模型。方法:分离培养兔原代肾小管上皮细胞(RTECs),酶化学染色和免疫组化鉴定;采用MTT法绘制兔RTECs传代培养生长曲线并确定最佳接种细胞量及加药时间;测定不同浓度庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ对细胞增殖作用及乳酸脱氢酶(LDH)释放量的影响。结果:碱性磷酸酶染色及免疫组化染色均呈阳性结果证明获得兔RTECs,细胞传代培养的最佳接种量为1×104个/孔,最佳给药时间为接种48h。不同浓度庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ均使细胞形态有一定的改变,对细胞增殖均有抑制作用,且呈浓度依赖性。三者均使细胞LDH的释放量增高,呈浓度依赖性,其中顺铂和马兜铃酸Ⅰ的作用最显著。结论:采用庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ可诱导兔原代肾小管上皮细胞构建体外肾毒性细胞模型。     

地灵丹对大鼠高尿酸血症肾病影响的实验研究

目的观察地灵丹对大鼠高尿酸血症肾病的影响,并探讨相关作用机制。方法采用高嘌呤饲料制作高尿酸血症肾病大鼠模型,分为地灵丹治疗组、别嘌呤醇组、模型对照组及正常对照组,每组15只大鼠,分别给予相应的干预措施,持续4周。检测大鼠血尿酸、肌酐变化,观察肾脏组织学变化及细胞因子TGF-β1、TNF-α的表达。结果实验第14天,与正常对照组比较,各造模组血尿酸、血肌酐水平显著升高,差异有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）;与模型组比较,地灵丹组及别嘌呤醇组血尿酸、血肌酐水平均显著降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。实验第28天,与正常对照组比较,模型组及地灵丹组血尿酸、血肌酐水平显著升高,差异有统计学意义（P〈0.01）,而别嘌呤醇组血尿酸水平出现显著降低,差异有统计学意义（P〈0.01）;与模型组比较,地灵丹组及别嘌呤醇组血尿酸、血肌酐水平显著降低,差异有统计学意义（P〈0.01）;与地灵丹组比较,别嘌呤醇组的血尿酸水平显著降低,血肌酐水平显著升高,差异有统计学意义（P〈0.01）;与正常对照组比较,其余各组TGF-β1、TNF-α阳性面积均显著增多,差异有统计学意义（P〈0.01）;与模型组比较,地灵丹组与别嘌呤醇组的TGF-β1阳性面积显著减少,差异有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）。与模型组比较,地灵丹组与别嘌呤醇组大鼠肾脏病理改变减轻。结论地灵丹可减缓高尿酸血症肾病大鼠肾脏损害的作用,其作用机制可能与调节TGF-β1、TNF-α等细胞因子有关。     

肾浊清颗粒含药血清对肾小管上皮细胞TGF-β/Smads信号传导的影响

目的:探讨肾浊清颗粒对TGF-β刺激后小鼠肾小管上皮细胞的影响。方法:将肾小管上皮细胞用含10%胎牛血清进行细胞培养,至80%融合后,分为正常对照组、模型组、肾浊清低、中、高剂量组及贝那普利组。检测肾浊清含药血清对肾小管上皮细胞增殖及TGF-β干预下肾小管上皮细胞增殖、肾小管上皮细胞Smad2/Smad7蛋白表达的影响。结果:TGF刺激后,肾小管上皮细胞增殖明显抑制,以不同浓度肾浊清含药血清干预肾小管上皮细胞对TGF刺激细胞增殖抑制具有逆转作用。TGF刺激后Smad2 mRNA表达显著增加,而Smad7 mRNA表达明显降低,给予不同浓度含药血清干预后,5%肾浊清含药血清、10%贝多普利含药血清可显著下调Smad2 mRNA表达;5%、10%肾浊清含药血清均可显著上调Smad7mRNA表达。结论:肾浊清颗粒含药血清可以对受损的小鼠肾小管上皮细胞起到一定的修复作用;可以通过抑制Smad2 mRNA的表达,上调Smad7 mRNA的表达来影响TGF-β/Smads信号传导通路,进而参与延缓肾纤维化。     

广防己致大鼠慢性肾小管-间质损伤的实验研究Ⅱ

目的:接前报继续观察广防己提取物诱导大鼠慢性肾损害作用,进一步了解不同剂量的广防己提取物(RAFE)可否引起慢性肾小管-间质损伤。方法:分别用广防己醇提取物25.0,120.0,200.0 mg.kg^-1.d^-1和马兜铃总酸10.0 mg.kg^-1.d^-1给大鼠间断(连续2周,停药1周)灌胃给药22周后,停药4周;分别于给药第17,22,26周留取血、尿和肾组织标本,检测相关肾功能指标;并取肾脏进行形态组织学观察,于给药第17,22,26周对肾组织进行Masson染色,并与马兜铃总酸进行比较。结果:RAFE作用肾组织形态学病变:小、中、大剂量和总酸组主要表现为肾小管功能损害———慢性间质纤维化,这些病理表现与马兜铃总酸所致肾损害极为相似。结论:RAFE小、中、大剂量灌胃给药13周以上可致大鼠慢性肾小管-间质纤维化,其肾功能和肾组织形态表现上与马兜铃总酸所致肾损伤相似,结果提示马兜铃酸是RAFE主要毒性成分。     

参地补肾胶囊对高糖培养的肾小管上皮细胞TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA表达的影响

目的:观察参地补肾胶囊对高糖培养下肾小管上皮细胞TGF-β1、α-SMA、E-cadherin mRNA表达的影响,探讨参地补肾胶囊抗肾间质纤维化的作用机制。方法:以高糖培养的人肾小管上皮细胞作为研究对象,采用血清药理学研究方法和Real-time PCR检测技术,观察空白对照组、高糖模型组、参地补肾胶囊组和贝那普利组的TGF-β1、α-SMA、E-cadherin mRNA的表达,采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。结果:高糖培养下的人肾小管上皮细胞TGF-β1、α-SMA mRNA的表达与空白对照组比较明显增加(P0.05),E-cadherin mRNA的表达与空白对照组比较明显降低(P0.05);参地补肾胶囊组能够下调肾小管上皮细胞对TGF-β1、α-SMA mRNA的表达,上调E-cadherin mRNA的表达,与高糖模型组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:本研究表明参地补肾胶囊通过下调高糖刺激的人肾小管上皮细胞对TGF-β1、α-SMA mRNA的异常表达,上调E-cadherin mRNA的异常表达,从而发挥抗肾间质纤维化的作用。     

复方积雪草含药血清对肾小管上皮细胞Activin A和TGF-β1 mRNA表达的调节作用

目的：探讨复方积雪草对炎症因子刺激下肾小管上皮细胞生物活性改变的干预作用。方法：实验用IL-β1刺激肾小管上皮细胞，用不同剂量复方积雪草含药血清进行干预。用福辛普利（血管紧张素转换酶拮抗剂）含药血清作为对照。TGF-β1、ActivinA和ActivinA受体ActR Ⅰ等基因表达采用逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）方法。结果：IL-1β诱导可使肾小管上皮细胞TGF-β1和ActivinA的基因表达较正常对照细胞显著增高。各浓度复方积雪草含药血清干预均可下调ActivinA及其受体的基因表达，但仅高浓度复方积雪草含药血清对TGF-β1的基因表达有显著下调作用。结论：复方积雪草对肾小管上皮细胞ActivinA及其受体ActRⅠ的基因表达有下调作用，可能是其抑制炎症因子诱导的肾小管上皮细胞发生细胞活性改变，降低肾小管间质进一步炎症损伤的重要机制之一．福辛普利亦有相似作用．但机制可能不完全相同．     

止消通脉宁干预TGF-β_1诱导HK-2细胞增殖的研究

目的：通过观察止消通脉宁含药血清对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）增殖的影响,探讨治疗糖尿病肾病有效中药复方止消通脉宁在防治肾间质纤维化方面的作用。方法：将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养基培养;实验分为6组：空白对照组、单纯TGF-β1诱导组（TGF-β110ng/mL）、空白血清对照组（TGF-β110 ng/mL＋10%空白血清）、干预1组（TGF-β110 ng/mL＋10%低剂量止消通脉宁含药血清）、干预2组（TGF-β110 ng/mL＋10%中剂量止消通脉宁含药血清）、干预3组（TGF-β110 ng/mL＋10%高剂量止消通脉宁含药血清）。倒置显微镜下观察各组细胞形态,MTT法检测细胞增殖。结果：TGF-β110 ng/mL能显著诱导人肾小管上皮细胞增殖,与空白对照组相比有显著性差异（P〈0.05）,且其作用随处理时间的延长而增强,但和止消通脉宁含药血清共同作用后,其促细胞增殖作用受到一定抑制（P〈0.05）。结论：止消通脉宁能抑制HK-2细胞增殖,在一定程度上具有防治肾间质纤维化的作用。     

Effect of Tangnaikang on TGF-β1-induced transdifferentiation of human renal tubular epithelial HK-2 cells

Objective

To explore the function of Tangnaikang (TNK) in the prevention and treatment of renal interstitial fibrosis through transdifferentiation of the human renal tubular epithelial cell line HK-2 induced by transforming growth factor-β₁ (TGF-β₁).

Methods

HK-2 cells cultured in dulbecco's modified eagle medium/F12 (1:1) with 10% fetal calf serum were divided into six groups: blank control group, TGF-β₁ group (TGF-β₁ 10 ng/mL), serum control group (TGF-β₁ 10 ng/mL + 10% serum), treatment group 1 (TGF-β₁ 10 ng/mL + 5% TNK serum), treatment group 2 (TGF-β₁ 10 ng/mL + 10% TNK serum), and treatment group 3 (TGF-β₁ 10 ng/mL + 20% TNK serum). Cell proliferation was detected by 4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay. Expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) and E-cadherin were observed by immunohistochemical assay. The contents of collagen I (Col I), collagen III (Col III), and fibronectin (FN) in the culture medium supernatant were detected by ELISA.

Results

E-cadherin was expressed and α-SMA was not expressed in normal HK-2 cells. In HK-2 cells cultured with TGF-β₁ α-SMA expression significantly increased, HK-2 cells significantly proliferated, and secretion of Col I, Col III, and FN significantly increased compared with the blank control group (all P<0.05). In the HK-2 cells cultured with TGF-β₁ and TNK serum, the expression of α-SMA significantly decreased, the expression of E-cadherin significantly increased, and the cell proliferation and the secretion of Col I, Col III and FN were significantly inhibited compared with the TGF-β₁ group (all P<0.05).

Conclusion

TNK can inhibit cell proliferation and reduce secretion of Col I, Col III, and FN. This indicates that TNK can inhibit transdifferentiation of human renal tubular epithelial cells induced by TGF-β₁, with the effect of preventing and treating renal interstitial fibrosis.     

止消通脉宁对转化生长因子-β_1诱导的人肾小管上皮细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及纤连蛋白mRNA表达的影响

目的探讨止消通脉宁含药血清对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）和纤连蛋白（FN）mRNA表达的影响。方法将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养基培养,分为空白对照组、TGF-β1诱导组（TGF-β110 ng/mL）、空白血清对照组（TGF-β110 ng/mL＋10%空白血清）、干预1组（TGF-β110 ng/mL＋10%低剂量止消通脉宁含药血清）、干预2组（TGF-β110 ng/mL＋10%中剂量止消通脉宁含药血清）、干预3组（TGF-β110 ng/mL＋10%高剂量止消通脉宁含药血清）。药物干预24 h后,荧光定量PCR检测ColⅠ、ColⅢ和FN的mRNA表达。结果 HK-2细胞经TGF-β1诱导后,ColⅠ、ColⅢ和FN的mRNA表达显著上升,与空白对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。经止消通脉宁含药血清干预后,其表达逐步下降,与单纯TGF-β1诱导组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。空白血清无此作用。结论止消通脉宁在一定程度上能够抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞ColⅠ、ColⅢ和FN的mRNA表达,减少细胞外基质成分的分泌,具有防治肾间质纤维化作用。     

镰形棘豆总黄酮含药血清对TGF-β_1诱导的人肾小管上皮细胞VEGF mRNA表达的影响

目的:通过观察镰形棘豆总黄酮含药血清干预转化生长因子β1(TGF-β_1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)纤维化细胞因子——血管内皮生长因子(VEGF)m RNA的表达,进一步探讨其在防治肾间质纤维化方面的作用。方法:将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养;实验分为4组:空白对照组、TGF-β_1诱导组(TGF-β_110 ng/m L)、空白血清对照组(TGF-β_110 ng/m L+10%空白血清)、镰形棘豆总黄酮组(TGF-β_110 ng/m L+10%镰形棘豆总黄酮含药血清)。药物干预24小时后,荧光定量PCR检测VEGF m RNA的表达。结果:HK-2细胞经TGF-β_1诱导后,VEGF m RNA的表达显著上升,与空白对照组比较差异有统计学意义(P0.05),经镰形棘豆总黄酮药物血清干预后,VEGF m RNA的表达逐步下降,与单纯TGF-β_1诱导组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:镰形棘豆总黄酮在一定程度上能够抑制TGF-β_1诱导的人肾小管上皮细胞纤维化,其机制可能与调节纤维化细胞因子VEGF的m RNA表达有关。     

肝舒胶囊含药血清体外抗肝纤维化的实验研究

目的研究肝舒胶囊含药血清对肝星状细胞(HSC-T6)自分泌的TGF-β1和Ⅰ型胶原的增生抑制作用,探讨肝舒胶囊体外抗肝纤维化的机制。方法含药血清作用于HSC-T6后,采用貂肺上皮细胞(Mv-1-Lu)生长抑制MTT法检测HSC-T6分泌的TGF-β1的活性及其总量,ELISA法检测PDGF诱导的HSC-T6的I型胶原含量。结果肝舒胶囊含药血清不仅可减少HSC TGF-β1的分泌总量,并抑制TGF-β1的活化,而且还可降低I型胶原的分泌。结论肝舒胶囊含药血清能抑制肝星状细胞TGF-β1产生并活化及降低I型胶原含量,可能是与其具有抗肝纤维化的作用有关。     

丹参酮IIA对TGF-β_1诱导的人肾小管上皮细胞增殖及Ⅰ型胶原分泌的影响

目的探讨丹参酮IIA在防治肾间质纤维化方面的作用。方法将体外正常培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)分为空白对照组、转化生长因子-β1组(TGF-β1,10μg/L)、干预一组(丹参酮IIA 1 mg/L+TGF-β110μg/L)、干预二组(丹参酮IIA 5 mg/L+TGF-β110μg/L)及干预三组(丹参酮IIA 10 mg/L+TGF-β110μg/L),分别予相应的干预措施。采用MTT方法检测HK-2的增殖以及用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化;采用ELISA法检测上清液中Ⅰ型胶原的含量。结果 TGF-β1组(10μg/L)能刺激肾小管上皮细胞增殖以及促进细胞的形态向成纤维细胞发生转变;加入丹参酮IIA(1 mg/L~10 mg/L)共同作用后,细胞的增殖受到抑制,细胞形态逐渐趋向于正常,呈现明显的剂量依赖性。TGF-β1(10μg/L)能刺激肾小管上皮细胞Ⅰ型胶原的分泌增加,与空白对照组比较差异有统计学意义(P0.05),与丹参酮IIA(1 mg/L~10 mg/L)共同作用后Ⅰ型胶原的表达量下降,并呈明显的剂量依赖性。结论丹参酮IIA能够维持HK-2细胞形态的稳定性,防止细胞向成纤维细胞方向发展,在一定程度上抑制了TGF-β1诱导的细胞增殖及分泌Ⅰ型胶原的作用,这可能也是其治疗肾间质纤维化的作用机制。     

柴苓汤对慢性环孢素A肾损伤的防护作用及其机制研究

目的 观察柴苓汤对慢性环孢素A肾病(chronic cyclosporine A nephropathy,CCN)大鼠肾脏转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）表达及细胞凋亡、增殖的影响,探讨其拮抗肾纤维化的可能作用机制。方法 采用经口灌服环孢素A［cyclosporine A, CsA,30mg/(kg·d）］的方法复制慢性环孢素A肾病大鼠模型,同时灌胃给予中药柴苓汤［3g／（kg·d）］治疗。测定大鼠肾功能指标血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）及肌酐清除率（CCr）;Masson染色观察肾小管间质纤维化程度;免疫组化、RT PCR观察TGF-β1、CTGF蛋白及基因表达;流式细胞术检测肾脏细胞凋亡率、增殖指数。结果与对照组［BUN（mmol/L）：6.123±0.588;SCr(μmol/L)：75.654±8.196;CCr(mL/min)：0.539±0.169］比较,模型组大鼠肾功能（BUN：11.600±1.437;SCr：101.985±10.809;CCr：0.272±0.060）明显降低（P<0.01）;肾间质区胶原成分明显增多;肾小管上皮细胞及间质细胞TGF-β1、CTGF蛋白及mRNA表达显著增强（P<0.01）;肾脏细胞增殖指数及凋亡率均有所上升,但凋亡/增殖的比值（0.317±0.059）较对照组（0.680±0.150）下降（P<0.01）。经中药柴苓汤治疗,大鼠肾功能（BUN：7.340±0.857;SCr：84.923±10.627;CCr：0.405±0.081）显著提高（P<0.05,P<0.01）,间质区胶原成分沉积减少;TGF-β1、CTGF蛋白及mRNA高表达下调（P<0.01）,肾脏细胞凋亡/增殖的比值（0.650±0.092）提高（P<0.01）。结论 柴苓汤能够改善CCN模型大鼠肾功能,抑制TGF-β1、CTGF表达,并通过诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,恢复细胞凋亡与增殖的平衡,从而延缓肾间质纤维化进程。     

马兜铃内酰胺-Ⅰ进入人肾小管上皮细胞及细胞内分布和蓄积的观察

目的:观察马兜铃内酰胺-Ⅰ(AL-Ⅰ)能否进入肾小管上皮细胞及其在细胞内的分布、蓄积情况。方法:以体外培养的人类近端肾小管上皮细胞系(HK-2)为研究对象,用不同质量浓度的AL-Ⅰ(5～20μg.mL^-1)处理细胞,采用荧光倒置显微镜观察细胞内由AL-Ⅰ产生荧光的有无及其分布,并在洗去含AL-Ⅰ的培养液后继续培养HK-2细胞48h,观察细胞内AL-Ⅰ荧光的持续情况以判断其蓄积性。结果:不同质量浓度的AL-Ⅰ(5～20μg.mL^-1)处理细胞0.5h内,均能在肾小管上皮细胞内观察到蓝绿色的AL-Ⅰ荧光,并且荧光仅分布于细胞浆中,而在细胞核内未观察到。在洗去含AL-Ⅰ培养液后继续培养时AL-Ⅰ的荧光可在细胞内持续存在48h以上,其持续存在部位仍为细胞浆。结论:AL-Ⅰ可以在短时间内迅速进入肾小管上皮细胞,其分布部位在细胞浆,不进入细胞核;AL-Ⅰ在细胞浆内的蓄积可能与其致肾损伤的毒性作用机制有关,即通过进入肾细胞并蓄积于细胞内在肾病过程中持续发挥毒性作用。     

人参皂苷Rg1对TGF-β_1诱导的肾小管上皮细胞红细胞生成素受体表达的影响

目的探讨人参皂苷Rg1对大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)上皮-间充质细胞转化(EMT)的作用及其与该细胞血红细胞生成素受体(EPOR)表达变化的关系。方法将体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)分为空白对照组、5μg/L TGF-β1刺激组,人参皂苷Rg1与TGF-β1共同干预组(5μg/L TGF-β1的基础上分别加入10,20,40 mg/L的人参皂苷Rg1)。每组细胞干预72 h后,在倒置显微镜下观察各组细胞形态的改变,并通过CCK8法检测人参皂苷Rg1对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响。酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定细胞培养上清液中胶原Ⅰ(Col-Ⅰ)和纤维粘连蛋白(FN)的含量。实时荧光定量PCR方法检测EPOR mRNA转录水平,免疫细胞化学法检测各组表达EPOR细胞的阳性率。结果 TGF-β1诱导NRK52E细胞形态变化,从原有典型的铺路石样上皮细胞形态转变为长梭形类似成纤维细胞形态,并抑制细胞增殖(P<0.05),增加细胞表达Col-Ⅰ和FN,抑制EPOR mRNA及其蛋白的表达(P<0.05);人参皂苷Rg1以剂量和时间依赖的方式抑制TGF-β1诱导的NRK52E细胞形态的改变,减少Col-Ⅰ和FN的表达,上调EPOR mRNA及其蛋白的表达(P<0.05)。结论人参皂苷Rg1对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT具有一定的抑制作用;该作用可能与人参皂苷Rg1上调肾小管上皮细胞EPOR的表达有关。     

地龙提取物通过抑制TGF-β1信号通路发挥抗肺纤维化作用研究

目的:探讨地龙提取物对抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)信号通路诱导的肺泡上皮细胞间质转化和肺成纤维细胞活化的影响。方法:MTT法分析地龙提取物对两种细胞增殖的影响。TGF-β1诱导A549肺泡上皮细胞的间质转化和MRC-5肺成纤维细胞的活化; 圆形度定量法分析细胞形态,免疫细胞化学法检测细胞E-钙黏附素(E-cad)和Collagen-Ⅰ蛋白的表达; 双抗体夹心酶联免疫吸附法检测Collagen-Ⅰ和FN水平。结果:对于A549细胞,与正常组比较,TGF-β1组圆形度和E-cad表达均显著降低(P<0.01),Collagen-Ⅰ表达显著升高(P<0.01); 与TGF-β1组比较,地龙组能显著抑制E-cad表达的下调(P<0.05),地龙组能显著抑制Collagen-Ⅰ表达的上调(P<0.05)。对于MRC-5细胞,与正常组比较,TGF-β1组FN、Collagen-Ⅰ的分泌量均显著增加(P<0.01); 与TGF-β1组比较,地龙组的上述两种蛋白的分泌量均显著减少(P<0.05)。结论:地龙提取物抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞的间质转化和肺成纤维细胞的活化,提示地龙提取物可能具有抑制肺纤维化的形成和发展的作用。