扬州地方株HPV16 E7基因的克隆及序列分析

目的：了解扬州地区HPV16 E7基因结构特点。方法：从感染HPV16的宫颈癌组织中提取DNA，用PCR技术获得HPV16 E7基因，以pGEM—Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM—T—E7，进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析。结果：扬州地方株HPV16 E7基因与已报道的标准株(德国)仅在核苷酸序列上有一处突变，即199位的T→C，密码子由T1G变为C3G，而氨基酸序列未发生改变；与其他国家报道的HPV16 E7核苷酸序列也存在一定差异，但同源性均在98．7％以上。结论：扬州地方株HPV16 E7基因的成功克隆，将丰富我国HPV16感染的流行病学资料，为HPV疫苗研制奠定基础。     

HPV16 E6E7疫苗的构建及其免疫学活性实验研究

目的:评价从宫颈癌组织感染的人乳头瘤病毒中构建的HPV16 E6E7疫苗的免疫活性.方法:以宫颈癌组织DNA为模板,运用 PCR方法扩增HPV16 E6E7 DNA片段,将其插入真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA-E6E7基因疫苗株.酶切电泳验证重组质粒.将重组pcDNA-E6E7质粒肌注免疫BaLB/c小鼠后IFA法检测其体液免疫反应,ELISA法检测其细胞免疫功能.结果:pcDNA-E6E7疫苗经肌注方式免疫BaLB/c小鼠,可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应.结论:构建的pcDNA-E6E7基因疫苗株能诱导小鼠的免疫反应.     

北京地区人乳头瘤病毒16E6E7基因变异和序列分析

目的 了解北京地区人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7结构特点，为研制HPV16疫苗奠定基础。方法 从HPV感染组织中提取DNA，PCR鉴别其型别，从单独HPV16感染的标本中分离HPV16 E6E7基因，克隆入载体pGEM-3ZF，进行双向测序，与德同标准株进行比较。结果 构建了北京地区HPV16E6E7的重组质粒。测序结果表明该基因全长为776bp，与已发表的德同标准株长度相等，3处核苷酸发生变异，同源性99．7％。分别位于第60、96和565nt(相当于HPV16全长序列中第142、178和647nt)，2处位于F6区，1处位于E7，其对应氨基酸分别为第20、32和188个氨基酸，分别由Pro(CCA)、Asp(GAT)和Asn(AAT）变异为Pro(CCG)、Glu(GAG)和Ser(AGT)。结论 北京地区HPV16E6E7基因结构与德国标准株存在差异。     

人乳头瘤病毒11型早期蛋白E6和E7基因的克隆及序列分析

目的：从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒11型(HPV11)早期蛋白E6、E7基因，并进行序列测定及编码氨基酸序列分析，为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法：用PCR法，从CA标本中扩增出HPV11E6、E7基因，与载体pGEX-6P-1连接成重组质粒pGEX-6P-1／E6、pGEX-6P-1／E7，酶切鉴定及双脱氧法测序观察其变异状况。结果：克隆出HPV 11早期蛋白E6、E7基因，成功构建重组质粒pGEX-6P-1／E6、pGEX-6P-1／E7。本研究克隆出的HPV11 E7基因与GenBank标准株序列完全相同，E6基因有两个位点的变化。结论：本研究克隆出的HPV11 E6、E7基因与标准株基本相同，这将为进一步研究E6、E7基因的表达、免疫活性及流行病学奠定基础。     

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E6、人乳头瘤病毒16型E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T细胞浸润的相关性分析

目的 探究宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T(Treg)细胞浸润的相关性及临床意义。方法 选取成都医学院第一附属医院2018年1月至2020年1月84例行手术治疗的宫颈癌患者的癌组织作为宫颈癌组,选取同一医院同期手术治疗的42例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者的宫颈组织作为CIN组,另选取42例因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者的正常宫颈组织作为正常组。对比分析三组组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量、Treg细胞浸润的情况。结果 宫颈癌组HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量、Treg细胞占CD4⁺T细胞比例均高于CIN组、正常组,CIN组上述指标均高于正常组(P<0.05);宫颈癌组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量与Treg细胞占CD4⁺T细胞比例呈正相关(P<0.05);HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量、Treg细胞占CD4⁺...     

HPV18 E7基因的原核表达及其在宫颈癌患者血清抗体中的检测

目的研究人类乳头瘤病毒18型E7全长基因(HPV18 E7)在原核表达系统中的表达,及其作为特异性抗原在宫颈癌血清抗体检测中的意义,为HPV感染与肿瘤相关的血清学诊断研究奠定基础。方法PCR法扩增HPV18 E7全长基因,构建重组质粒pET32a(+)/HPV18 E7,转化表达HPV18 E7融合蛋白后经纯化、SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。再以该融合蛋白作为诊断抗原,间接ELISA法检测宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照三组血清特异性IgG抗体水平。结果HPV18 E7融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的35.00%;宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照组的血清特异性抗体均值分别为0.604±0.328,0.287±0.202和0.342±0.225,三组间差异有显著性意义(F=32.771,P<0.01);宫颈癌组与尖锐湿疣组及健康对照组的HPV18E7均值比较,差异均有显著性意义(P均<0.01),而尖锐湿疣组与健康对照组抗体均值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论HPV18 E7融合蛋白具较强的抗原性,对宫颈癌诊断试剂的研究具有应用价值。     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因的克隆和表达

目的 从尖锐湿疣皮损标本中扩增出人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因．并进行表达、纯化和鉴定。方法用PCR法，从尖锐湿疣标本中扩增出HPV11E7蛋白基因，与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1／E7；重组质粒转入BL21大肠杆菌，经诱导表达融合蛋白GST-E7；该蛋白经剪刀酶切除GST，Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测鉴定。结果经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX-6P-1／E7成功构建．诱导后高表达GST-E7融合蛋白并得到纯化，蛋白质印迹证实表达蛋白为E7蛋白。结论获得高表达、高纯度的HPV11 E7蛋白，为该蛋白的功能及免疫学分析及尖锐湿疣疫苗研究打下了基础。     

人乳头状瘤病毒16 E6/E7基因稳定表达的永生化角质形成细胞的建立及鉴定

【摘要】 目的 构建人乳头状瘤病毒（HPV）16 E6/E7基因稳定表达的人永生化角质形成细胞（KC），为研究HPV16 E6/E7诱导的细胞永生化及恶性转化机制提供细胞模型。方法 两步消化法分离培养原代人包皮角质形成细胞（HFK），利用慢病毒感染技术对细胞稳定转染HPV16 E6/E7基因，连续培养30代以上，筛选出永生化KC，分为3组：①空白对照组：传代2次的原代HFK；②实验组：传代2次的原代HFK感染LV5-HPV16 E6/E7，感染细胞记录为A0代，感染后以传代次数记录（A1、A2……）；③阳性对照组：HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹实验分别检测空白对照组、实验组、阳性对照组HPV16 E6/E7 mRNA、蛋白及CK14蛋白的表达，CCK-8及Transwell Insert方法检测细胞的增殖及侵袭能力。裸鼠致瘤实验检测实验组A30、阳性对照组SiHa细胞的致瘤能力。结果 成功分离原代HFK。LV5-HPV16 E6/E7重组质粒感染原代HFK后，空白对照组细胞无荧光表达，连续传代后出现衰老表现，实验组A30细胞体积、形态较原代HFK无明显变化，且荧光表达率为100%。与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高（t值分别为7.12、8.07、6.53、5.66；P值分别 < 0.001、 < 0.001、 = 0.001、 = 0.005）；与空白对照组相比，实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E7 mRNA表达水平也显著升高（t值分别为3.20、4.29、3.75、4.22；P值分别为0.024、0.008、0.013、0.014）。空白对照组未见HPV16 E6/E7蛋白的表达，而A30及SiHa细胞可见HPV16 E6/E7蛋白的表达。CCK-8实验显示，实验组A10、A20、A30细胞增殖水平显著高于空白对照组（t值分别为6.49、7.55、9.43；P值分别为0.003、0.002、0.001），而A1的增殖水平与空白对照组比较，差异无统计学意义（t = 2.40，P = 0.074）。Transwell Insert侵袭实验显示，A30不能穿过基底膜，SiHa细胞可穿过基底膜被染成蓝色。裸鼠接种A30细胞2个月后无肉眼可见肿瘤，组织学亦显示无肿瘤形成，裸鼠接种SiHa细胞后可于皮下形成肿瘤。结论 通过采用慢病毒技术转染HPV16 E6/E7基因成功建立人永生化角质形成细胞，可作为HPV相关研究中的理想细胞模型。     

人乳头瘤病毒11型E6的原核表达

目的　构建、克隆人乳头瘤病毒 11型 (HPV11)E6蛋白基因 ,并进行表达、纯化和鉴定。方法　用PCR法 ,从尖锐湿疣 (CA)标本中扩增出HPV 11型E6蛋白基因 ,与 pET3 2a载体连接成重组表达质粒pET3 2a/E6;重组质粒转入BL2 1大肠杆菌 ,经诱导表达硫氧还蛋白E6融合蛋白 (Trx E6) ;该蛋白经 3SNTAResin纯化柱纯化 ,SDS PAGE和WesternBlotting检测鉴定。 结果　经酶切及序列分析鉴定 ,重组质粒 pET3 2a/E6成功构建 ,诱导后高表达Trx E6融合蛋白 ,WesternBlotting鉴定证实表达蛋白分子量为 3 60 0 0D的Trx E6融合蛋白。结论　获得高表达、高纯度的HPV11E6蛋白 ,为该蛋白的功能及免疫学分析及CA的疫苗研究打下了基础。     

慢病毒介导的靶向沉默HPV16E7-shRNA对SiHa细胞DNA甲基转移酶表达的影响

目的 探讨慢病毒携带的靶向人乳头瘤病毒16(HPV16)E7基因的短发夹干扰RNA(shRNA)对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞中4种甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L)表达水平的影响.方法 构建HPV16 E7基因靶序列的shRNA重组质粒,用BLOCK-iTTM Lentiviral RNAi Expression System试剂盒进行慢病毒包装,分别转染293T细胞48、72 h后收集病毒上清液.分别用含靶向HPV 16 E7-shRNA重组质粒的病毒上清液与完全培养基(1∶1)的混合液(shRNA组)、含空白质粒(即不含靶向HPV16 E7-shRNA序列)的病毒上清液与完全培养基(1∶1)的混合液(阴性对照组)、完全培养基(空白对照组)培养SiHa细胞.感染0、48、96 h后,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测3组SiHa细胞中HPV16 E7和4种甲基转移酶mRNA的表达,Western印迹检测4种甲基转移酶的蛋白表达.结果 感染0h时,shRNA组、阴性对照组、空白对照组SiHa细胞HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(均P＞0.05);感染48、96 h时,3组细胞间HPV16 E7和4种DNMT mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(均P＜0.05).shRNA组HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L mRNA表达水平在48 h时的沉默效率分别为71.13％、50.53％、13.72％、46.27％和17.92％,96 h时分别为83.50％、74.2％、47.8％、64.7％和48.9％;而阴性对照组和空白对照组各时间点表达水平差异无统计学意义(均P＞0.05).慢病毒感染48、96 h时,3组细胞间上述4种DNMT蛋白表达量差异有统计学意义(均P＜0.01).shRNA组4种DNMT蛋白表达水平随感染时间的延长而逐渐下降,感染48 h时DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L蛋白表达抑制率分别为84％、37.2％、59.8％、49.3％,96 h时分别为73.1％、68.7％,55.5％、65.5％.结论 靶向沉默HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞E7基因能够干扰DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA及蛋白的表达.     

Prevalence of HPV 16 genomic variant carrying a 63 bp duplicated sequence within the E1 gene in Slovenian women

High-risk HPV, particularly HPV-16, is etiologically associated with the development of cervical cancer and its precursor lesions - cervical intraepithelial neoplasia (CIN). However, most precancerous lesions will not progress to cancer. Numerous studies have shown that HPV-16 consists of several genomic variants, which differ in their association with cervical cancer, viral persistence and the frequency of recurrence of cervical disease. Recently, a novel, presumably less pathogenic, HPV-16 E6-T350G genomic variant has been identified, carrying a 63-bp in-frame insertion in the E1 gene. No data from Slovenian patients have so far been reported for this specific HPV-16 variant. In the present study, therefore, a total of 390 HPV-16 positive samples obtained from the same number of women with normal cytology, CIN I, CIN II, CIN III or cervical cancer, were analyzed. The HPV-16 E1 insert variant was detected using real-time PCR-amplification of a 146-210-bp fragment of the E1 gene and PCR-sequencing of a 169-bp fragment of the E6 gene. The HPV-16 E1 insert variant was identified in 7/48 (14.6%), 1/21 (4.8%), 2/20 (10.0%), 9/131 (6.9%) and 12/170 (7.1%) of women with normal cytology, CIN I, CIN II, CIN III and cervical cancer, respectively. All HPV-16 E1 insert variants with an amplifiable E6 gene belonged to the European HPV-16 E6-350G variant group. No statistically significant differences in the prevalence of HPV-16 E1 insert genomic variant in women presenting with normal cytology and those with the different stages of HPV-16-induced disease were found.     

山东省女性HPV6/11和HPV16/18感染情况分析

目的:对山东省女性人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6/11和HPV16/18感染的检测结果进行回顾分析,以了解山东省各年龄段、各地区女性HPV的感染状况。方法:采用实时荧光定量PCR技术,对2012年1月至2016年6月间济南金域医学检验中心收集的3995例和7508例样本,分别进行HPV6/11或HPV16/18检测,并对检测结果进行回顾分析。结果:HPV6/11检测的阳性率为27.2%(1085/3995),明显高于HPV16/18检测的5.1%(384/7508)。两种HPV检测的阳性率呈现不对称双峰分布,均以20岁组阳性率最高,分别为35.5%和21.7%。随后HPV6/11和HPV16/18的阳性率随年龄增长而逐渐下降,后HPV6/11的阳性率又逐渐升高至51~60岁组的34.3%和60岁组的43.8%;HPV16/18检测的阳性率在60岁组也略有上升,为3.4%。各地区中鲁中(31.6%)和鲁西(30.6%)HPV6/11的阳性率要高于鲁东(22.1%)和鲁北(21.7%);HPV16/18的检出率以鲁中(16.3%)最高,而鲁东最低(4.1%)。结论:本研究结果反映了山东省女性HPV6/11、HPV16/18感染的最新分布状况,对掌握山东省女性HPV感染的流行病学特征,为子宫颈癌筛查和HPV疫苗的接种提供科学依据。     

人乳头瘤病毒18型E6E7反义RNA表达重组体的构建

目的　为了探讨人乳头瘤病毒 (HPV)的致病机理和寻找由HPV所致疾病的治疗途径 ,研究了HPV1 8型E6E7反义RNA表达重组体的构建。方法　以HPV1 8型全基因质粒为模板 ,聚合酶链反应扩增出HPV 1 8型E6E7区 81 6bp片段 ,以逆转录病毒pLNSX为载体 ,构建HPV 1 8型E6E7逆转录病毒重组体 ,并以限制性内切酶酶切和Southern杂交分别鉴定插入方向和特异性检测。结果和结论　筛选出可表达HPV1 8型E6E7逆转录病毒重组体。该反义RNA表达重组体的构建为进一步研究E6E7基因的作用 ,以及探索是否能通过反义技术调控E6E7基因的表达打下基础。     

HPV16型E7抗原B细胞表位的预测与鉴定

目的分析人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期蛋白E7的B细胞优势表位,并对其进行免疫原性鉴定。方法采用亲水性方案、柔韧性方案、抗原指数方案及表面可能性方案综合评估其B细胞优势表位,并运用固相合成法合成多肽,经RP-HPLC纯化及纯度分析,用质谱进行定性鉴定。以合成肽免疫Balb/c小鼠,进行免疫效果评价。结果综合分析考虑HPV16 E714-21(P1),HPV16 E726-37(P2),HPV16 E744-51(P3)可能是B细胞优势表位,免疫小鼠后可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高,但只有P1和P2产生的抗体与人宫颈癌组织上清液结合呈阳性反应。结论HPV16 E714-21和HPV16 E726-37具有较强的免疫原性,可能成为HPV感染肽疫苗的候选表位。