Lipofectamine介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞*☆

背景：自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷。胞嘧啶脱氨酶即可产生强大的旁观者效应。 目的：观察脂质体介导真核表达载体胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达。 设计、时间及地点：细胞学基因水平体外实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：SPF级C57BL纯系小鼠6只,体质量18~20 g,用于骨髓间充质干细胞的分离培养。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供。LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品。 方法：取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒DNA,对质粒plRES2-cGFP1-CD进行XhoI和BamHI双酶切,用于转染。取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用LipofectamineTM 2000介导法转染第3代鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测鼠骨髓间充质干细胞表面标记表达,荧光倒置显微镜观察细胞转染36,48 h后胞嘧啶脱氨酶基因的表达。 结果：质粒plRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0~1.5 kb处有1条带出现,符合胞嘧啶脱氨酶基因长度。流式细胞仪检测显示细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性。plRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强。 结论：脂质体介导的胞嘧啶脱氨酶基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值。     

脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞

背景：自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷。胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD）即可产生强大的旁观者效应。 目的：观察脂质体介导真核表达载体CD基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达。 设计、时间及地点：细胞学基因水平实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：SPF级C57BL纯系小鼠6只,由大连医科大学实验动物中心提供。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供。LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品。 方法：取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒DNA,对质粒pIRES2-AcGFP1-CD进行XhoI和BamHI双酶切,用于转染。取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine 2000介导法转染第3代骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记表达,细胞转染后CD基因的表达。 结果：质粒pIRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0~1.5 kb处有一条带出现,符合CD基因长度。细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性。pIRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白的表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强。 结论：脂质体介导的CD基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值。     

胞嘧啶脱氨酶自杀基因转染SHG-44胶质瘤细胞的实验表达研究

目的以含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的重组表达质粒（recombinant plasmid vector）pCMVCD转染SHG-44胶质瘤细胞，建立胶质瘤嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶（CD／5-FC）自杀基因治疗系统。方法体外扩增、酶切鉴定pCMVCD质粒并采用DNA序列测定pCMVCD质粒中的CD基因；改良Eagle培养基（DMEM）培养SHG-44胶质瘤细胞；脂质体lipofectamine2000介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，G418筛选重组子；免疫细胞化学检测表达情况。结果测序证实pCMVCD质粒含有CD基因；脂质体成功介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，获取了抗性细胞克隆（定名SHG-44／CD细胞）；免疫细胞化学染色显示SHG-44／CD细胞成功地表达了CD。结论脂质体介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞的方法简单、高效；成功建立了胶质瘤CD／5-FC自杀基因治疗系统，为后续实验研究打下了基础。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体在骨髓间充质干细胞中的表达

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，是一种理想的治疗性细胞和基因治疗的靶细胞。 目的：观察脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达。 设计、时间及地点：单一样本观察的细胞基因工程实验，于2006-03/2007-04在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：5月龄新西兰大白耳兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。 方法：采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。酶切鉴定后，采用Lipofectamine 2000介导胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。 结果：成功克隆了胞嘧啶脱氨酶基因，基因测序结果同Genbank中公布的序列一致。将胞嘧啶脱氨酶基因亚克隆到pIRES2-AcGFP1质粒上，构建了pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体。利用脂质体介导法将胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞，24h后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。 结论：pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体已成功转入骨髓间充质干细胞中，说明骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达☆○

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。 目的：探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达。 设计：单一样本观察。 单位：大连市干细胞与组织工程研发中心，大连医科大学基础医学院生化室。 材料：实验于2006-03/2007-06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成。新西兰大白耳兔，5月龄，雌雄不拘，体质量2.0~2.5 kg。 方法：以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定。真核表达质粒经酶切鉴定后，采用Lipofectamine 2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞。并于转染后24 h 在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。 主要观察指标：表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定。 结果：实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因，并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接。经转染兔骨髓间充质干细胞24 h 后，在倒置荧光显微镜488 nm 蓝光激发下观察，pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光，未经转染的细胞未见发出绿色荧光，说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞。 结论：骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

Rapsyn重组质粒转染小鼠骨髓间充质干细胞

目的探讨采用脂质体介导的基因转移技术将重组pEGFP-N1/Rapsyn质粒转染至小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可能性,并观察Rapsyn蛋白在靶细胞中的表达。方法采用全骨髓贴壁培养法分离纯化C57BL/6小鼠的BMSCs,在体外进行扩增、传代。取第3代细胞,采用脂质体介导的基因转移技术将重组pEGFP-N1/Rapsyn质粒转染至BMSCs中,并置荧光显微镜下观察转染结果;采用Western blot法检测靶细胞中Rapsyn蛋白的表达。结果 BMSCs经转染后24h可在荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染pEGFP-N1/Rapsyn质粒的BMSCs可稳定表达Rapsyn蛋白。结论利用脂质体介导法可将Rapsyn基因转染至BMSCs中,并能稳定表达Rapsyn蛋白。     

脂质体介导CD基因转染SHG-44胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的以含胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的pCMVCD重组表达质粒转染SHG-44胶质瘤细胞，体外观察5-氟胞嘧啶（5-FC）对转染CD基因的胶质瘤细胞的凋亡诱导作用。方法体外扩增、酶切鉴定pCMVCD质粒并采用DNA序列测定pCMVCD质粒中的CD基因；脂质体Lipofectamine 2000介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞，G418筛选培养获取抗性细胞克隆（即SHG-44／CD细胞）；免疫细胞化学检测SHG-44／CD细胞的CD基因蛋白水平表达；流式细胞仪、TUNEL实验及透射电子显微镜观察5-FC对表达CD基因的SHG-44／CD细胞凋亡的诱导作用。结果含CD基因的pCMVCD质粒成功转染进入SHG-44细胞，获取了含CD基因的SHG-44／CD细胞，免疫细胞化学染色显示SHG-44／CD细胞成功地表达了CD。在含5-FC的培养液中培养，SHG-44／CD细胞出现典型的凋亡形态，TUNEL显示凋亡细胞比例极高；透射电镜可见凋亡改变；流式细胞术检测凋亡率达18．6％，凋亡率呈剂量依赖性。结论建立了SHG-44恶性人脑胶质瘤细胞的CD／5-FC自杀基因系统。诱导SHG-44／CD胶质瘤细胞产生凋亡可能是脑胶质瘤CD基因疗法的重要机制。     

重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染骨髓间充质干细胞对其成骨分化的影响

背景：在许多情况下,人体组织修复是多因子共同协调作用的结果,因而共表达多基因载体的构建能够满足多因子基因治疗的需要,是近年来基因治疗的新思路。 目的：观察重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的表达及其对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响,为骨缺损的联合基因治疗奠定基础。 方法：使用全骨髓培养法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志抗原的表达;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒经酶切鉴定后,在脂质体介导下将其转入大鼠骨髓间充质干细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测;茜素红染色检测转染后大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。 结果与结论：流式细胞仪检测显示CD90表达强阳性,CD45表达阴性;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,并获得有效共表达;转染后第14天,茜素红染色阳性,能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,为骨缺损的联合基因治疗奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞表达的hVEGF121/EGFP融合蛋白的提纯及功能鉴定**

目的：用hVEGF121/EGFP真核质粒转染骨髓间充质干细胞,提纯其表达的hVEGF121/EGFP融合蛋白,并体外检测其功能。 方法：用课题组前期工作构建的pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒提取质粒DNA。通过阳离子脂质体介导pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒DNA转染体外培养的骨髓间充质干细胞,使用荧光显微镜检测hVEGF121/EGFP融合蛋白表达。用Amicon超滤离心管纯化融合蛋白。 结果：荧光显微镜下观察到转染pEGFP-N2-hVEGF121重组质粒的骨髓间充质干细胞,Westen blot证实转染骨髓间充质干细胞的培养液中存在hVEGF121/EGFP融合蛋白表达。MTT试验证实人脐静脉内皮细胞数量在hVEGF121/EGFP融合蛋白组明显多于对照组(P < 0.05)。Miles实验证实hVEGF121/EGFP融合蛋白增加血管壁的通透性。 结论：①携带hVEGF121/EGFP融合蛋白表达基因的真核表达质粒,在骨髓间充质干细胞中获得表达。②骨髓间充质干细胞表达的hVEGF121/EGFP融合蛋白在体外具有野生型血管内皮细胞生长因子的功能。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长、定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点。 目的：探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。 方法：将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序。利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆。采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Western-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期。 结果与结论：脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位主要位于胞浆。转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P < 0.05)。提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖。     

胞嘧啶脱氨酶自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞及其表达研究

目的探讨胞嘧啶脱氨酶（CD）自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞的方法及其表达效果。方法采用脂质体法将CD基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞，G418筛选阳性克隆（U251-CD），采用RT—PCR、免疫细胞化学染色、流式细胞仪（FCM）凋亡分析和高效液相色谱（HPLC）等方法检测CD基因的表达及其功能。结果CD基因成功转染U251细胞。G418筛选获得阳性克隆．RT—PCR证实阳性细胞有CD基因表达，抗-CD-抗体免疫细胞化学法显示细胞浆染色阳性．U251-CD细胞加入5-氟胞嘧啶（5-FC）后，FCM显示细胞凋亡峰，HPLC可检测到5-FC培养液内有5-氟尿嘧啶（5-FU）产生。结论CD基因能够在U251细胞表达．并具备将5—Fc转变为5-Fu的功能，造成肿瘤细胞凋亡．CD-5-FC系统可作为恶性脑胶质瘤辅助治疗手段之一。     

VP_(22)修饰的CD基因工程化神经干细胞治疗大鼠C6脑胶质瘤体外实验研究

目的 探讨病毒蛋白VP_(22)在胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因工程化神经干细胞治疗大鼠C6胶质瘤中的作用.方法 质粒pAdTrack-CMV-CD中PCR获取CD片段,克隆到慢病毒(lentivirus)质粒pHIV-EGFP和pHIV-VP_(22)-EGFP载体上,获得重组质粒pHIV-CD-EGFP和pHIV-VP_(22)-CD-EGFP,采用酶切和PCR技术进行鉴定.病毒包装采用三质粒系统共同转染293T细胞.CD基因的表达采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法鉴定.Lentivirus-EGFP、lentivirus-CD-EGFP、lentivirus-VP_(22)-EGFP和lentivirus-VP_(22)-CD-EGFP四种慢病毒感染经体外原代培养、扩增的SD大鼠胎脑神经干细胞(Nerual stem cells,NSCs),体外与C6细胞按1:1比例共培养,并加入终浓度100 mg/L的5-氟胞嘧啶(5-FC)培养3 d后,MTT比色法测定细胞存活率.结果 酶切和PCR证实,重组的慢病毒中含有CD基因.慢病毒lentivirus-EGFP、lentivirus-CD-EGFP、lentivirus-VP_(22)-EGFP和lentivirus-VP_(22)-CD-EGFP分别感染NSCs后与C6细胞共培养,在5-FC作用下,其细胞存活率分别为(95.57±4.83)%,(49.96±7.19)%,(94.25±4.32)%和(28.06±6.26)%.统计学处理,转染lentivirus-CD-EGFP和lentivirus-VP_(22)-CD-EGFP组的细胞存活率明显低于其相应对照组lentivirus-EGFP和lentivirus-VP_(22)-EGFP(P<0.01);其中转染lentivirus-VP_(22)-EGFP组的细胞存活率又明显低于lentivirus-EGFP组(P<0.01).结论 VP_(22)能够在体外增强CD基因修饰的NSCs抗C6胶质瘤疗效.     

CDglyTK双自杀基因杀伤C6胶质瘤细胞的体外实验研究

目的观察CDglyTK双自杀基因对C6胶质瘤细胞的杀伤作用及旁观者效应。方法利用逆转录病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)融合基因转染C6胶质瘤细胞,通过细胞集落形成试验、细胞生长抑制率(GIR)测定(MTT法),检测和分析CD/5-氟胞嘧啶(5-FC)、HSV-tk/更昔洛韦(GCV)双自杀基因系统对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应。结果RT-PCR检测分析融合基因的表达,显示逆转录病毒介导的双自杀基因在C6胶质瘤细胞中表达。不加5-FC和GCV时,转染组和对照组肿瘤细胞集落形成和倍增时间分别为94h、96h和25.7h、26.6h,组间差异比较无显著意义(P>0.05)。在5-FC(80.0mg/L)和GCV(10-1mg/L)浓度下,GIR分别为83.36%、7.08%,差异比较有显著意义(P<0.01)。转染C6胶质瘤细胞在混育细胞中比例占5%时,即可获得明显的旁观者效应,细胞生长抑制率可达38.48%。结论CDglyTK融合基因联合双前药治疗能取得显著的抗胶质瘤作用。     

BMSCs作为HSV-tk载体联合CX43增强旁效应治疗胶质瘤的实验研究

目的 以骨髓间充质干细胞(BMSCs)为自杀基因HSV-tk载体,联合连接蛋白CX43介导的旁效应,对以BMSCs肿瘤追踪特性为基础的胶质瘤进行治疗研究.方法 以CX43质粒转染C6胶质瘤细胞,以腺病毒介导HSV-tk转染BMSCs;建立C6胶质瘤模型,实验动物分为4组:C6对照组、CX43-C6组、tk-BMSCs/C6/GCV治疗组和tk-BMSCs/CX43-C6/GCV治疗组.观察动物生存期,MRI监测肿瘤体积;脑切片行PCNA、原位凋亡检测肿瘤中央与边缘部位细胞增殖与凋亡情况.结果 CX43组、tk/GCV组生存期长于对照组,二者联合治疗组生存期最长,MRI示部分肿瘤消失;肿瘤内部与边缘细胞增殖活性下降,凋亡明显.结论 tk-BMSCs/GCV体系可有效杀伤侵袭瘤细胞在内的胶质瘤灶,连接蛋白CX43可增强此治疗效果.