六价铬暴露人支气管上皮细胞致DNA损伤相关差异表达基因筛选

目的 建立六价铬Cr（Ⅵ）暴露人支气管上皮细胞（16HBE）的基因差异表达谱,并分析其致DNA损伤修复相关差异基因表达改变,筛选该毒性作用产生过程中的关键基因,为研究六价铬毒性机制提供新的思路和理论依据。方法 采用Affymetrix 3′IVT基因芯片检测Cr（Ⅵ）急性暴露16HBE细胞诱导的差异基因表达谱,运用生物信息学方法分析差异基因的相关生物学功能;进一步用Western blot蛋白电泳技术验证差异基因的蛋白表达水平。结果 Affymetrix 3′IVT基因芯片结果显示约200个基因表达变化大于2倍以上;生物信息学分析提示差异基因主要富集在DNA损伤与修复、转录与翻译等通路;DNA损伤修复通路中,FEN1、PCNA和APX1的mRNA表达水平均呈上升趋势,其中FEN1和PCNA基因的表达量均增加了约100%,差异有统计学意义（P<0.01）;Western blot结果显示FEN1、PCNA和APX1表达水平均呈上升趋势,与基因表达变化一致,其中FEN1的表达变化差异有统计学意义（P<0.05）。结论 Cr（Ⅵ）急性暴露人支气管上皮细胞可激活DNA损伤修复信号通路,使DNA损伤修复基因FEN1表达上调,DNA损伤修复通路可能在Cr（VI）诱导16HBE细胞毒性中发挥重要作用。     

HepaCAM基因对人膀胱癌细胞增殖的抑制作用研究

目的:研究hepaCAM基因对人膀胱癌T24细胞增殖的影响.方法:运用脂质体转染方法,将pEGFP-N2-hepaCAM质粒转入T24细胞株,经G418筛选获得稳定表达的细胞株;RT-PCR及Western blot方法检测目的基因和蛋白表达;MTT法及克隆形成实验研究hepaCAM基因对T24细胞体外生长的作用;流式细胞仪检测细胞周期分布;RT-PCR技术测定周期调控蛋白CyclinD1的mRNA表达变化.结果:RT-PCR和Western blot方法分别检测到hepaCAM的基因表达和蛋白表达,MTT检测转染hepaCAM基因的细胞生长速度较对照组和空载体组明显减慢(P<0.01),克隆形成率明显小于对照组和空载体组(P<0.01).细胞周期中G0/G1期比例明显增高(P<0.05),而S期比例减少;CyclinD1 mRNA表达明显下调(P<0.05).结论:HepaCAM基因通过阻滞细胞于G0/G1期,减少CyclinD1 mRNA表达,抑制T24细胞的增殖.     

腺病毒介导的hepaCAM基因对膀胱癌细胞周期的影响

目的：以腺病毒为载体,研究hepaCAM基因对膀胱癌细胞T24和BIU-87的细胞周期影响。方法：以带有hepaCAM基因的腺病毒载体pAdH5-hepaCAM感染两株细胞,采用RT-QPCR和Western-blot、细胞免疫荧光方法检测感染pAdH5-hepaCAM组,pAdH5空载组和未感染组的hepaCAM mRNA 、蛋白的表达及其细胞定位。并采用流式细胞术检测hepaCAM对两株细胞周期影响,Western-blot方法检测细胞周期蛋白cyclinD1。结果：感染hepaCAM的T24和BIU-87细胞,hepaCAM mRNA和蛋白水平明显升高。流式结果显示hepaCAM阻滞T24与BIU-87细胞于G0/G1期。Western-blot检测实验组cyclinD1明显低于空载和空白组。细胞免疫荧光显示hepaCAM在单个细胞中主要表达于细胞浆中,在细胞之间表达于细胞连接处。结论：hepaCAM能阻滞膀胱癌细胞T24和BIU-87于G0/G1期,并使G1期关键周期蛋白cyclinD1下调。     

阿霉素诱导肝细胞黏附分子基因下调肾癌细胞细胞分裂周期基因2的表达

目的:研究阿霉素联合hepaCAM基因对肾癌细胞786-0生物学的影响。方法：阿霉素处理后,用腺病毒向肾癌786-0导入肝细胞黏附分子（Hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM）,以噻唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）测抑制率,流式细胞术（Flow cytometer,FCM）测细胞周期,实时荧光定量聚合酶链反应（Real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）、Western blot检测hepaCAM和细胞分裂周期基因2（Cell division cycle 2,cdc2）的mRNA及蛋白水平。结果：MTT显示：与对照组相比,实验组抑制率显著升高（P＜0.01）。FCM证实：实验组出现明显G2/M期阻滞。RT-qPCR及Western blot检测到实验组cdc2 mRNA及蛋白水平显著下调（P＜0.01）。结论：阿霉素处理后,导入hepaCAM基因,可引起细胞抑制率显著升高及G2/M期阻滞,这可能与阿霉素诱导hepaCAM下调cdc2的表达有关。     

60Co-γ照射后早期小鼠肝组织基因表达谱

目的:以基因芯片技术研究辐射后小鼠肝脏的基因表达谱,从分子水平探讨辐射引起小鼠肝脏损伤的机制.方法:采用小鼠基因表达谱芯片(4096个基因)对60Co-γ照射后48 h小鼠肝组织基因表达谱进行研究.RT-PCR验证基因芯片结果.结果:与正常小鼠相比,辐射后小鼠肝组织有124条基因差异表达,78条下调,46条上调.其中57条基因的功能已知,这些差异表达的基因按功能可分为6类:DNA修复和应激蛋白,细胞骨架,离子通道和转运蛋白,信号转导,免疫蛋白,代谢调控,其中下调基因主要为细胞骨架基因,而上调基因主要为细胞周期调控蛋白和转录因子.RT-PCR结果表明,Hspa5、Rasa3、Nqol基因的表达和芯片结果一致.结论:辐射造成的肝损伤具有多靶点、多层次及多通路的特点.     

5-氮杂胞嘧啶核苷联合hepaCAM腺病毒通过抑制p-AKT诱导膀胱癌细胞T24凋亡

目的：研究5-氮杂胞嘧啶核苷（5-azacytidine,azac）联合肝细胞黏附分子（hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM）腺病毒对膀胱癌细胞T24凋亡的影响及可能机制的探讨。方法：7种不同因素分别处理培养的膀胱癌细胞T24,hoechst 33258染色检测各处理组细胞凋亡率,流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞早期凋亡率,RT-PCR检测hepaCAM及B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2,bcl-2）mRNA的表达,Western blot检测hepaCAM、p-AKT、total-AKT、bcl-2蛋白的表达。结果：hoechst 33258显示,azac联合hepaCAM腺病毒组细胞凋亡率为（45.21±0.06）%,明显高于hepaCAM腺病毒组（15.6０±0.02）%和azac组（26.30±0.02）%,差异有统计学意义（P=0.003,P=0.008）;FCM显示,azac联合hepaCAM腺病毒组细胞早期凋亡率为（16.05±0.06）%,明显高于hepaCAM腺病毒组（3.90±0.02）%和azac组（9.67±0.02）%,差异有统计学意义（P=0.002,P=0.043）;RT-PCR显示,与单独hepaCAM腺病毒组和azac组相比,azac与hepaCAM腺病毒联用可以上调hepaCAM mRNA的表达（P=0.004,P=0.000）,下调bcl-2 mRNA的表达,差异有统计学意义（P=0.026,P=0.030）;Western blot显示,与单独hepaCAM腺病毒组和azac组相比,azac联合hepaCAM腺病毒组可上调hepaCAM蛋白的表达（P=0.003,P=0.003）,同时下调p-AKT（P=0.001,P=0.005）和bcl-2（P=0.000,P=0.002）蛋白的表达,差异有统计学意义。结论：azac联合hepaCAM腺病毒可能通过抑制p-AKT的磷酸化水平加速诱导T24细胞凋亡,可为膀胱癌的治疗提供新的思路。     

60Co-γ照射后早期小鼠肝组织基因表达谱

目的：以基因芯片技术研究辐射后小鼠肝脏的基因表达谱，从分子水平探讨辐射引起小鼠肝脏损伤的机制。方法：采用小鼠基因表达谱芯片（4096个基因）对^60Co-γ照射后48h小鼠肝组织基因表达谱进行研究。RT-PCR验证基因芯片结果。结杲：与正常小鼠相比，辐射后小鼠肝组织有124条基因差异表达，78条下调，46条上调。其中57条基因的功能已知，这些差异表达的基因按功能可分为6类：DNA修复和应激蛋白，细胞骨架，离子通道和转运蛋白，信号转导，免疫蛋白，代谢调控，其中下调基因主要为细胞骨架基因，而上调基因主要为细胞周期调控蛋白和转录因子。RT-PCR结果表明，Hspa5、Rasa3、Nqol基因的表达和芯片结果一致。结论：辐射造成的肝损伤具有多靶点、多层次及多通路的特点。     

HepaCAM蛋白通过exosomes途径分泌到细胞外并抑制肿瘤细胞增殖

目的探讨肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)在肾癌786-0细胞中通过exo-somes途径分泌到细胞外及是否可以抑制肿瘤细胞增殖。方法将携带hepaCAM基因的重组腺病毒质粒瞬时转染786-0细胞,Western blot鉴定hepaCAM基因在786-0中的表达;莫能星(monensin)和二甲基阿米洛利(DMA)处理转染后肿瘤细胞,检测肿瘤细胞上清液及exosomes中hepaCAM蛋白的量的变化。MTT法检测hepaCAM蛋白是否可以抑制肿瘤细胞增殖。结果成功构建并转染hepaCAM重组腺病毒质粒,在肿瘤细胞上清液中检测到hepaCAM蛋白的分泌,经药物处理后,莫能星明显增加了转染后肿瘤细胞的hepaCAM蛋白的分泌量,而二甲基阿米洛利处理转染后肿瘤细胞,能显著抑制细胞上清液中hepaCAM的分泌量。Western blot进一步证明hepaCAM蛋白存在于exosomes上。成功转染hepaCAM基因的肾癌细胞分泌的exosomes明显抑制了肿瘤细胞增殖。结论 hepaCAM蛋白可能通过exosomes途径分泌到肿瘤细胞外并抑制肿瘤细胞增殖。     

双调控溶瘤腺病毒携带SEA基因靶向鼠膀胱癌的表达

目的:研究hTERT和HIF启动子双调控的溶瘤腺病毒能否感染鼠膀胱癌细胞并表达治疗基因,为动物实验提供依据.方法:以不同浓度溶瘤腺病毒感染鼠膀胱癌细胞,生物倒置显微镜下动态观察细胞形态变化,RT-PCR检测SEA在细胞内mRNA表达,Western blot检测SEA蛋白表达.结果:镜下可见细胞感染腺病毒并最终裂解,RT-PCR和Western blot分别检测到实验组mRNA和蛋白的表达.结论:携带SEA基因的hTERT/HIF双调控溶瘤腺病毒可在鼠膀胱癌细胞内复制增殖并表达SEA基因,可用于治疗鼠膀胱癌的动物实验研究.     

HepaCAM secreted by renal cell carcinoma 786-0 cells through exosomes pathway inhibits cell proliferation

目的 探讨肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)在肾癌786-0细胞中通过exosomes途径分泌到细胞外及是否可以抑制肿瘤细胞增殖.方法 将携带hepaCAM基因的重组腺病毒质粒瞬时转染786-0细胞,Western blot鉴定hepaCAM基因在786-0中的表达;莫能星(monensin)和二甲基阿米洛利(DMA)处理转染后肿瘤细胞,检测肿瘤细胞上清液及exosomes中hepaCAM蛋白的量的变化.MTT法检测hepaCAM蛋白是否可以抑制肿瘤细胞增殖.结果 成功构建并转染hepaCAM重组腺病毒质粒,在肿瘤细胞上清液中检测到hepaCAM蛋白的分泌,经药物处理后,莫能星明显增加了转染后肿瘤细胞的hepaCAM蛋白的分泌量,而二甲基阿米洛利处理转染后肿瘤细胞,能显著抑制细胞上清液中hepaCAM的分泌量.Western blot进一步证明hepaCAM蛋白存在于exosomes上.成功转染hepaCAM基因的肾癌细胞分泌的exosomes明显抑制了肿瘤细胞增殖.结论 hepaCAM蛋白可能通过exosomes途径分泌到肿瘤细胞外并抑制肿瘤细胞增殖.     

肝细胞黏附分子基因在膀胱移行细胞癌中的表达

目的研究编码人类免疫球蛋白类细胞黏附分子的肝细胞黏附分子(hepaCAM)基因的表达与膀胱移行细胞癌(TCCB)生物学行为之间的关系。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测在28例正常膀胱黏膜组织、34例TCCB组织及2株TCCB癌细胞株中hepaCAM基因的表达情况,并对TCCB患者hepaCAM基因的表达情况与其临床病理学指标进行分析。结果hepaCAM在正常膀胱黏膜组织标本中的表达均一,82.4%的TCCB组织中表达降低,17.6%的TCCB组织中表达缺失,2株TCCB T24细胞株和B IU-87细胞株中hepaCAM表达完全缺失,TCCB组织中hepa-CAM基因表达半定量值低于正常膀胱黏膜组织(P<0.05)。hepaCAM基因表达与TCCB的病理学分级有关(P<0.05),与临床分期、性别及是否复发无明显相关(P>0.05)。结论TCCB组织中hepaCAM表达降低与其临床病理分级相关,提示其可能与TCCB的恶性改变有关。     

携带hHCN4基因重组腺病毒载体体外转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建重组腺病毒载体Ad-hHCN4-IRES/eGFP在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）,检测目的基因在BMSCs中mRNA和蛋白水平是否有表达。方法采用贴壁培养法分离纯化大鼠BMSCs;将携带hHCN4基因的重组腺病毒转染大鼠BMSCs,用荧光显微镜观察转染后BMSCs绿色荧光蛋白的表达,用RT-PCR和Western Blot法检测转染后hHCN4基因mRNA和蛋白水平的表达情况。结果 BMSCs成功贴壁分离传代。转染目的基因24 h后荧光显微镜下即观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测到有hHCN4 mRNA的表达,Western blot法检测到有其蛋白水平的表达。结论重组腺病毒载体转染的BMSCs能够表达hHCN4基因。     

11例人膀胱移行细胞癌基因表达谱变化的临床分析

目的探讨人膀胱移行细胞癌基因表达谱的变化.方法使用人肿瘤基因表达谱芯片检测11例膀胱移行细胞癌组织及其膀胱黏膜组织基因表达谱的差异.结果以膀胱黏膜组织为对照,11例膀胱肿瘤组织中有87条基因表达明显下调,102条基因表达明显上调.结论膀胱肿瘤与膀胱黏膜组织之间存在大量差异表达的基因,说明膀胱肿瘤的发生与发展是多种肿瘤相关基因表达失常或肿瘤抑制基因失活所致.     

heparanase通过调控EMT促进人膀胱移行细胞癌细胞T24迁移及侵袭的作用研究

目的 探讨乙酰肝素酶（heparanase）是否通过上皮-间充质转化（EMT）影响膀胱移行细胞癌细胞的侵袭及迁移能力.方法 利用荧光定量PCR来检测人膀胱移行细胞癌细胞T24、EJ、MGH-U1以及BIU-87中heparanase的表达水平;设计并合成靶向heparanase的特异性shRNA,通过脂质体转染法转染heparanase表达最高的膀胱移行细胞癌细胞T24以构建稳定低表达heparanase细胞株,通过Western blot法检测和定量PCR来验证shRNA的干扰效率;通过transwell法检测干扰后细胞的迁移及侵袭能力,Western blot法检测EMT相关指标E-cadherin和N-cadherin以及其上游信号分子Snail和WNT-5a的变化.结果 heparanase-shRNA转染后,能够有效抑制T24细胞中heparanase的表达;Transwell法结果显示,heparanase干扰组细胞侵袭及迁移能力显著低于阴性对照组（P ＜0.001）.Western blot法检测结果发现,heparanase干扰组细胞的E-cadherin表达增加,N-cadherin的表达降低;此外,heparanase干扰组细胞的Snail以及WNT-5a表达较对照组显著下降.结论 运用RNA干扰技术能够有效沉默T24细胞的heparanase基因,并诱导其迁移侵袭能力的下降,其可能的机制是通过调节EMT的上游信号分子Snail、WNT-5a的表达来调控EMT,从而影响膀胱移行细胞癌细胞的迁移及侵袭.提示heparanases可能在膀胱移行癌T24细胞的发生发展中起重要作用,抑制heparanase的表达可能成为一种治疗膀胱移行细胞癌的新方法.     

奥美拉唑对人脐静脉内皮细胞全基因表达谱的影响及机制分析

目的研究奥美拉唑对体外培养人脐静脉内皮细胞(EA.hy926)基因表达谱的影响,探讨奥美拉唑对内皮细胞作用的分子机制。方法 10-5mol/L奥美拉唑与人脐静脉内皮细胞株共培养48 h,运用Affymetrix U133 plus 2.0全基因组表达芯片,检测奥美拉唑对人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响,分子注释系统MAS3.0软件进行聚类分析。RT-PCR验证基因表达谱结果,Western blotting验证相关蛋白水平的变化。结果奥美拉唑作用内皮细胞48 h后,基因芯片分析筛选出差异表达大于1.5倍的基因282个,其中上调基因236个,下调基因46个,包括转录调节、炎症反应、免疫反应、细胞粘附、抗凋亡、信号转导等相关基因,RT-PCR和Western blotting结果与基因芯片结果一致。结论奥美拉唑在基因水平通过多条通路调节内皮功能。     

奥美拉唑对人脐静脉内皮细胞全基因表达谱影响及生物信息学分析

研究奥美拉唑对体外培养人脐静脉内皮细胞（EA.hy926）基因表达谱的影响,初步探讨奥美拉唑对内皮细胞作用的分子机制。 方法 10-5mol/L奥美拉唑与人脐静脉内皮细胞株共培养48 h,运用Affymetrix U133 plus 2.0全基因组表达芯片,检测奥美拉唑对人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响,分子注释系统MAS3.0软件进行聚类分析。RT-PCR验证基因表达谱结果,Western blotting验证相关蛋白水平的变化。结果奥美拉唑作用内皮细胞48 h后,基因芯片分析筛选出差异表达大于1.5倍的基因282个,其中上调基因236个,下调基因46个,包括转录调节、炎症反应、免疫反应、细胞粘附、抗凋亡、信号转导等相关基因,RT-PCR和Western blotting结果与基因芯片结果一致。结论奥美拉唑在基因水平通过多条通路调节内皮功能。     

hepaCAM与藏花素联合应用对前列腺癌细胞增殖的影响

目的：研究肝细胞黏附分子（hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM）与藏花素联用对前列腺癌（prostate cancer,PCa）细胞DU145增殖的影响。方法：四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT）法检测细胞增殖效应;克隆形成实验检测细胞克隆形成率;实时荧光定量PCR、Western blot法检测细胞周期调节因子cyclinD1及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表达变化。结果：hepaCAM过表达腺病毒与藏花素单独使用均能抑制PCa细胞DU145的增殖[48 h抑制率分别为（12.0±2.0）%,（22.0±1.0）%],但两者联用比单独应用效果更加明显[48 h抑制率为（54.0±1.0）%,P=0.000]。Real-time PCR结果显示,hepaCAM过表达腺病毒及藏花素联合作用与藏花素单独使用相比,cyclinD1 mRNA表达下调（P=0.048）;两者联合应用与hepaCAM过表达腺病毒或藏花素单独使用相比,PCNA mRNA水平下调（P=0.047,P=0.006）。Western blot结果显示,与单独使用hepaCAM过表达腺病毒或藏花素相比,两者联用组cyclinD1蛋白表达明显降低（P=0.002,P=0.002）,同时PCNA蛋白表达也降低（P=0.000,P=0.003）。结论：hepaCAM基因过表达腺病毒与藏花素联用对PCa DU145细胞增殖的抑制有明显的协同作用,作用机制与下调cyclinD1和PCNA的表达有关。     

染色质重构复合体蛋白PBRM1对膀胱癌细胞生物学功能的影响

目的探讨染色质重构复合体蛋白PBRM1对膀胱癌细胞株EJ、T24细胞生物学功能的影响。方法针对PBRM1 mRNA序列设计合成siRNA,转染膀胱癌细胞,沉默PBRM1基因后进行如下检测：RT-PCR法检测PBRM1 mRNA表达变化及凋亡、迁移相关指标;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western印迹法检测凋亡蛋白Caspase3表达水平;划痕实验及Matrigel实验检测细胞迁移及侵袭能力变化。结果 PBRM1siRNA能有效抑制膀胱癌细胞中PBRM1的表达。PBRM1基因沉默后,与空白对照组相比,细胞增殖能力显著增强,同时细胞凋亡减少,细胞迁移及侵袭能力明显减弱。凋亡及迁移相关基因mRNA水平及蛋白水平也出现相应变化。结论 PBRM1对膀胱癌细胞株EJ、T24生物学功能有重要影响,可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡、迁移及侵袭。     

野生型p53,GM-CSF和B7-1基因转移对卵巢癌细胞系SKOV-3增生的影响

目的研究人野生型p53、GM-CSF和协同刺激因子B7-1基因共转染对卵巢癌细胞增生的影响。方法以携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体转染卵巢癌细胞系SKOV-3,荧光显微镜观察,流式细胞计数计算转染效率;以携带野生型p53、GM-CSF和B7-1基因的腺病毒转染SKOV-3细胞,RT-PCR检测目的基因表达,观察转染前后细胞形态的变化,绘制细胞生长曲线。结果当腺病毒的感染强度达到400 pfu/细胞时,转染率可达到81%;以携带目的基因的腺病毒转染SKOV-3细胞,能检测到相应基因表达;转染后SKOV-3细胞形态发生改变,增生减缓。结论腺病毒载体能介导目的基因转入卵巢癌细胞,并有效表达;人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因共转染能减缓卵巢癌细胞的增生。