肺动脉平滑肌细胞上TMEM16A的表达及其阻滞剂对细胞增殖的作用

目的：研究TMEM16A在大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)上的表达及其阻滞剂(T16Ainh-A01)对PASMCs增殖的作用。方法组织块贴壁法分离正常大鼠PASMCs,原代培养。光镜下观察细胞形态,细胞免疫化学和细胞免疫荧光进行鉴定。细胞免疫荧光检测TMEM16A在PASMCs上表达。原代培养的3~6代PASMCs分别在10μmol/L T16Ainh-A01、20μmol/L T16Ainh-A01和50μmol/L T16Ainh-A01下培养24 h,用CCK-8法检测细胞增殖情况。结果倒置显微镜下PASMCs以长梭形为主,细胞核卵圆形,部分细胞重叠区域呈典型的“峰-谷”状结构。免疫学检测显示胞浆内与细胞长轴平行的肌丝被染成棕黄色,标记肌丝的红色荧光也与细胞长轴平行,标记细胞膜上的TMEM16A的绿色荧光可见表达,而细胞核不染色。CCK-8实验检测,相对于对照组,10μmol/L T16Ainh-A01组细胞活力均数为(96.74±0.92)%,20μmol/L T16Ainh-A01组均数为(92.21±1.25)%,50μmol/L T16Ainh-A01组均数为(87.41±3.27)%,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论正常大鼠PASMCs表达TMEM16A;T16Ainh-A01可抑制PASMCs增殖,其抑制作用呈浓度依赖性;TMEM16A可能参与调控PASMCs增殖。     

低氧对大鼠不同级别肺动脉平滑肌细胞功能的影响

目的培养鉴定大鼠不同级别肺动脉平滑肌细胞（ pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）,探讨其对缺氧刺激反应性的不同。方法酶消化法分离大鼠不同级别PASMCs并分为3组：大肺动脉组,包括肺动脉干及肺内一级主干;中动脉组,包括肺内主干的第二级和第三级分支;小肺动脉组,包括肺内主干四级分支后的更细小分支。分别给予常氧（ DMEM＋2%FBS、5%CO2、21%O2、37益）和低氧（ DMEM＋2%FBS、5%CO2、3%O2、37益）培养48 h,用四甲基偶氮唑盐（ methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）比色法和Western blotting检测增生细胞核抗原（ proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的蛋白表达水平的方法检测细胞的增生能力;应用伤口愈合实验检测细胞的迁移能力。结果倒置显微镜下PASMCs呈现长梭形,免疫荧光法检测平滑肌细胞标志物即平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）为阳性,生理情况下（常氧）,3组肺动脉平滑肌细胞增生及迁移能力均较一致;低氧培养48 h后,中小肺动脉平滑肌细胞的增生与迁移能力均显著高于大动脉,PCNA结果与MTT结果一致,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论在低氧条件刺激下,不同级别肺动脉平滑肌细胞反应性不同,中小肺动脉平滑肌细胞的增生及迁移能力均显著高于大肺动脉平滑肌细胞。     

慢性低氧钙激活氯通道在大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的探讨慢性低氧时钙激活氯通道（ClCa）在大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖中的作用。方法将PASMCs分别置于常氧及慢性低氧下,采用形态学、流式细胞术、免疫细胞化学法,观察ClCa阻滞剂尼氟灭酸（NFA）和indaryloxyacetic acid（IAA-94）对PASMCs增殖的影响。结果慢性低氧：①PASMCs呈合成表型,而常氧为收缩表型,NFA和IAA-94干预后呈合成表型的PASMCs向收缩型转变;②S＋G2M期细胞所占比例增高,NFA和IAA-94干预后减低,且G0G1期细胞所占比例增加（P〈0.01）;③PCNA表达阳性率增高,NFA和IAA-94干预后降低（P〈0.01）;④c-fos和c-jun蛋白阳性染色A增高,NFA和IAA-94干预后降低（P〈0.01）。结论慢性低氧引起细胞表型改变,可促进细胞增殖,而抑制ClCa的活性可抑制细胞的增殖,提示ClCa参与了低氧PASMCs的增殖。     

阿托伐他汀对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖凋亡的影响

目的探讨阿托伐他汀对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖凋亡的影响。方法 40只雄性SD大鼠随机分为对照组、低氧组和干预组Ⅰ、Ⅱ。干预组Ⅰ、Ⅱ每日低氧前分别给予阿托伐他汀1.5mg/kg或3.0mg/kg灌胃。建立常压低氧大鼠模型,应用增殖细胞核抗原（PCNA）及原位缺口末端标记法（TUNEL）对PASMCs进行增殖与凋亡分析。结果各组大鼠PASMCs增殖和凋亡细胞同时存在。与对照组比较,低氧组大鼠PASMCs增殖指数（PI）显著增高、凋亡指数（AI）显著下降（P值均〈0.01）;而与低氧组比较,两干预组大鼠PASMCs的PI显著降低、AI明显增加（P值均〈0.05）。结论阿托伐他汀对低氧大鼠PASMCs具有抑制增殖、促进凋亡的作用。     

冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及癌基因c-fos、c-jun表达的影响

目的 探讨冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响及其可能的作用机制.方法 用MTT法测定不同浓度冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠PASMCs增殖的影响,用流式细胞仪分析冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠PASMCs细胞周期的影响,用免疫细胞化学染色法测定冬虫夏草水提取物对慢性低氧大鼠PASMCs增殖细胞核抗原(PCNA)和癌基因c-fos、c-jun表达的影响.结果 低氧对照组大鼠PASMCs吸光度(A)值明显高于常氧对照组,差异有统计学意义(P<0.01),1、10、100 mg/mL冬虫夏草组A值呈明显下降趋势,差异均有统计学意义(P<0.05);低氧对照组S+G2M 期细胞比例明显高于常氧对照组,差异有统计学意义(P<0.01),冬虫夏草组S+G2M期细胞比例明显低于低氧对照组,但高于常氧对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);冬虫夏草组PCNA阳性表达率明显低于低氧对照组,但高于常氧对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);冬虫夏草组细胞c-fos和c-jun 蛋白阳性染色平均积分光密度值(AIOD)明显低于低氧对照组,但高于常氧对照组,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 冬虫夏草水提取物呈浓度依赖性抑制慢性低氧导致的大鼠PASMCs增殖,其抑制作用可能是通过减少细胞内c-fos、c-jun基因和PCNA的表达、降低S期和G2/M期细胞比例来实现的.     

不同低氧环境对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的 探讨不同低氧环境对大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)增殖活性的影响.方法 将原代培养的大鼠PASMCs分为常氧组(21% O2,5% CO2)、低氧组(10% O2,85% N2,5% CO2)、缺氧组(1% O2,94% N2,5%...     

不同低氧时间诱导的肺动脉平滑肌细胞m iR-214表达的动态变化

目的：观察不同低氧时间诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）微小RNAs（miRNA）‐214表达的变化。方法将原代培养的大鼠PASMCs分别于低氧下培养0、6、12、24和48 h ,采用实时荧光定量PCR（RT‐PCR）检测各组细胞miR‐214的表达情况。结果大鼠PASMCs的miR‐214表达随低氧时间的延长呈持续升高趋势,除低氧6 h组与低氧0 h组相比较,miR‐214的表达差异无统计学意义（P＞0．05）外,其余各组之间miR‐214的表达差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论低氧诱导后,miR‐214在PASMCs中的表达上调,且随着低氧时间的延长,miR‐214的表达有逐渐增加的趋势。     

益气化痰散瘀方含药血清对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的观察益气化痰散瘀方含药血清对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)凋亡的影响,并探讨其机制是否通过线粒体途径。方法制备益气化痰散瘀方含药血清和空白血清。组织贴块法培养大鼠PASMCs并进行a-SMA细胞免疫荧光鉴定。MTT法筛选最佳含药血清及最佳低氧时间:常氧对照组,低氧模型组,5%含药血清、10%含药血清、20%含药血清组(含药血清用空白血清稀释),分别作用12、24、48 h。正式实验根据MTT结果分为常氧对照组、低氧模型组、最佳含药血清组,含药血清作用最佳低氧时间后,TUNEL-FITC/DAPI法检测各组PASMCs凋亡情况,Western Blot法检测各组casepase-9、casepase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果 MTT结果显示益气化痰散瘀方含药血清浓度为20%、低氧作用24 h时抑制作用最强,效果最佳。TUNEL-FITC/DAPI法显示与低氧模型组比较,益气化痰散瘀方含药血清可明显促进低氧条件下大鼠PASMCs的凋亡(P0.01);Western Blot法显示益气化痰散瘀方含药血清可升高低氧大鼠PASMCs的casepase-9、casepase-3和Bax蛋白表达(P0.05,P0.01),降低Bcl-2蛋白表达(P0.01)。结论益气化痰散瘀方含药血清可能通过线粒体途径诱导低氧大鼠PASMCs凋亡。     

衰老和缺氧对培养大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的 探讨衰老及缺氧对体外培养的肺动脉平滑肌(PASMCs)增殖的影响。方法 将细胞分为年轻常氧组、老年常氧组、年轻缺氧组、老年缺氧组。应用MTT比色法、^3H-TdR掺入法、流式细胞术、免疫组化方法检查细胞的增殖情况。结果 同年轻组比较，老年组PASMCs的生长曲线明显抬高，^3H-TdR掺入明显增加，进入有丝分裂期的细胞比例明显增加，总蛋白量减少，增殖细胞核抗原(PCNA)增加；同常氧组比较，缺氧组PASMCs的生长曲线明显抬高。^3H-TdR掺入先受抑制，后明显增加，进入有丝分裂期的细胞比例明显增加，总蛋白量减少，PCNA增加。结论 衰老和缺氧部能直接刺激平滑肌细胞的增殖．衰老的平滑肌细胞受缺氧刺激增殖最为明显。     

Akt3基因在低氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞体外增殖中的作用

目的 通过观察缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(Akt3)mRNA及其蛋白表达水平变化与低氧PASMC增殖的关系,探讨Akt3在低氧肺血管重建中的调控作用.方法 组织块法培养PASMC.采用半定量RT-PCR技术检测常氧组(N组)和低氧2、8、12、24h组Akt3基因mRNA表达水平;采用Western blot技术检测相应蛋白表达水平.采用MTT法、3H-TdR掺入法检测PASMCs增殖改变.结果 低氧诱导PASMCs不断增殖.各组均检测出Akt3基因mRNA以及蛋白表达变化,图像定量分析光密度值显示各组表达mRNA以及蛋白表达与细胞增殖改变密切相关.结论 Akt3基因可能在低氧肺动脉高压中调节PASMC增殖.     

衰老和缺氧对培养大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨衰老及缺氧对体外培养的肺动脉平滑肌(PASMCs)增殖的影响。方法将细胞分为年轻常氧组、老年常氧组、年轻缺氧组、老年缺氧组,应用MTT比色法、3H-TdR掺入法、流式细胞术、免疫组化方法检查细胞的增殖情况。结果同年轻组比较,老年组PASMCs的生长曲线明显抬高,3H-TdR掺入明显增加,进入有丝分裂期的细胞比例明显增加,总蛋白量减少,增殖细胞核抗原(PCNA)增加;同常氧组比较,缺氧组PASMCs的生长曲线明显抬高,3H-TdR掺入先受抑制,后明显增加,进入有丝分裂期的细胞比例明显增加,总蛋白量减少,PCNA增加。结论衰老和缺氧部能直接刺激平滑肌细胞的增殖,衰老的平滑肌细胞受缺氧刺激增殖最为明显。     

内源性NO对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的 探讨内源性一氧化氮(NO)对低氧下离体肺动脉平滑肌细胞( PASMCs)增殖的影响.方法 原代培养Wistar大鼠PASMCs,分常氧组(21％O2,5％CO2)和低氧组(1％ O2,94％N2,5％ CO2)进行培养,分别应用非选择性一氧化氮合酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NG-nitro-arginine methyl ester,L- NAME)进行干预,用细胞计数和四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖水平.结果 低氧下的肺动脉平滑肌细胞2天后明显增殖,与常氧组相比有显著性差异(P＜0.01),5天后细胞数达到峰值.L - NAME低氧干预组细胞增殖水平明显高于低氧组和常氧组(P＜0.01).结论 L-NAME抑制内源性NO的产生进而促进低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖.     

低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞和肺微血管内皮细胞表达及分泌fractalkine的影响

目的 观察低氧对培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞和肺微血管内皮细胞表达及分泌fractalkine（FKN）的影响。 方法 低氧处理体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞和肺微血管内皮细胞12 h、24 h和48 h,采用原位杂交和免疫组化法检测细胞中FKN mRNA和蛋白的表达,酶联免疫法检测细胞上清液中FKN的浓度。 结果 ①与对照组比较,大鼠肺动脉平滑肌细胞在低氧处理12 h后,其FKN mRNA和蛋白表达、细胞上清液中FKN浓度无明显变化（P>0.05）,低氧24 h后FKN mRNA和蛋白表达、细胞上清液中FKN浓度均增加（P<0.05）,48 h后其增加则更加明显（P<0.01）。②大鼠肺微血管内皮细胞在低氧处理12 h、24 h和48 h后,其FKN mRNA和蛋白表达及细胞上清液中FKN浓度与对照组比较均无明显变化（P>0.05）。 结论 低氧刺激增加了大鼠肺动脉平滑肌细胞表达和分泌FKN。     

RNA干扰沉默STIM1表达对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的 应用RNA干扰抑制肺动脉平滑肌细胞(pulmonary aretery smooth muscle cells,PASMCs)基质交感分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)基因表达,探讨STIM1表达抑制后对PASMCs缺氧增殖反应的影响.方法 采用离体培养大鼠肺动脉平...     

Dichloroacetate与肺动脉平滑肌细胞增殖及凋亡关系的研究

目的探讨Dichloroacetate（DCA）对低氧导致的肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增殖和凋亡的影响及其机制。方法原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞并传代纯化，实验用第3～8代细胞，实验共分3组：①对照组：不加特殊试剂，不作低氧处理；②低氧组：低氧处理24 h，不加特殊试剂；③低氧＋DCA组：低氧处理24 h，在进行低氧处理之前加入终浓度为0.1 mol/L的DCA。每组各6孔细胞。用免疫组化的方法检测并比较3组细胞的增殖和凋亡情况。结果低氧组增殖细胞核抗原（PCNA）的平均光度值是对照组的2.7倍，而低氧＋DCA组仅是对照组的1.7倍，Caspase-3在低氧组的表达最低，是对照组的1/4，低氧＋DCA组Caspase-3表达较对照组减低，但较低氧组明显增加，是低氧组的2倍。TUNEL法同样提示凋亡在低氧组最低，对照组最高，低氧＋DCA组居中。结论DCA可抑制PASMC增殖并促进其凋亡，可能对阻止肺动脉高压血管重构起一定作用。