铁剥夺对 DNR诱导 K562细胞多药耐药基因表达的影响

目的 探讨铁剥夺对柔红霉素（DNR）诱导多药耐药基因MDR1表达的影响。方法 以柔红霉素单用或联合应用去铁胺（DFO）或二氯化铁（FeCl3）为处理因素作用于人红白血病细胞株K562,应用RT—PCR法、流式细胞分析技术,检测K562细胞多药耐药基因信使核糖核酸（MDR1mRNA）和P-糖蛋白（Pgp）表达的情况。结果 ①与空白对照组相比,柔红霉素（1μmol／L）作用24h可使MDR1／Pgp表达增加（P〈0．05）;②与单用DNR组相比,DFO可显著抑制柔红霉素诱导的MDR1／Pgp的表达,而FeCl3的作用相反（P〈0．05）。结论 柔红霉素短期作用可诱导MDR1表达,提示化疗药本身的诱导作用在肿瘤多药耐药产生中发挥重要作用。铁剥夺可减少柔红霉素诱导的MDRI／PgP表达,而FeCl3的作用相反,提示铁剥夺有可能成为阻止或降低白血病化疗耐药的新的措施之一,而白血病化疗患者补铁应慎重。     

急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562和K562/AO2细胞耐药的影响

目的 研究急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿骨髓间充质干细胞(MSCs)对K562和K562/AO2细胞药物耐受性的影响,并探讨其机制.方法 从白血病患儿骨髓中分离、培养并鉴定MSCs;建立K562和K562/AO2细胞株与MSCs共培养体系,观察MSCs对2种细胞生长的影响;Annexin V-FITC检测一定浓度的多柔比星对2种细胞凋亡的影响;流式细胞仪测定不同培养条件下的2种细胞周期;反转录PCR分析K562和K562/AO2细胞株的黏附培养组Bcl-2和Bax基因表达;实时荧光定量PCR检测2种细胞mdr1基因转录水平.结果 与单独培养的K562和K562/AO2细胞相比,与MSCs黏附共培养的白血病细胞生长较为缓慢,未见明显的对数生长期;黏附共培养的白血病细胞,G0～G1期细胞增多,S期细胞减少;K562和K562/AO2细胞株的黏附培养组Bcl-2基因表达强于悬浮组,此2组Bax基因表达均无显著差异,K562/AO2细胞Bcl-2基因相对表达要强于K562细胞株;白血病细胞单独悬浮培养组、黏附共培养组细胞mdrl基因转录水平比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 白血病患儿MSCs能抑制白血病细胞株K562和K562/AO2生长,改变细胞周期而逃避药物的促凋亡作用,K562/AO2对多柔比星产生耐药性可能与黏附共培养后Bcl-2基因表达增强有关,而与其本身含有的mdr1基因无关.     

环孢素通过抑制H2AX表达减少DNA损伤后修复逆转K562/A02细胞对多柔比星的耐药性

目的 探讨环孢素(CsA)通过减少DNA损伤后修复而逆转K562/A02对多柔比星(ADM)耐药性的可能性及其机制.方法 K562或K562/A02与不同水平ADM和CsA共培养后,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法计算半数抑制水平(IC50)、耐药倍数及增敏倍数.K562/A02细胞经CsA处理后,应用反转录(RT)-PCR检测细胞mdrl mRNA及H2AX mRNA表达水平;应用流式细胞仪测定细胞P-糖蛋白(P-gp)及H2AX蛋白表达水平;中性彗星实验法检测经兔抗ΥH2AX抗体处理后K562/A02细胞双链DNA损伤情况.结果 2×10-3g/L CsA即可增加K562/A02细胞对ADM的敏感性,增敏倍数达5.28倍.RT-PCR结果显示CsA下调K562/A02细胞mdrl mRNA和H2AXmRNA的表达(P＜0.05);流式细胞仪检测结果显示CsA作用K562/A02细胞72 h后使P-gp表达下降(17.8±1.5)%(P＜0.05),H2AX蛋白表达下降(13.3±1.7)%(P＜0.05);0.3×10-6g/L的抗体即可加剧ADM造成的双链DNA损伤,代表性的指标尾矩和尾DNA%明显增高.结论 抗ΥH2AX抗体阻止双链DNA损伤后修复;CsA可抑制H2AX的表达而减少DNA损伤后修复,从而增加K562/A02细胞对ADM的敏感性起逆转耐药的作用;此外,CsA尚可下调mdrlmRNA、P-gP表达减少、细胞内药物溢出而逆转耐药.     

氯丙嗪对白血病细胞株K562/AO2多药耐药逆转作用的实验研究

目的研究氯丙嗪对阿霉素诱导的K562耐药细胞株(K562/AO2)多药耐药的逆转作用及机制,以便为临床应用提供实验依据.方法 (1)以四氮甲基唑蓝(MTT)法检测氯丙嗪的细胞毒性及其对K562/AO2细胞的耐药逆转作用;(2)以流式细胞术检测氯丙嗪处理前后K562/AO2细胞内柔红霉素(DNR)的蓄积量;(3)以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测氯丙嗪处理前后后K562/AO2细胞中mdr-1 mRNA的表达水平.结果 (1)氯丙嗪在3 μg/ml时对K562/AO2增殖的抑制作用小,抑制率＜5%;(2)氯丙嗪明显增加DNR对K562/AO2的毒性作用(P＜0.05),耐药逆转倍数为1.901;(3)氯丙嗪可明显增强DNR在K562/AO2细胞内的蓄积(P＜0.05);(4)氯丙嗪对K562/AO2细胞mdr-1 mRNA的表达水平无影响.结论氯丙嗪通过增加K562/AO2细胞内DNR的蓄积显著提高 K562/AO2细胞对DNR的敏感性,其逆转白血病细胞多药耐药的机制与mdr-1基因无关,还有待进一步探讨.     

ATRA对K562细胞HOXA5基因表达与细胞周期、凋亡的影响

目的本研究旨在通过全反式维甲酸(ATRA)对人髓系白血病细胞株K562细胞的干预来分析同源盒基因(HOX)A5的表达变化及其与细胞周期、凋亡的关系,探讨HOXA5在髓系白血病发生、发展过程中的作用,为临床治疗白血病提供实验依据。方法通过细胞增殖-毒性实验(CCK-8)筛选出ATRA干预K562细胞的最佳浓度值。流式细胞术检测10μmol/LATRA分别干预K562细胞24 h、48 h和72 h后,各组细胞的凋亡情况及细胞周期分布的变化。实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹法测定K562细胞中HOXA5 mRNA及蛋白的表达情况,并分析HOXA5 mRNA及蛋白的表达与细胞周期、凋亡的关系。结果 K562细胞中可以检测到HOXA5 mRNA及蛋白的表达,ATRA干预K562细胞后HOXA5 mRNA及蛋白的表达量升高,细胞凋亡率明显增加(P0.05),细胞增殖周期被阻抑在G_0/G_1期,细胞增殖受抑,且HOXA5 mRNA及蛋白的表达量与细胞凋亡率呈正相关(r=0.944,r=0.826),与细胞周期G0/G1期增加百分比呈正相关(r=0.870,r=0.962),与S期降低百分比呈负相关(r=-0.946,r=-0.926)。结论 ATRA干预K562细胞后,细胞中HOXA5 mRNA及蛋白的表达量升高;ATRA可能通过上调HOXA5 mRNA及蛋白的表达抑制K562细胞增殖,促进细胞凋亡。     

多药耐药基因在K562细胞诱导分化过程中的表达

目的　通过组织血浆酶原激活剂 (TPA)诱导K5 6 2细胞分化 ,探讨白血病的多药耐药性。方法　应用体外细胞培养技术 ,通过细胞形态、细胞化学染色观察细胞分化 ;用免疫组化 (IC)、流式细胞术 (FCM )、聚合酶链反应 (RT PCR)等技术检测P 糖蛋白 (P gP)的表达和功能及多药耐药基因 1信使核糖核酸 (mdr1mRNA)的表达。结果　TPA诱导K5 6 2细胞向单核 /巨噬细胞分化 ;在此分化过程中mdr1mRNA表达随作用时间延长而渐增加 ,P gP表达及功能增强。 结论　mdr1mRNA、P gP表达及功能在TPA诱导K5 6 2细胞向单核 /巨噬细胞分化过程中随细胞分化而上调     

槐耳清膏联合羟基脲对K562细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响

目的 观察槐耳清膏联合羟基脲对K562细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用以及对相关基因表达的影响,探讨槐耳清膏联合羟基脲抗白血病作用的效果及分子作用机制.方法 取体外培养、对数生长期的白血病细胞株K562细胞用于实验研究;应用四甲基偶氮唑盐比色法和细胞形态学观察槐耳清膏联合羟基脲对体外培养的K562细胞的增殖抑制作用;应用流式细胞术观察槐耳清膏联合羟基脲对K562细胞的凋亡诱导作用;采用RT-PCR技术检测K562细胞bcr-abl、bax和bcl-xl mRNA表达水平的变化.结果 槐耳清膏单用及联合羟基脲均对K562细胞有抑制增殖和诱导凋亡作用,且两药联合应用具有协同作用;两药单独应用均可不同程度下调bcl-xl mRNA的表达并上调bax mRNA的表达,联合应用时具有协同作用;槐耳清膏亦可下调bcr-abl mRNA的表达,而羟基脲对其表达无明显影响,两药联合对bcr-abl mRNA表达未见有协同作用.结论 槐耳清膏可协同羟基脲抑制K562细胞增殖及诱导K562细胞凋亡;槐耳清膏诱导K562细胞凋亡可能与下调K562细胞bcr-abl, bcl-xl mRNA的表达并上调bax mRNA的表达有关;槐耳清膏联合羟基脲对K562细胞的抑制增殖和诱导凋亡的协同作用机制可能与两药协同下调bcl-xl mRNA的表达并上调bax mRNA的表达有关,而两药联合应用的协同作用机制并不是通过调节bcr-abl mRNA表达而实现的.     

去铁胺对K562细胞多药耐药基因MDR1及核因子κB表达的影响

目的 探讨去铁胺对柔红霉素（DNR）诱导多药耐药基因MDR1及核因子KB（NFκB）表达的影响,初步了解NFKB与MDR1表达、细胞内铁代谢的关系。方法 以DNR单用或联合应用25μmol／L去铁胺（DFO）为处理因素作用于人红白血病细胞株K562,应用RT-PCR法、流式细胞分析技术分别检测对照组、DNR组和DNR＋DFO组K562细胞MDRlmRNA和P糖蛋白（PgP）的表达情况,同时采用免疫组织化学染色法检测NFKBκB表达及活性情况。结果 与对照组相比,DNR可同时诱导MDRlmRNA、Pgp表达和NFgB活化（P〈0．05）;25μmol／LDFO联合DNR可显著抑制DNR诱导的MDRlmRNA、Pgp的表达及NFKB的活化（P〈0．05）。结论 去铁胺可减少柔红霉素诱导的MDRl、PgP表达,其机制可能与铁剥夺后降低了柔红霉索诱导的K562细胞的氧化应激反应,进而影响NFκB的活化有关。     

K562细胞诱导分化过程中早期生长反应基因mRNA表达的研究

目的 通过12-0-十四酰基咐哌醇-13-乙酸酯(TPA)诱导K562细胞分化,探讨白血病细胞早期生长反应基因(EGR-1)的表达及与细胞分化的关系。方法应用体外细胞培养技术通过细胞形态、细胞化学染色观察细胞分化的情况;用流式细胞术、逆转录-聚合酶链反应等技术检测细胞周期、纽咆表面分化抗原CD33、CD14及EGR-1 mRNA的表达。结果 TPA作用后K562细胞形态趋向成熟分化,非特异性酯酶(NSE)染色阳性,多可被氟化钠抑制;多数细胞被阻滞在G0 G1期,S期细胞减少;随处理时间的延长细胞表面抗原CD33,表达有所减少,CD14表达逐渐增多;EGR1 mRNA仅在TPA诱导K562细胞分化过程中表达。结论 TPA可诱导K562细胞向单核或巨噬细胞分化;EGR1-mRNA在TPA诱导K562细胞分化过程中才有表达,它可能参与K562细胞向单核或巨噬细胞分化的过程,并在诱导和维持细胞分化方面可能发挥重要作用。     

三氧化二砷对白血病细胞系K562和HL-60血管内皮生长因子表达的影响

目的研究三氧化二砷对白血病细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法体外培养白血病细胞株K562、HL-60,加入不同浓度的As2O3干预,用Westem bloting和荧光定量RT-PCR测定VEGF的蛋白和mRNA表达。结果K562和HL-60细胞经As2O3作用后,VEGF的蛋白表达明显减少,但VEGFmRNA拷贝数无差异。结论As2O3在蛋白水平抑制白血病细胞VEGF的表达,从而抑制骨髓血管生成,抑制白血病细胞的生长。     

Livin反义寡核苷酸对K562细胞增殖、凋亡和耐药的影响

目的 探讨Livin反义寡核苷酸(ASODN)对白血病细胞K562增殖、凋亡和耐药的影响.方法设计合成特异性的Livin硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸(MSODN),脂质体(Lip)介导转染K562细胞,实验分为Lip-ASODN组、Lip-MSODN组、Lip对照组和细胞对照组4组,采用反转录-PCR法检测Livin mRNA的表达;四甲基偶氮唑蓝法与膜联蛋白V异硫氰酸荧光素法检测Livin ASODN与K562细胞增殖、凋亡及与高三尖杉酯碱(HHT)耐药的关系.结果 Livin ASODN可显著抑制K562细胞增殖(P<0.01),且作用具有时间和浓度依赖性.终浓度为600 nmol·L-1的Lip-ASODN能明显降低Livin mRNA表达,细胞凋亡率达(36.89±1.08)% (P<0.01),而Lip-MSODN组、Lip对照组与细胞对照组之间差异均无统计学意义(Pa>0.05).Livin ASODN可增加K562细胞对HHT的耐药性,半数抑制质量浓度为(0.37±0.02)mg·L-1;与HHT及小剂量阿糖胞苷联合应用可显著抑制细胞增殖(P<0.01).结论 Livin ASODN可下调Livin基因表达,有效抑制K562细胞的增殖,增加K562细胞凋亡及其对HHT的敏感性.     

RNA干扰联合小剂量阿糖胞苷对K562细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨利用RNA干扰(RNAi)技术沉默同源盒(HOX)A10基因联合小剂量阿糖胞苷(Ara-C)对K562细胞增殖、凋亡的影响,为白血病的基因治疗提供实验依据。方法设计合成针对HOXA10的特异性短发卡RNA寡核苷酸链,构建pGPHI/GFP/Neo-HOXA10真核表达载体并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞。RNAi与小剂量Ara-C单独和联合应用后,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果成功构建pGPHI/GFP/Neo-HOXA10载体,并转染K562细胞,结果显示该载体能有效降低HOXA10 mRNA表达水平,HOXA10/β-actin灰度比值(ODR)为(38.86±4.49)%;RNAi联合小剂量Ara-C作用于K562细胞后,细胞增殖能力明显下降,细胞增殖抑制率(IR)为(75.58±8.11)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);荧光显微镜可见红色荧光凋亡细胞明显增加,凋亡率显著升高,可达(29.71±1.24)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向HOXA10的RNAi技术联合小剂量Ara-C能有效抑制K562细胞增殖,并诱导其凋亡,有望成为白血病基因治疗的新方案。     

K562细胞中Aurora A与端粒酶表达相关性

目的探讨人白血病细胞K562中Aurora A与端粒酶表达的相关性，阐明Aurora A在人白血病发生发展中的作用机制。方法用RT—PCR方法克隆得到Aurora A全长基因，采用Fugene 6转染试剂介导将其转染入K562细胞中表达，Western Blot检测细胞Aumm A和人类端粒酶反转录酶（hTERT）表达水平，端粒酶检测试剂盒Telomerase PCR ELISA检测细胞端粒酶活性，监测Aurom A表达升高的阳性细胞hTERT和端粒酶活性变化。将针对Aurora A mRNA的DNA核酶导入Aurora A高表达的K562细胞以抑制Aurom A表达，检测Aurora A表达下调后细胞hTERT和端粒酶活性变化。结果Aurora A全长基因转染K562细胞后，各阳性克隆Aurora A表达均上调，并伴hTERT及端粒酶活性增加。DNA核酶转染Aurora A高表达的K562后，能显著下调细胞Aurora A表达，hTERT和细胞端粒酶活性也同步下降。结论在人白血病中，Aurora A表达增加可引起细胞端粒酶活性的同步增加，可能是Aurora A导致白血病发生发展的重要原因。     

Zebularine对Jurkat、K562细胞p53基因表达的影响

目的了解药物zebularine对白血病细胞株Jurkat、K562细胞p53基因表达的影响,探讨其作用机制及在白血病基因治疗中的价值。方法根据zebularine作用终浓度将白血病细胞株Jurkat、K562各分为3组:对照组、250μmol/L组、500μmol/L组,分别用RT-PCR、Western-blot方法检测Jurkat、K562细胞在药物干预48 h后p53 mRNA和蛋白的表达情况。根据检测结果,探讨其作用机制及应用价值。结果在zebularine干预48 h后,在对照组和250μmol/L组均检测不到p53mRNA表达,而在500μmol/L组中检测到有p53mRNA表达,差异有显著性(P<0.05);6组细胞样品中均检测到p53蛋白表达,在500μmol/L组中表达上升,差异有显著性(P<0.05)。结论Zebularine可促进Jurkat、K562白血病细胞株p53的表达,并有一定的浓度依赖性,提示zebula-rine的干预激活了p53的表达,为zebularine治疗白血病提供了实验室依据。     

二烯丙基二硫诱导人白血病K562细胞凋亡及其对Fas、FasL及caspase-8表达的影响

目的：探讨二烯丙基二硫（DADS）诱导白血病 K562 细胞凋亡的作用及其机制。方法：采用 Hoechst 33258 染色法观察细胞凋亡形态学变化;流式细胞术分析不同浓度及不同作用时间 DADS 对 K562 细胞凋亡的诱导作用;RT-PCR法检测DADS作用48 h后 Fas、FasL、caspase-8 mRNA的表达。结果：DADS可诱导K562 细胞凋亡。DADS(作用细胞24 h)浓度从10 mg/L增至40 mg/L时,其对K562细胞的凋亡率由（11.60±0.83）%增至（37.94±0.87）%;DADS(40 mg/L浓度组)作用时间从24 h增至72 h,其对K562细胞的凋亡率由（37.94±0.87）% 增至（47.02±0.66）%,各实验组随时间、浓度增加凋亡率明显增加 (P<0.05)。DADS作用48 h后,Fas、caspase-8 mRNA 表达水平较对照组上调;FasL mRNA 较对照组下调（P＜0.05）。结论：DADS 呈时间和浓度依赖性诱导白血病K562 细胞凋亡,其凋亡机制可能与上调 Fas、caspase-8,下调 FasL有关。     

低氧对K562细胞侵袭转移的增强作用

［摘要］目的：研究低氧对白血病细胞株K562细胞侵袭能力和转移能力的影响。方法：细胞体外常规培养,用浓度为1%,3%,5%的氧分别处理细胞24 h,以常氧培养K562细胞为对照组,通过细胞黏附实验检测细胞黏附力,细胞迁移实验检测细胞运动力,肿瘤细胞体外侵袭实验检测细胞侵袭力,RT-PCR检测血管内皮生长因子（VEGF）,MMP-2,MMP-9 mRNA的表达,Western blot检测细胞HIF-1α蛋白的表达。结果：与对照组相比,3%和5%的氧均增强K562细胞黏附力、运动力和侵袭力(P<0.05或P<0.01),而且还能上调K562细胞HIF-1α蛋白,HIF-1α mRNA,VEGF mRNA,MMP9 mRNA,MMP2 mRNA的表达(P<0.05或P<0.01);而1%氧与对照组相比,以上各检测指标无明显变化(P>0.05)。结论：适度低氧能增强白血病细胞株K562细胞侵袭能力和转移能力,其机制可能是通过HIF-1α上调VEGF,MMP-2和MMP-9表达实现的。［中国当代儿科杂志,2009,11（7）：566-570］     

β-榄香烯对K562细胞周期与细胞凋亡的影响及其机制探讨

目的探讨β-榄香烯(β-ELE)对人慢性髓性白血病细胞株K562细胞周期及细胞凋亡的影响及其机制。方法K562和不同浓度的β-ELE共同培养后,应用流式细胞仪技术和Hoe-chest33258/PI荧光染色法检测β-ELE对K562细胞周期及凋亡的影响,应用RT-PCR技术测定野生型p53活化片段(P21wild-type p53 activated fregmentl,P21WAF1)、Survivin mRNA水平。结果不同浓度β-ELE能使K562细胞阻滞于G1期,G1期细胞百分比增加,S期细胞百分比明显下降,呈剂量、时间依赖性,且与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。β-ELE作用于K562细胞24h,48h后,在G0/G1期前,可见明显的亚二倍体(凋亡峰),其凋亡率呈剂量、时间依赖性,与对照组比较有显著意义(P<0.01)。Hoechest33258/PI免疫荧光技术发现β-ELE能使凋亡细胞数目明显增多(P<0.01)。RT-PCR结果显示β-ELE能下调K562细胞Survivin mRNA表达,上调P21WAF1mRNA的表达(P<0.01)。结论β-ELE能够阻止细胞K562细胞从G1期向S期转换。β-ELE可以诱导K562细胞凋亡,呈剂量、时间依赖性。β-ELE导致细胞周期阻滞可能与上调P21WAF1mRNA的表达有关;促进K562细胞凋亡机制可能与下调Survivin mRNA的表达有关。随着药物浓度的增加,P21WAF1mRNA表达增加,而SurvivinmRNA表达下降。     

survivin反义寡核苷酸对K562细胞诱导分化的研究

目的采用反义寡核苷酸技术研究survivin与白血病细胞K562分化的关系。方法实验分为反义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组、脂质体组、空白对照组,转染后48h观察细胞形态及超微结构的变化;转染后24、48h分别进行联苯胺染色、过氧化物酶染色及硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验检测细胞功能;流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD33的表达;免疫组织化学方法检测survivin蛋白水平。结果反义寡核苷酸作用后,K562细胞出现向成熟红系及粒系分化的形态学及超微结构的改变,联苯胺染色阳性率、过氧化物酶染色阳性率、NBT还原实验阳性率均高于无义寡核苷酸组、脂质体组及空白对照组(P<0.01);细胞表面分化抗原CD33的平均荧光强度在反义寡核苷酸组降低(P<0.01);反义寡核苷酸作用24h后细胞内survivin蛋白的表达水平低于空白对照组(P<0.05),但与无义寡核苷酸组、脂质体组比较差异无统计学意义(P>0.05),而48h后survivin蛋白表达水平进一步降低,与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论survivin反义寡核苷酸能诱导K562细胞向成熟红系及粒系方向分化。