尾加压素Ⅱ对人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮和前列环素的影响

目的:观察不同浓度的尾加压素Ⅱ对人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮、前列环素,以及对一氧化氮合酶活性的影响,进而探讨尾加压素Ⅱ舒张血管的机制。方法:实验于2005-04/08在武汉大学人民医院老年病科实验室完成。根据所加入尾加压素Ⅱ的浓度不同(10-9～10-7mol/L),将体外培养的人脐静脉内皮细胞随机分为4组:空白对照组、10-9mol/L组、10-8mol/L组及10-7mol/L组。干预24h后,用化学比色法检测细胞培养上清液中NO2-,NO3-的水平及一氧化氮合酶的活性,用放射免疫法检测碘[125Ⅰ]-6-酮前列腺素F1α的水平。结果:①一氧化氮水平:后三组与空白对照组相比,NO2-,NO3-的含量呈浓度依赖性增加,其中10-7mol/L浓度组显著高于空白对照组(21.37±2.21,16.51±1.33,P<0.01)。②一氧化氮合酶活性:后三组与空白对照组相比,一氧化氮合酶呈浓度依赖性增加,其中10-7mol/L浓度组显著强于空白对照组(70.65±15.63,36.62±11.16,P<0.01)。③前列环素水平:后三组与空白对照组相比,6-酮前列腺素F1α含量呈浓度依赖性增加,其中10-7mol/L浓度组显著高于空白对照组(572.69±1.86,563.93±2.66,P<0.01)。结论:尾加压素Ⅱ能刺激人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮及前列环素,提示尾加压素Ⅱ可能通过刺激一氧化氮和前列环素的产生而发挥舒张血管的作用。     

睾酮浓度与人脐静脉组织因子途径抑制物的表达

目的：观察生理及超生理浓度睾酮对人脐静脉内皮细胞合成、分泌组织因子途径抑制物的影响。方法：实验于2005-01／06在汕头大学医学院药理实验室完成。将人原代脐静脉内皮细胞复苏后于37℃，体积分数为0．05的CO2培养箱中静置培养，所用细胞为两三代。将消化好的细胞移人96孔板，接种密度为1&;#215;10^8每孔100μL。24h后分为不同浓度睾酮组（3&;#215;10^-9, 3&;#215;10^4, 3&;#215;10^-9, 3&;#215;10^-5 mol/L）及单纯培养液对照组，继续孵育48h，吸取上清，酶联免疫吸附法测定各组组织因子途径抑制物蛋白含量。反转录-聚合酶链反应法观察各组组织因子途径抑制物基因表达水平。结果：①人血管内皮细胞组织因子途径抑制物含量：对照组，3&;#215;10^-9, 3&;#215;10^-8, 3&;#215;10^-6. 3&;#215;10^-5 mol/L睾酮组组织因子途径抑制物含量分别为（6．43&;#177;0．61），（9．8&;#177;1．18），（9．8&;#177;1．05），（6．43&;#177;1．19），（5．43&;#177;0．66）μg／L生理浓度睾酮可明显增加内皮细胞上清液中组织因子途径抑制物含量。而3&;#215;10^-5mol／L组的组织因子途径抑制物含量明显低于对照组（P〈0,05）。②不同浓度睾酮组组织因子途径抑制物mRNA水平：3&;#215;10^-9，3&;#215;10^-8mol／L组组织因子途径抑制物mRNA水平明显高于对照组（P〈0．05）。而3&;#215;10^-5mol／L组组织因子途径抑制物mRNA水平又显著降低（P〈0．05）。结论：生理浓度睾酮通过雄激素受体促进组织因子途径抑制物合成、分泌，增强抗凝系统活性，有利于预防男性冠心病及心肌梗死等血栓性疾病的发生。     

氧自由基对培养人脐静脉内皮细胞代谢产物的影响

目的：观察氧自由基对培养的人脐静脉内皮细胞产生的裂解不对称二甲精氨酸的酶--二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶活性及表达的影响，以探讨不对称二甲精氨酸代谢机斜及卡托普利的作用。方法：实验于2003—05／2004—06在南昌大学医学分子中心进行。采用改良的Jaffe法培养人脐静脉内皮细胞，取生长良好的3～6代人脐静脉内皮细胞分为4组：①空白对照组：加DMEM培养液。②氧自由基0．01，0.1mmol／L组：分别加入氧自由基0.01，0.1mmol／L。③卡托普利组：同时加入氧自由基0.1mmol／L及卡托普利（100mg／L）共孵。孵育24h后，检测上清液中一氧化氮、一氧化氮合酶活性、内皮细胞的代谢产物不对称二甲精氨酸浓度以及反应二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶酶活性的L-瓜氨酸浓度，采用Western blotting测定细胞裂解液中二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶的蛋白表达。结果：①二甲精氨酸浓度：氧自由基0，01，0.1mmol／L组均高于空白对照组[（2．71&;#177;0．35），（4．78&;#177;0．67），（0．81&;#177;0．12）μmol／L，P〈0．05，0．01]，卡托普利组低于氧自由基0．1mmol／L组[（2．03&;#177;0．35）μmol／L．P〈0．01]。②L-瓜氨酸浓度：氧自由基0．01，0．1mmol／L组均低于空白对照组（P〈0．05，0．01）．卡托普利组高于氧自由基0．1mmol／L组（P〈0．01）。③一氧化氮浓度及一氧化氮合酶活性：氧自由基0．01，0．1mmol／L组均低于空白对照组（P〈0．05，0．01），卡托普利组高于氧自由基0．1mmol／L组（P〈0．01）。④二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶的蛋白表达：各组间无差异（P〉0．05）。结论：氧自由基培养下，内皮损伤，不对称二甲精氨酸的增加与二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶的活性减弱有关，与其蛋白的表达无关。而卡托普利则通过增加二甲精氨酸-二甲赖氨酸水解酶活性促进不对称二甲精氨酸代谢，使一氧化氮合酶活性增加，抑制氧自由基对内皮功能的损伤。     

蛇床子素对成骨样细胞UMR106增殖和分化的影响

目的：以在某种程度上可反映成骨细胞增殖的成骨样细胞UMR106为靶细胞，考察蛇床子素对其细胞形态、增殖率和分化程度的影响。方法：实验于2003-03／2004—03，在中国人民武装警察部队医学院药物化学教研室药物活性筛选室进行。以大鼠成骨肉瘤细胞系UMR106为靶细胞，以雌二醇1&;#215;10^-8mol／L为阳性对照，同时设空白对照组，蛇床子素干预组分为1&;#215;10^-8mol／L，1&;#215;10^-7mol／L，1&;#215;10^-6mol／L3个浓度组。①调整细胞浓度为4&;#215;10^-7L^-1，接种于12孔培养板上。48h后，倒置显微镜下观察细胞形态变化。②调整细胞浓度为2&;#215;10^7L^-1，接种于96孔培养板，采用四唑盐法测定各孔的吸光度，计算平均增殖率。③调整细胞浓度为2&;#215;10^7L^-1，接种于24孔培养板，磷酸对硝基苯基质动力学法测定细胞内外碱性磷酸酶括性。上述实验每组均设8个复孔。结果：①培养基中加入蛇床子素培养48h后，与对照组相比UMR106细胞数量明显增多，核分裂期多见，1&;#215;10^-6mol／L，1&;#215;10^-7mol／L组可见细胞重叠生长，分泌基质堆积明显。②UMRl06细胞经蛇床子素处理48h后，相对于对照组，1&;#215;10^-6mol／L组增殖率为52％，1&;#215;10^-7mol／L组为37％，1&;#215;10^-8mol／L组为16％。3个给药组与对照组相比差异均有显著性（t=37．36，14．94，6．81，P〈0．01）。③UMR106细胞经蛇床子素1&;#215;10^-6mol／L和经雌二醇1&;#215;10^-8mol／L处理24h和48h后。细胞内碱性磷酸酶活性均显著高于对照组[（825．17&;#177;1234），（775．16&;#177;8．67），（715．14&;#177;14．17）μkat／g；（2415．48&;#177;15．84），（2355．47&;#177;5．67），（2285．49&;#177;7．67）μkat／g；t=16．56，10．22；20．89，34．90，P〈0．01]。④UMR106细胞在浓度为1&;#215;10^-6，1&;#215;10^-7mol／L的蛇床子素及雌二醇10^-8mol／L培养24h后，细胞外碱性磷酸酶活性显著高于对照组[（781．66&;#177;50），（733．15&;#177;15．34），（728．81&;#177;9．84），（652．80&;#177;11．34）μkat／g；t=22．56，11．9，14.32,P〈0．01]。结论：蛇床子素可剂量依赖地促进UMR106细胞的增殖，刺激UMR106细胞的碱性磷酸酶活性，提示其可能具有直接促进成骨细胞增殖、分化的作用。     

高血压心肌纤维化的发病机制：成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ刺激下单核细胞趋化蛋白-1的表达状况

目的：研究成年大鼠心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)在血管紧张素Ⅱ刺激下单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotaxia protein-1，MCP-1)表达情况，探讨高血压合并心脏损害的可能机制，方法：成年大鼠CFs体外培养，在不同浓度血管紧张素Ⅱ不同作用时间刺激下，应用免疫蛋白印迹法和ELISA法分别测定细胞中和培养上清中MCP-1的含量。结果：①在细胞内和培养上清中均有MCP-1表达。②随着血管紧张素Ⅱ、刺激浓度的增加和刺激时间的延长，细胞内和上清中MCP-1的表达量也逐渐增加。在1&;#215;10^-11，1&;#215;10^-9，1&;#215;10^-8，1&;#215;10^-7，1&;#215;10^-6mol／L的血管紧张素Ⅱ作用下，上清中MCP-1的含量分别为(1．60&;#177;0．21)，(3．18&;#177;0．15)．(4．70&;#177;0．22)，(9．18&;#177;0．52)，(8．75&;#177;0．42)μg／L，与对照组(1．13&;#177;0．09)μg／L比较，除1&;#215;10^-11mol／L组外，差异均有显著性意义(t=26．21-39．67．P均&;lt;0．05)。③在1&;#215;10^-7mol／L的血管紧张素Ⅱ作用下，3，6，12和24h MCP-1的表达量分别为(2．13&;#177;0．31)，(3．25&;#177;0．20)．(5．28&;#177;0．50)和(9．18&;#177;0.52)μg／L，与空白对照组(1.13&;#177;0．09)μg／L比较差异均有显著性意义(t=6.93～34．11，P均&;lt;0．05)。结论：成年大鼠CFs的MCP-1的表达对血管紧张素Ⅱ的刺激有浓度和时间依赖性。CFs的MCP-1的表达可能参与高血压时心肌内的炎性反应和心肌纤维化。     

一氧化氮及一氧化氮合酶在哮喘大鼠气道高反应中的作用

目的：探讨一氧化氮及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)在哮喘大鼠气道炎症中的作用及激素对其活性的影响，以期为该病的预防、康复措施介入提供理论依据。方法：实验选用雄性豚鼠30只，按随机数字法将豚鼠分为3组：①哮喘组：用100g／L卵蛋白腹腔注射1mL致敏，2周后用10g／L卵蛋白超声雾化吸入致其哮喘发作。②激素组：诱喘同前，每次诱喘前腹腔内注射甲基强的松龙10mg／kg。③对照组：用生理盐水代替诱喘剂。每组分别测定其血浆和肺组织NO2^-／NO3^-水平、肺组织诱导型NOS(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和原生型NOS(constitute nitric oxide synthase，cNOS)活性水平，并用组织化学染色法观察NOS在豚鼠哮喘模型肺组织中的分布。结果：3组豚鼠血浆NO2^-／NO3^-水平差异无显著性意义(P&;gt;0．05)，哮喘组肺组织中NO2^-／NO3^-和iNOS活性水平[(0．87&;#177;0．08)μmol／g，(56&;#177;14)nmol／g]明显高于对照组和激素组[(0．19&;#177;0．06)μmol／g，(12&;#177;6)mnol／g；(0．18&;#177;0．07)μmol／g，(12&;#177;5)nmol／g](P&;lt;0．01)。对照组肺组织化学方法显示的阳性产物呈蓝色沉淀，主要分布于各级支气管上皮细胞，哮喘组及激素组阳性产物变化不明显。哮喘组肺组织iNOS活性水平和肺组织NO2^-／NO3^-水平呈高度正相关(r=0．782．P&;lt;0．05)。结论：一氧化氮可引起气道高反应性而导致和(或)加重哮喘发病。用甲基强的松龙治疗哮喘可减轻气道炎症，使哮喘大鼠肺组织中iNOS表达降低。     

辛伐他汀对人脐静脉内细胞CD40／CD40L表达的影响

目的：探讨辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激下的人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L表达的影响。方法：实验于2004—03／06在中南大学湘雅二医院实验室完成。实验所用脐带于无菌条件下取自本院产房健康新生儿，产妇知情同意，实验符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准。辛伐他汀原粉由杭州默沙东制药公司提供。原代培养人脐静脉内皮细胞，实验在第4代有70％细胞汇合的情况下进行。低密度脂蛋白快速分离后加入含10μmol／L硫酸铜的磷酸盐缓冲液氧化修饰24h，在准备后15d内用于实验。采用流式细胞技术检测CD40／CD40L在细胞上的表达，采用逆转录多聚酶链式反应检测NF-κBP65 mRNA，同时行细胞免疫化学染色检测细胞NF-κBP65的表达。观察辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激人脐静脉内皮细胞表达CD40／CD40L分子和NF-κB P65 mRNA的影响实验中，共分5组：①空白对照组，给予磷酸盐缓冲液。②氧化低密度脂蛋白刺激组，80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。③低浓度辛伐他汀组，先予1μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。④高浓度辛伐他汀组，先予10μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。⑤单纯辛伐他汀组，10μmol／L辛伐他汀干预25h。免疫化学检测人脐静脉内皮细胞NF-κBP65分子表达的实验中，共分3组：①空白对照组，给予磷酸盐缓冲液。②氧化低密度脂蛋白刺激组，80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。③辛伐他汀组，10μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。结果：①氧化低密度脂蛋白刺激人脐静脉内皮细胞后CD40／CD40L的表达情况：20-80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h后，CD40／CD40L的表达以浓度依赖和时间依赖的方式增加。②辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激的人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L表达的影响：预先给予辛伐他汀（1μmol／L和10μmol／L）干预1h明显降低氧化低密度脂蛋白所致的CD40／CD40L表达，与单纯氧化低密度脂蛋白刺激组比较，差异显著（P均〈0．05）；10μmol／L的高浓度辛伐他汀较1μmol／L的低浓度辛伐他汀作用更明显（P〈0．05）；而单纯给予10μLmol／L的辛伐他汀干预不影响人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L的表达。③辛伐他汀对NF-v：BP65 mRNA在人脐静脉内皮细胞表达的影响：人脐静脉内皮细胞中加入80mg／L氧化低密度脂蛋白培养24h后NF-κB mRNA的表达明显高于空白对照组（0．53&;#177;0．06，0．08&;#177;0．01，P〈0．01）。而预先给予1μmol／L辛伐他汀孵育lh显著降低氧化低密度脂蛋白刺激升高的NF-κB P65 mRNA，明显低于单纯氧化低密度脂蛋白刺激组（0．31&;#177;0．04，0．53&;#177;0．06，P〈0．01）。高浓度组（10μmol／L）作用更显著，显著低于单纯氧化低密度脂蛋白刺激组（0．14&;#177;0．04，0．53&;#177;0．06，P〈0．01），而单纯给予辛伐他汀（10μmol／L）不影响人脐静脉内皮细胞NF-κB P65 mRNA的表达。结论：氧化低密度脂蛋白以浓度和时间依赖的方式刺激人脐静脉内皮细胞表达CD40/CD40L，而辛伐他汀以剂量依赖的方式减轻氧化低密度脂蛋白刺激下人脐静脉内皮细胞CD40/CD40L的表达，可能与其抑制人脐静脉内皮细胞的NF—κBP65的表达有关。提示辛伐他汀可通过抑制高脂血症患者炎症信号通路而到达抗动脉硬化的作用。     

葛根素体外影响小鼠胚胎长骨雌激素受体β表达的作用

目的：以体外培养小鼠胚胎长骨为靶器官，观察葛根素对骺板雌激素受体亚型雌激素受体β分布及含量的影响，并与内源雌激素比较，分析葛根素对骨可能的作用机制。方法：实验于2003-05／2004-05在中国人民武装警察部队医学院药物化学教研室药物活性筛选室进行。以小鼠胚胎长骨为靶器官，以雌二醇1&;#215;10^-6mol／L处理为阳性对照组，同时设空白对照组、葛根素干预组分为1&;#215;10^-6，1&;#215;10^-5，1&;#215;10^-4mol／L 3个浓度组。①小鼠怀孕16d时取出胚胎，剔除雌性胎鼠前肢肌肉和软组织，剥离出尺骨，做为实验靶器官置于BGJb培养基中，葛根素和雌二醇作用48h后，测量长骨总长和骨干长。每组培养长骨8根，重复3次。②长骨固定、脱钙后作石蜡切片，进行免疫组织化学染色，光镜下观察阳性细胞定位，图像分析系统下测定免疫反应阳性细胞数和阳性细胞面积。结果：雌性胎鼠长骨全部进入结果分析，无脱失。①长骨经葛根素和经雌二醇处理48h后，葛根素1&;#215;10^-4，1&;#215;10^-5mol／L组及阳性对照组骨总长及骨干长与空白对照组相比，差异有非常显著性意义[（3．97&;#177;0．12），（1．51&;#177;0．07）；（3．79&;#177;0．06），（1．40&;#177;0．03）；（4．05&;#177;0．1），（1．62&;#177;0．05）；（3．43&;#177;0．05，1．2&;#177;0．04）mm；P〈0．01]，葛根素10^-6mol／L组仅骨总长与空白对照组相比差异有显著性意义[（3．56&;#177;0．06）mm，P〈0．05]；葛根素1&;#215;10^-6mol／L的作用与阳性对照组差异无统计学意义（P〉0．05），1&;#215;10^-5，1&;#215;10^-6moL／L组作用弱于阳性对照组（P〈0．01）。②空白对照组骺板静止区和肥大区雌激素受体β蛋白几乎不表达，仅增殖区有较弱表达。经葛根素和1&;#215;10^-6mol／L雌二醇作用后，增殖区表达明显增强，肥大区和静止区软骨细胞也都出现雌激素受体β蛋白的阳性表达。葛根素1&;#215;10^-6，1&;#215;10^-5，1&;#215;10^-4mol／L组阳性细胞数和阳性细胞面积均小于阳性对照组[29．8&;#177;2．9，43．5&;#177;5．1，63．3&;#177;5．8．833&;#177;6．9，（819．78&;#177;164．53）．（1175．76&;#177;188．73），（1585．15&;#177;198．93），（2036．12&;#177;384．23）μm^2，P〈0．01～0．05]，作用明显弱于雌二醇，并表现出剂量依赖的趋势。结论：葛根素在体外可促进软骨内成骨。同雌激素一样，葛根素也能够上调骺板雌激素受体β的表达。提示葛根素对软骨内成骨的促进作用可能与其上调雌激素受体β在骺板的表达有关。     

不同剪切力作用与不同时间点血管内皮细胞内皮素-1和一氧化氮含量变化的差异

目的：应用不同剪切力作用体外培养的脐静脉内皮细胞，观察其在不同时间点内皮素-1和一氧化氮含量表达的差异。方法：实验于2002—07／2004—05在解放军总医院基础医学研究所生化研究室完成。利用流室装置通过精密蠕动泵提供剪切力，以50Pa和100Pa两种剪切力作用体外培养的脐静脉内皮细胞，并分别从30，60，120，300，420min5个时间点取灌流液，对照组为没有施加剪切力的脐静脉内皮细胞。用放射免疫法和硝酸还原酶法检测50Pa和100Pa剪切力作用下及空白对照组脐静脉内皮细胞内皮素-1和一氧化氮的含量。结果：①两组剪切力作用内皮细胞，其内皮素-1的表达量在开始前120min均有升高趋势，在30，60，120min时，50Pa组和100Pa组内皮素-1含量明显高于对照组【(28．7&;#177;2．1)，(37．8&;#177;3．5)，(26．0&;#177;2．8)ng／L；(33．6&;#177;5．8)，(43．3&;#177;7．2)，(26．5&;#177;3．6)ng／L；(45．3&;#177;9．4)，(53．6&;#177;8．6)．(32．2&;#177;4．7)ng／L，(f=1．835—6．079，P&;lt;0．05)】。②一氧化氮含量：在30，60，120min时，50Pa组和100Pa组一氧化氮含量明显高于对照组【(37．5&;#177;5．4)，(40．2&;#177;6．7)，(20．7&;#177;3．0)μmol／L；(52．7&;#177;6．3)，(63．7&;#177;7．2)，(21．4&;#177;3．3)μmol／L；(67．8&;#177;6．9)，(84．5&;#177;8．6)，(23．5&;#177;4．1)μmol／L(f=1．835—6．079，P&;lt;0．05)】。100Pa组在60，120min时明显高于50Pa组(t=2．556，3．376，P&;lt;0．05)。结论：在一定层流剪切力和时间范围内内皮细胞表达内皮素-1和一氧化氮呈递增趋势，保持相对稳定，当时间进一步延长时，其表达失去平衡，具有强烈收缩血管活性的内皮素-1相对增多,提示损伤内皮细胞的因素增加。     

香豆雌酚对体外破骨细胞分化和骨吸收活性的影响

目的：观察植物雌激素香豆雌酚对破骨细胞的影响，分析其抗骨质疏松的作用方式。 方法：实验于2005-07／2006-03在东南大学医学院临床实验中心和分子影像实验室、南京师范大学物理实验中心完成。以1，25（OH）2D3诱导大鼠骨髓细胞形成破骨样细胞，通过相差显微镜下的形态观察，抗酒石酸酸性磷酸酶染色和骨片上骨吸收陷窝的形成来鉴定破骨细胞。分别加入0，10^-9，10^-8，10^-7，10^-6，10^-5mol／L香豆雌酚，以10^-9mol／L 17 β-雌二醇为阳性对照，于培养3,6和9d分别计数抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞个数，磷酸苯二钠法测定破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶的活性，于培养12d利用图像分析系统对骨吸收陷窝的面积进行测量分析，原子吸收光谱法测定破骨细胞和骨片联合培养的上清中钙的浓度。 结果：①利用1，25（OH）2D3成功诱导出破骨样细胞。②香豆雌酚抑制破骨细胞的形成和分化：随香豆雌酚浓度增加，每孔抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性的破骨细胞数量呈剂量依赖性减少（香豆雌酚10^-9,10^-8，10^-7，10^-6,10^-5 mol／L组分别为357&;#177;8，347&;#177;11，303&;#177;17，275&;#177;18，268&;#177;6，空白对照组为360&;#177;15，17 β-雌二醇组为200&;#177;12，P＜0．05）。③破骨细胞噬骨活性：骨吸收陷窝面积香豆雌酚各浓度组与空白对照组相比均有显著下降，香豆雌酚10^-9与10^-8，10^-7，10^-6,10^-5 mol／L组之间，香豆雌酚10^-8，10^-7mol／L组与10^-6，10^-5mol／L组之间差异均有显著性。④破骨细胞和骨片联合培养的上清中钙的浓度;应用香豆雌酚10^-8～10^-5mol/L处理后共培养体系中的钙浓度与空白对照组相比分别下降了24．7％，36.2％，36．9％，39．1％。 结论：香豆雌酚可通过抑制破骨细胞的形成、抗酒石酸酸性磷酸酶的活性和骨吸收作用，抑制破骨细胞分化和骨吸收活性，从而具有抗骨质疏松作用。     

高压氧对内皮细胞分泌一氧化氮及口腔黏膜下纤维性变的影响及其机制

目的：了解高压氧对内皮细胞分泌一氧化氮的影响，探讨高压氧治疗口腔黏膜下纤维性变的可能机制方法：实验于2001—12／2002—06在中南大学湘雅二医院中心实验室完成。用高压氧干预体外培养的内皮细胞，收集培养上清，用ELISA方法检测内皮细胞培养上清中一氧化氮的浓度。结果：经高压氧处理一定次数的内皮细胞分泌一氧化氮增加，正常组的一氧化氮浓度为(49．41&;#177;24.92)μmol／L，高压氧处理2d(2次／d)组的一氧化氮浓度最高．为(84．33&;#177;32．34)μmol／L。结论：高压氧可能通过增加内皮细胞产生一氧化氮的量而治疗口腔黏膜下纤维性变。     

中药当归主要活性成分阿魏酸钠抑制淀粉样β蛋白激活炎症因子的量剂反应

目的：观察中药当归提取的主要活性成分阿魏酸钠对淀粉样β蛋白激活的小鼠腹腔巨噬细胞α肿瘤坏死因子、诱导型一氧化氮合酶和一氧化氮水平的影响。方法：实验于2004-03／10在锦州医学院药理实验室和解剖实验室完成。选择8～10周龄的小鼠36只，随机分为6组，每组6只。正常对照组：巨噬细胞接种24h后用培养基继续培养。淀粉样β蛋白组：巨噬细胞接种24h后在培养基中加入经老化处理的终浓度为10μmol/L的淀粉样β蛋白。淀粉样β蛋白＋10，100，500μmol／L，1mmol／L阿魏酸钠组：在加入淀粉样β蛋白的同时加入10，100，500μmol/L，lmmol／L的阿魏酸钠共同孵育。培养48h后采用酶联免疫吸附法、免疫组织化学方法和Griess反应分别检测肿瘤坏死因子α分泌量、诱导型一氧化氮合酶表达和一氧化氮的生成量。结果：36只小鼠均进入结果分析。①巨噬细胞的肿瘤坏死因子α分泌量：淀粉样β蛋白组明显高于正常对照组[（28154&;#177;14．85），（1755&;#177;4．84）ng／L，（P〈0．01）]。淀粉样β蛋白＋10，100，500μmol／L，1mmol／L阿魏酸钠组可以不同程度地减少由淀粉样β蛋白诱导产生的肿瘤坏死因子α的分泌量[（238．05&;#177;6．21）．（186．90&;#177;7．44），（117．55&;#177;8.08），（71．77&;#177;10．50）ng/L，P〈0．011，且有明显剂量依赖关系（P〈0．05）。②巨噬细胞的一氧化氮生成量：淀粉样口蛋白组明显高于正常对照组[（85.04&;#177;6．16），（26．10&;#177;3．25）μmol／L，（P〈0．01）]，淀粉样β蛋白＋10，100，500μmol／L，1mmol/L阿魏酸钠组可以不同程度地减少由淀粉样β蛋白诱导产生的一氧化氮的量[（69.80&;#177;4.96），（54.52&;#177;345），（43.88&;#177;4.04），（33．83&;#177;3．13）μmol／L，P〈0．011，且有明显剂量依赖关系（P〈0．05）。⑧诱导型一氧化氮合酶的表达：正常对照组只有零星细胞染色阳性；而淀粉样β蛋白组多数细胞胞浆被染成黄褐色。各剂量组的阿魏酸钠可以不同程度地抑制由淀粉样β蛋白激活巨噬细胞造成的诱导型一氧化氮合酶的表达，该抑制作用呈明显剂量依赖性。结论：①淀粉样β蛋白能激活巨噬细胞，使其分泌大量的肿瘤细胞坏死因子α和一氧化氮，诱导型一氧化氮合酶表达也相应增加。②阿魏酸钠通过其抗炎作用呈明显剂量依赖性抑制淀粉样β蛋白对巨噬细胞的激活作用，从而使巨噬细胞生成肿瘤细胞坏死因子α、诱导型一氧化氮合酶、一氧化氮水平降低。     

搏动信号对人脐静脉内皮细胞一氧化氮合成酶表达的影响

目的：观察搏动信号对人脐静脉内皮细胞中反映内皮细胞活性的内皮型一氧化氮合酶mRNA表达的影响。 方法：实验于2004-06／2005-03在湘雅二医院心胸外科生物材料研究室和上海生物工程有限公司进行。将取自剖宫产产妇自愿捐献的无菌脐带的人脐静脉内皮细胞培养、传代，传4代后分为两组：①搏动培养组：先静放6-8h待细胞贴壁后，用自行设计的细胞搏动培养装置，进行搏动培养。搏动参数：搏动频率150次／min，搏出量0．3mL／次，搏动产生的压力30／9mmHg（1mmHg=0．133kPa）。②静态培养组：不进行搏动，其余条件同搏动培养组。每组每个时间点5个样本。用反转录-聚合酶链反应方法，分别在第1，2，4，6，9，12，15，18天检测两组的人脐静脉内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达水平（相对吸光度值）。 结果：人脐静脉内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶mRNA表达：①培养第1，4天，静态培养组明显高于搏动培养组（1．0&;#177;0．55比1．10&;#177;0．35；1．17&;#177;0．23比1．42&;#177;0．44，P〈0．05）。②培养第2天两组比较差异不显著（1．16&;#177;0．18比1．25&;#177;0．35，P〉0．05）。③培养第6，9，12，15，18天，搏动培养组明显高于静态培养组（1．52&;#177;0.14比1．27&;#177;0.30；1．60&;#177;0.19比1．16&;#177;0.33；1．68&;#177;0.44比0．99&;#177;0.31；1．7&;#177;0.24比1．1&;#177;0.94；1．7&;#177;0.16比1．0&;#177;0.28，P〈0．05）。 结论：搏动信号能提高人脐静脉内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶的表达。提示搏动信号在维持细胞发挥正常的生理功能方面起到重要的作用，能增强细胞的生物活性。     

衰老对离体大鼠主动脉内皮依赖性血管舒张反应的影响

目的：研究增龄对离体大鼠主动脉内皮依赖性舒张的影响。方法：成年及老年大鼠各20只，利用组织器官水浴系统，通过乙酰胆碱、N-硝基左旋精氨酸，测量离体主动脉环的舒张反应变化(％)。同时利用免疫组织化学方法观察诱导型一氧化氮合酶(inducible nitrleoxide synthase，iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide svnthase，eNOS)在不同年龄大鼠主动脉中的表达。结果：①老年组大鼠主动脉环对1&;#215;10^-8，1&;#215;10^-7，1&;#215;10^-6，1&;#215;10^-5,1&;#215;10^-4mol／L乙酰胆碱诱发的内皮依赖舒张反应[(3．13&;#177;0．85)％，(12．60&;#177;2．18)％，(25．23&;#177;4．63)％，(37．73&;#177;6．95)％，(50．78&;#177;3．58)％]均较成年组明显减弱，两组之间有显著差异(P&;lt;0．01)。②离体大鼠主动脉环环经1&;#215;10^-4mol／LNNIA预处理20min，阻断一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)后，同样剂量的乙酰胆碱不再诱发上述内皮依赖性舒血管反应。③eNOS组：在老年组血管内膜层可见棕褐色的阳性反应颗粒120．524&;#177;2．037，但较成年组相比，可发现阳性反应明显减弱。iNOS组：成年组内膜及中膜层可见较弱的棕褐色阳性反应颗粒沉在老年组(112．371&;#177;1．64)，阳性反应明显增强。结论：随增龄，血管内皮分泌的一氧化氮逐渐减少，导致血管内皮依赖性舒张减弱；NOS的异常表达对一氧化氮减少起着重要的作用，eNOS随增龄表达减弱，而iNOS随增龄表达则明显增强。     

低氧对肺动脉高压大鼠肺组织尾加压素Ⅱ合成及释放的影响

目的：探讨低氧性肺动脉高压大鼠肺组织中尾加压素Ⅱ的合成、分泌及其在低氧性肺动脉高压病理生理过程中的作用。方法：实验选用雄性Wistar大鼠76只，随机分为正常对照组，低氧10，20，30d组，每组19只，在低氧10d和20d后各有1只死亡。间断常压低氧方法复制低氧性肺动脉高压大鼠模型，应用光镜、免疫组化、放射免疫分析等方法，测定低氧各组和对照组大鼠肺组织中尾加压素Ⅱ蛋白表达及血浆、支气管肺泡灌洗液尾加压素Ⅱ含量的动态变化。结果：各组大鼠支气管黏膜上皮细胞、肺血管内皮细胞及其平滑肌细胞、肺巨噬细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞和支气管软骨细胞中尾加压素Ⅱ均呈阳性表达，低氧后上述各种细胞中尾加压素Ⅱ表达明显增强。血浆和支气管肺泡灌洗液尾加压素Ⅱ浓度于低氧10d开始升高[(4、26&;#177;1．61)，(20．93&;#177;6、64)pmol／L]，20d时两者均达高峰[(9．03&;#177;1．80)，(34．71&;#177;5．31)pmol／L]明显高于对照组[(3．74&;#177;1．08)，(16．83&;#177;4．99)pmol／L](t=6．15，7．39，P&;lt;0．001)，低氧30d出现下降趋势，但仍高于对照组(t=2．24，3．97，P&;lt;0．05)。结论：低氧可促进肺组织中尾加压素Ⅱ的合成和释放；在低氧性肺动脉高压病理生理过程中，尾加压素Ⅱ对调节肺循环和肺通气及肺血管改建等方面发挥重要作用。     

复方水蛭合剂对大鼠局灶性脑缺血细胞因子免疫损伤的保护作用

目的：探讨复方水蛭合剂对局灶性脑缺血细胞因子免疫损伤的保护作用。方法：Wistar大鼠正常组6只，空白对照组12只，复方水蛭合剂组36只。检测大鼠大脑中动脉缺血后6，24h脑组织匀浆白细胞介素1、肿瘤坏死因子、一氧化氮的变化及复方水蛭合剂对其影响。结果：大鼠大脑中动脉缺血后6，24h模型组脑组织匀浆肿瘤坏死因子、白细胞介素1、一氧化氮[6h：(73.47&;#177;7.04)kIU／L(0.87&;#177;0.05)μg／L(89.07&;#177;6.69)μmol／L，24h：(90．75&;#177;7.63)kIU／L(0.98&;#177;0．07)μg／L(114．16&;#177;9.03)μmol／L]明显比正常组[(57．55&;#177;4.85)kIU／L(0．70&;#177;0．09)μg／L(51．43&;#177;5．49)μnol／L]高(P＜0．01)，大、中剂量复方水蛭合剂组明显比空白对照组低(P＜0．05～0．01)。病理形态学检查：大、中剂量复方水蛭合剂组与空白对照组比较均较轻。结论：复方水蛭合剂对脑缺血所致的细胞因子的免疫损伤有保护作用。     

肾上腺髓质素N端20肽对血管紧张素Ⅱ刺激血管平滑肌细胞增殖及胶原生成的影响

目的：观察肾上腺髓质素N端20肽对血管紧张素Ⅱ刺激血管平滑肌细胞增殖及胶原生成的影响。 方法：实验于2003-09／2004-09在南方医科大学珠江医院中心实验室进行。①采用组织贴壁法培养大鼠血管平滑肌细胞。②实验分组：空白对照组；1&;#215;10^-9 1&;#215;10^-8 ，1&;#215;10^-7，1&;#215;10^-6mol／L血管紧张素Ⅱ组；1&;#215;10^-9，1&;#215;10^-8，1&;#215;10^-7，1&;#215;10^-6mol／L肾上腺髓质素N端20肽组；1&;#215;10^-7mol／L血管紧张素Ⅱ＋（1&;#215;10^-9，1&;#215;10^-8，1&;#215;10^-7，1&;#215;10^-6mol／L）肾上腺髓质素N端20肽组。③以^3H脯氨酸掺入试验测定血管平滑肌细胞的胶原合成功能，以四氮唑盐法测定细胞增殖情况。分别观察不同浓度肾上腺髓质素N端20肽、血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞增殖及合成胶原的影响。 结果：①肾上腺髓质素N端20肽及血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞的胶原合成功能的作用：肾上腺髓质素N端20肽组的。H脯氨酸掺入率与对照组相比（P〉0．05），差异均无显著性。随着血管紧张素Ⅱ浓度的增高，血管平滑肌细胞的。H脯氨酸掺入率呈递增趋势。血管紧张素H＋肾上腺髓质素N端20肽组的^3H脯氨酸掺入率在血管紧张素H浓度不变的情况下，随着肾上腺髓质素N端20肽浓度的增高，血管平滑肌细胞的^3H脯氨酸掺入率呈递减趋势，各组之间差异有显著意义（P〈0．01）。②肾上腺髓质素N端20肽及血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞增殖的影响：随着肾上腺髓质素N端20肽浓度的增高，四氮唑盐比色值差异无显著性（P均〉0．05）。随着血管紧张素Ⅱ浓度的增高，四氮唑盐比色值增也明显增高，各组间差异有显著性意义（P均〈0．01）。血管紧张素Ⅱ＋肾上腺髓质素N端20肽组中，在血管紧张素Ⅱ浓度不变的情况下，随着肾上腺髓质素N端20肽浓度的增高，四氮唑盐比色值均显著降低（P〈0．01）。 结论：肾上腺髓质素N端20肽对血管紧张素Ⅱ刺激血管平滑肌细胞增生及胶原的生成起明显抑制作用。     

干预糖尿病患者血管病变：二氯醋酸二异丙胺对内皮细胞的功能效应

目的：了解丙酮酸脱氢酶激活剂二氯醋酸二异丙胺对内皮细胞功能指标的影响.方法：将传代培养的人脐静脉内皮细胞接种至6孔板,培养48～72 h至90%融合.将每孔分别分组：对照组：葡萄糖浓度为5.5 mmol/L;高糖组：葡萄糖浓度为30 mmol/L;二氯醋酸二异丙胺＋高糖组：浓度为1&;#215;10^-5,1&;#215;10^-4,1&;#215;10^-3 mol/L的二氯醋酸二异丙胺,加高糖处理48 h.用2.5 g/L胰酶消化收集细胞;固定后充分混匀制成1&;#215;10^9 L-1细胞悬液;加RNA酶A37℃水浴45 min;加入碘化丙啶50g/L混匀,4℃避光放置60 min,尼龙网滤过,上流式细胞仪分析细胞DNA含量,计数10 000个细胞,以亚G1峰细胞为凋亡细胞,计算细胞凋亡率.以体外原代培养的人脐静脉内皮细胞为靶细胞观察二氯醋酸二异丙胺对高糖诱导的血管内皮细胞功能指标一氧化氮和可溶性细胞间黏附分子1及细胞凋亡的影响;用改进的DPN诱导分析法检测二氯醋酸二异丙胺对人脐静脉内皮细胞中丙酮酸脱氢酶活性的影响.结果：①高糖组细胞一氧化氮浓度[（590.77&;#177;56.00）μmol/L]明显低于对照组[（799.47&;#177;51.77）μmol/L,P＜0.01],可溶性细胞间黏附分子1水平明显高于对照组（P＜0.001）.二氯醋酸二异丙胺＋高糖组细胞一氧化氮浓度明显高于高糖组（P＜0.05～0.01）,可溶性细胞间黏附分子1水平明显低于高糖组（P＜0.01）.②不同浓度的二氯醋酸二异丙胺可呈浓度依赖性激活丙酮酸脱氢酶活性,高浓度组与中、低浓度二氯醋酸二异丙胺组相比,差异有显著性意义（P＜0.05）.结论：二氯醋酸二异丙胺可以通过对丙酮酸脱氢酶的激活来纠正内皮细胞功能紊乱.     

维生素C和辅酶Q10对饲喂乙醇兔血浆一氧化氮及其合酶和丙二醛含量的影响

目的：观察维生素C和辅酶Q10对饲喂乙醇兔血浆一氧化氮及其合酶和丙二醛含量的影响。方法：实验于2004-02在山东省菏泽市立医院中心试验室完成。将30只白色獭兔随机分为3组：正常对照组、饲喂乙醇组和干预治疗组，每组10只。正常对照组给予普通饲料喂养30d，饲喂乙醇组饲喂乙醇30d，干预治疗组饲喂乙醇30d停喂乙醇加喂维生素C、辅酶Q10 15d，疗程结束后抽血检测一氧化氮、丙二醛含量及一氧化氮合酶活性。乙醇给药方法为每天清晨饲喂3mL／kg，稀释比例为每3mL乙醇加入10mL蒸馏水。维生素C200mg／kg，辅酶Q10 0．5me,／kg，同一时间，同一地点，一次灌胃。应用分光光度计检测一氧化氮、丙二醛的含量及一氧化氮合酶的活性。结果：30只白色獭兔均进入结果分析。①一氧化氮合酶活性：正常对照组明显高于干预治疗组[（391．58&;#177;45．57，313．06&;#177;411．67）nkat／g，（P〈0．05）]。②一氧化氮含量：饲喂酒精组明显低于干预治疗组[（36．62&;#177;9．50．58．39&;#177;10．32）μmol／L，（P〈0．05）]。③丙二醛含量：正常对照组明显低于饲喂酒精组[（2．68&;#177;0．57，4．43&;#177;0．91）μmol／L，（P〈0．01）]。结论：乙醇可以降低兔血浆中一氧化氮含量及一氧化氮合酶的活性，提高兔血浆中丙二醛的含量。维生素C和辅酶Q10可提高一氧化氮含量。增强一氧化氮合酶活性，降低丙二醛含量，其作用可能与抑制氧自由基损伤，减轻脂质过氧化反应有关。     

葛根素对糖尿病患者血液相关因子及血管内皮功能的影响

目的：通过观察葛根素对血内皮素、一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)水平的影响，初步探讨其对糖尿病患者血管内皮的保护作用。方法：将2002-01／2004-01抚顺市中医院内分泌科收治的76例单纯糖尿病患者随机分为单纯糖尿病葛根素治疗组(给予葛根素注射，39例)，丹参对照组(给予复方丹参注射液，37例)，同时选20名糖尿病并血管病变的患者作为糖尿病并血管病变葛根素治疗组(给予葛根素注射)，选20名健康成年人作为健康对照组。葛根素治疗30d，治疗前后检测内皮素、NO，NOS水平。结果：治疗后，单纯糖尿病葛根素治疗组和糖尿病并血管病变葛根素治疗组血内皮素浓度降低，治疗前后的值分别为(107．33&;#177;29．31)，(85．04&;#177;23．62)pg／L和(119．67&;#177;30．73)，(88．12&;#177;27．29)pg／L(P&;lt;0．05)，NO，NOS上升，NO为(50．49&;#177;20．31)，(59．51&;#177;21．19)μmol／L(P&;lt;0．05)；(50．67&;#177;21．19)，(56．88&;#177;22．11)μmol／L(P&;gt;0．05)；NOS为(109．02&;#177;21．84)，(116．86&;#177;16．34)nkat／L和(118．86&;#177;23．34)，(137．19&;#177;22．84)nkat／L(P&;lt;0．05)，以糖尿病并血管病变葛根素治疗组为明显；丹参对照组与治疗前比较，血内皮素略下降(P&;gt;0．05)，血NO，NOS水平稍升高(P&;gt;0．05)。结论：葛根素通过降低内皮素浓度，升高NO，NOS水平而发挥保护糖尿病患者血管内皮的作用。