血管紧张素转化酶基因在大鼠心肌组织中的表达

目的研究血管紧张素转化酶基因在大鼠心肌组织中的表达。方法采用RT-PCR方法观察大鼠心肌组织是否表达局部RAS的主要成分—血管紧张素转化酶(ACE)基因。结果正常大鼠心肌和肺组织均有ACEmRNA表达,其在心肌的表达水平显著低于肺组织(P<0.05)。结论揭示心肌组织本身具有独立合成ACE的能力,支持心肌组织存在局部RAS这一观点,也为ACEI应用于心血管疾病的临床治疗提供了新的理论依据。     

hVEGF165/Ang-1联合转染对兔缺血心肌血管再生的影响

目的 探讨VEGF/Ang-1基因联合转染对缺血心肌区域血管再生及血管成熟的影响.方法 建立兔心肌缺血模型,实验动物随机分为5组(每组5只):hVEGF165/Ang-1双基因联合转染组(A组),hVEGF165单基因转染组(B组),Ang-1单基因转染组(C组),单纯梗死组(D组),正常对照组(E组).冠状动脉左前降支(LAD)结扎后在缺血心肌区域直接注射的方法转染 rAAV-9HRE-hVEGF165和(或)rAAV-TRE-Tight-Ang-1;Fitc-lectin和α-SMA免疫荧光染色,观察缺血心肌区域血管新生及成熟情况.结果 与B、C、D组相比,A组Fitc-lectin和α-SMA阳性血管数量显著增多(P<0.05).结论 与单一促血管生成基因转染比较,hVEGF165/Ang-1双基因联合转染可改善兔心肌梗死区域血管再生.     

牛磺酸对大鼠缺血心肌血管新生作用的研究

目的：研究牛磺酸对大鼠缺血心肌血管新生的作用并探讨其作用机制。方法：选用健康雄性Wistar大鼠80只,随机分为4组,每组20只：缺血再灌注模型组。低、中、高剂量牛磺酸处理组。缺血再灌注模型组口服生理盐水10mL／kg,每日1次,连续7d。低、中、高剂量牛磺酸处理组牛磺酸200、400、800mg／kg,每日1次,口服给药,连续7d。采用大鼠心脏冠状动脉缺血再灌注的方法,连续监测心电图,观察牛磺酸对大鼠心肌缺血再灌注后心律失常、心肌梗死范围的影响,并观察牛磺酸对血清中血管内皮生长因子（VEGF）、低氧诱导因子-a（HIF-a）、血小板-内皮细胞粘附分子（CD34）以及心肌组织中VEGF含量的影响。结果：与对照组比较,随着牛磺酸剂量的增高可明显降低动物室性早搏（VPC）和室性心动过速（VT）的发生率,心肌梗死范围也显著减小,同时在光镜下观察各组随牛磺酸剂量的递增可促进心肌间的血管新生。牛磺酸高、中、低剂量组大鼠血清中VEGF、HIF-a、CD34与心肌中的VEGF活性明显升高（P〈0．01）。结论：牛磺酸对大鼠缺血心肌血管新生具有促进作用。     

缺血再灌注后兔心肌c-fos基因的表达

目的：研究缺血再灌注下家免心肌细胞c-fos基因的表达。方法：新西兰大白兔18只，随机分为三组：缺血15分钟再灌注0分钟组（Ⅰ组，n=6）；缺血15分钟再灌注15分钟组（11组，n=6）；缺血15分钟再灌注30分钟组（Ⅲ组，n=6），分别取缺血再灌注区域及对照区域心肌组织进行免疫组织化学检测。结果：Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组心肌细胞均有Fos阳性染色出现，三组在不同再灌注时点c-fos表达差异显著（P〈0．05），且随着再灌注时间延长阳性率逐渐增高。对照区的心肌细胞也有Fos阳性染色出现，但Fos染色率显著低于缺血再灌注区心肌（P〈0．05）。不同再灌注时点三组对照区心肌细胞c-fos表达差异显著（P〈0．05），且随着再灌注时间延长阳性率逐渐增高。结论：1．心肌缺血再灌注后显著诱导c-fos的表达；2．c-fos表达增加与心肌损伤有关；3．Fos蛋白表达有可能为早期心肌缺血再灌注辅助诊断的形态学指标。     

血管生成素-1基因重组腺病毒转染兔外周血血管内皮祖细胞的研究

目的探讨重组腺病毒介导的血管生成素-1（Ang-1）基因转染兔外周血血管内皮祖细胞（EPCs）的方法及效果。方法从兔外周血中体外分离、扩增EPCs,采用免疫组织化学和荧光化学法鉴定EPCs,设EPCs细胞对照组（EPCs）、EPCs＋Ad空病毒载体对照组（EPCs＋Ad）及EPCs＋Ad-Ang-1组（EPCs＋Ad-Ang-1）。以携带Ang-1基因的重组腺病毒转染EPCs后,用荧光显微镜下观察转染效果,RT-PCR鉴定细胞内Ang-1基因在EPCs中的转录;ELISA法检测细胞培养上清中的Ang-1蛋白表达。结果 EPCs＋Ad-Ang-1组镜下观察到大部分细胞呈现绿色荧光;RT-PCR鉴定证实EPCs细胞内的Ang-1转录;ELISA检测证实EPCs＋Ad-Ang-1组细胞上清液中Ang-1的浓度高于EPCs组和EPCs＋Ad组（均P〈0.05）。结论腺病毒介导的Ang-1基因转染外周血EPCs可行。     

复制缺陷的重组腺病毒介导的血管形成素-1基因的制备及其体外表达的研究

目的：探讨重组腺病毒载体构建及其在体外的有效转录。方法：以RT-PCR自人脾组织中克隆和筛选出血管形成素-1（Ang-1）全长cDNA，测序鉴定正确后，经salI酶切并克隆到E1、E3缺失的Ad5腺病毒载体（PAxCAwt）中，应用cosmid-TPC磷酸钙共沉淀法，将含有左向转录表达单元重组载体PAxCAwt Ang-1与DNA-末端肽复合物（TPC）-同转染293细胞中，经挑选克隆、病毒扩增、纯化、浓度滴度测定，制备了纯化病毒颗粒，以此转染人脐静脉上皮细胞（ECV304），收集转染后1-7天的细胞，用RT-PCR检测转染细胞中外源性Ang-1基因转录。结果：实验所克隆的Ang-1 DNA片段为含有信号肽结构的长度为1515bp的全长cDNA，与文献报道一致。外源基因在转染细胞中能有效转录。结论：Ad5-PAxCAwt转导的血管形成素-1基因可在体外有效表达转录。     

大鼠缺血心肌微血管内皮细胞血管新生的生物学特征

[目的]观察大鼠缺血心肌微血管内皮细胞(CMECs)血管新生的生物学特征。[方法]采用结扎法建立大鼠心肌缺血模型,植块法培养CMECs,倒置相差显微镜观察细胞形态学特征,免疫细胞化学法检测CMECs特异性抗原。实验分组将大鼠缺血CMECs作为缺血组(I组),正常大鼠CMECs作为对照组(N组),采用噻唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线并检测细胞增殖能力,划痕法测定细胞迁移能力,倒置相差显微镜观察管腔结构形成情况。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测细胞增殖相关蛋白激酶(ERK)和细胞死亡相关分子(p53)mRNA的表达情况。[结果]大鼠CMECs具备典型微血管内皮细胞特征,Ⅷ因子、CD31相关抗原免疫染色鉴定均为阳性。N组和I组迁移窗口期均为第1天,成管窗口期均为第2天,N组和I组的增殖窗口期分别为第3天、第6天。两组比较,I组迁移率、增殖率和成管率均低于N组,以迁移率降低最为明显(P0.01)。I组ERK、p53 mRNA表达均高于N组(P0.05)。[结论]缺血CMECs的血管新生能力明显降低,血管新生增殖窗口期改变,可能与ERK和p53mRNA表达的变化有关,为进一步研究其基因组学及药物干预提供实验依据。     

血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥厚的作用及其机理探讨

本研究在新生大鼠原代培养心肌细胞上，观察血管紧张素Ⅱ对心肌细胞蛋白含量和ＭＨＣ基因表达的影响。实验结果如下：（１）ＡｎｇⅡ不影响民肌细胞数目。ＡｎｇⅡ增加心肌细胞总蛋白含量和每个心肌细胞蛋白质含量。且在１０＾－９Ｍ－１０＾－５Ｍ范围内呈明显剂量依赖关系，在１０＾－６Ｍ时达最大效应，ＡｎｇⅡ受全阻断剂Ｓａｒａｌａｓｉｎ不影响心肌细胞数目和蛋白质含量，但能阻断ＡｎｇⅡ促进蛋白质合成的作用。（２）在培养     

膀胱移植细胞癌新生血管形成的基因分子调控

膀胱移行细胞癌（BTCC）的生长和转移依赖于肿瘤细胞中新生血管网络系统形成，其决定于在行定微环境中某些血管生成诱导因子和抑制因子之间的平衡。本主要对血管生成诱导因子，抑制因子及癌基因的表达水平对BTCC新生血管形成调控做一简述。     

大鼠心肌缺血的血管内皮生长因子基因治疗

目的：应用血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ, ＶＥＧＦ） 基因治疗心肌缺血。方法：雄性Ｗｉｓｔａｒ 大鼠２０ 只,结扎冠状动脉前降支造成心肌梗死模型。心脏多点注射构建的ｐｃＤ２／ＶＥＧＦ真核表达质粒。应用逆转录聚合酶链反应,ＶＥＧＦ免疫组织化学染色,心肌碱性磷酸酶染色及血管计数等方法检测ＶＥＧＦ 基因在缺血心肌中的表达及生物学作用。结果：转移ＶＥＧＦ基因后在大鼠缺血心肌中有ＶＥＧＦｍＲＮＡ 高表达, ＶＥＧＦ 免疫组化染色可见ＶＥＧＦ蛋白表达水平升高。心肌碱性磷酸酶染色显示,转移ＶＥＧＦ基因能够促进缺血心肌新生血管的形成。结论：ＶＥＧＦ基因能够在大鼠缺血心肌中获得表达,并发挥其促进新血管形成的作用。为ＶＥＧＦ 基因治疗心肌缺血奠定基础。     

纳米粒子介导血管内皮生长因子基因治疗兔心肌缺血的疗效

目的观察纳米粒子介导血管内皮生长因子(VEGF)基因转染的可行性,了解心肌缺血动物模型经心肌直接注射VEGF基因纳米粒子后新生血管以及心功能改善情况。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)包载VEGF165基因质粒,制备纳米级粒子混合物,检测其载药量、体外释放情况及粒径;培养乳鼠心肌细胞,转染VEGF165基因纳米粒子(VEGF纳米粒子),应用RT-PCR法检测VEGF mRNA水平,ELISA法检测VEGF蛋白表达水平;将VEGF纳米粒子悬浮液注射至活体家兔心肌内,96h后心肌注射部位取材,电镜观察其向心肌组织内传递基因的可行性;建造兔心肌缺血模型,分别将VEGF纳米粒子(12只)、VEGF165裸质粒(12只)或生理盐水(对照组,8只)注射至缺血部位心肌,1个月后心脏超声监测,然后处死,组织学切片观察心肌组织中毛细血管生成情况。结果制备的纳米粒子载药量为1·87%,粒径为50~300nm;RT-PCR和ELISA结果提示纳米粒子可将目的基因转移至培养的心肌细胞中;体内实验显示心肌细胞胞质内及胞核内可见大量被吞噬的纳米粒子;术后1个月超声检查显示,VEGF纳米粒子组室壁运动幅度(1·87mm±0·32mm)、左室射血分数(60%±10%)较裸质粒组(1·59mm±0·24mm,50%±6%)及对照组(0·93mm±0·40mm,40%±8%)改善更加明显,各组之间差异均有统计学意义(均P<0·05);组织学检查显示,在100倍光镜视野下心肌内毛细血管数VEGF纳米粒子组(57个±12个)明显高于裸质粒组(41个±14个)及对照组(24个±8个),各组之间差异有统计学意义(均P<0·05)。结论纳米粒子可作为VEGF基因向心肌组织转运的载体,在兔心肌缺血模型经心肌直接注射VEGF165基因纳米粒子,能够促进心肌内毛细血管新生,达到改善心功能的目的。     

血管内皮生长因子对小型猪心肌血管生成作用的研究

目的：检测血管内皮生长因子165（VEGF16）能否促进冠状动脉侧枝血管形成并改善心肌局部灌注与功能。方法：小型猪做成慢性心肌缺血模型后,将以腺病毒为载体的重组人VEGF165互补脱氧核糖核酸[(cD-NA)Ad-VEGF165]或β-半乳糖酶cDNA直接注入冠状动脉回旋支分布的心肌内,以心电图门控单光子发射计算机断层摄影术（SPECT）和离体心脏冠状动脉造影（CAG）检测冠状动脉侧枝生成、心肌灌注及功能变化。结果：与对照组和自身用药前SPECT检查相比。Ad-VEGF165治疗后心肌缺血面积（P＜0．01）和最大缺血程度（P＜0．01）明显减小左心室射血分数（P＜0．01）和LCX区局部室壁运动（P＜0．05）明显改善,离体心脏CAG采用Rentrop分级示治疗组侧枝血管生成明显多于对照组（P＜0．05）。结论：Av-VEGF165能诱导心肌侧枝血管形成并改善心肌灌注与运动功能。     

酸性成纤维细胞生长因子基因转染猪慢性缺血心肌促进侧支血管的增生

目的：探讨人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)基因重组腺病毒载体（Ad.aFGF)转染缺血心肌后促进侧支血管增生的作用。方法：实验用小型猪开胸于左冠回旋支（Lcx)放置Ameroid环，4周后，将Ad.aFGF(n=7)、Ad.Null(n=6)、PBS（n=6)直接注射到Lcx供血区域，每只10点，每点10^9pfu或100μl；4周后心脏超声检测局部心功能的改善，体外冠状动脉造影观察侧支血管的增生，注射点心肌Ⅷ因子免疫组化染色检测心肌中的新生血管。结果：冠状动脉造影显示Ad.aFGF组较其他两组心肌中有明显的侧支血管增生，局部室壁功能显著提高；Ⅷ因子免疫组化染色显示Ad.aFGF组心肌中新生血管的密度显著高于另两组（P＜0.01)。结论：Ad.aFGF转染慢性缺血心肌后可促进侧支血管增生，可以成为治疗缺血性心脏病的有效途径。     

阈下电刺激促大鼠缺血心肌毛细血管新生的研究

目的：探讨不同频率的阈下电刺激促缺血心肌毛细血管新生的作用及其发生机制。方法：给心肌梗死大鼠发放不同频率的阈下电刺激，观察缺血心肌中毛细血管新生情况，以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达、一氧化氮合酶(NOS)活性的变化。结果：(1)25Hz频率的阈下电刺激组，大鼠缺血心肌中毛细血管密度、VHGF mRNA及蛋白质表达、NOS活性均比其它电刺激组及对照组增加。(2)25Hz频率阈下电刺激基础上加用VEGF中和抗体干预后，大鼠缺血心肌毛细血管密度明显减少，NOS活性降低。(3)25Hz频率阈下电刺激基础上加用NOS抑制剂L-NAME干预后，大鼠缺血心肌中VEGF mRNA及蛋白质表达没有改变，但毛细血管密度显著减少。结论：25Hz频率的阈下电刺激可以促进缺血心肌中VEGF表达的上调，导致毛细血管新生；NO可能介导VEGF促血管内皮细胞增殖作用。     

腺病毒介导的可溶性Ⅰ型补体受体基因转染对急性心肌缺血的保护作用的实验研究

目的:探讨腺病毒介导的可溶性Ⅰ型补体受体(soluble complement receptor type 1,sCR1) 基因转染对急性心肌缺血的保护作用.方法:开胸阻断小鼠左冠状动脉前降支起始部30 min后开放,实验组(14只)在开放冠状动脉前5 min于缺血区注射携带sCR1和LacZ的混合腺病毒液(100 μl,1010噬斑形成单位);对照组(13只)注射LacZ腺病毒液(100 μl,1010噬斑形成单位).术后2周时利用超声心动图检查心功能,并于检查后立即取标本行病理检查.结果:术后2周时,各项超声指标实验组都明显优于对照组(P<0.05);尤其是反映梗死范围大小的梗死范围率,差异非常显著(P<0.01).病理检查见实验组动物心肌梗死区域小于对照组,H-E染色显示实验组注射sCR1腺病毒的范围内存活心肌细胞明显多于对照组.结论:缺血心肌再灌注前注射sCR1腺病毒可以明显减小梗死范围,提高远期心脏功能.     

辛伐他汀对兔慢性缺血心肌血管新生及VEGF 表达的影响倡

目的 研究辛伐他汀对慢性缺血心肌血管新生的促进作用.方法 雄性新西兰大白兔36 只,随机化分为3 组：对照组、模型组、辛伐他汀治疗组.对照组仅进行开胸手术;模型组在左冠状动脉回旋支上放置Ameroid 缩窄环,复制慢性心肌缺血模型;辛伐他汀治疗组为左冠状动脉回旋支上放置Ameroid 缩窄环后,每日1 次给予辛伐他汀灌胃,用量为3 mg/kg,共21d.以Ⅷ因子相关抗原的抗体进行免疫组化染色,计数毛细血管数目及毛细血管密度（毛细血管数/mm2 ）.免疫组化法测定缺血心肌中VEGF 的表达.结果 辛伐他汀治疗组毛细血管密度显著高于模型组;辛伐他汀治疗组慢性缺血心肌中VEGF 的表达量显著高于模型组.结论 辛伐他汀可促进慢性缺血心肌中血管的新生,其机制可能与其增加慢性缺血心肌中VEGF 的表达相关.     

腺病毒介导的HIF-1α基因对缺血心肌作用机制的初步探讨

目的:研究腺病毒介导的低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因转染入兔急性心肌梗死(AMI)边缘区缺血心肌后,HIF-1α、细胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)的蛋白表达情况,初步探讨HIF-1α的作用机制.方法:建立兔AMI模型,随机分为4组,分别于心肌内注入腺病毒介导的HIF-1α基因(Ad-HIF-1α)、不含HIF-1α基因腺病毒颗粒(Ad-Blank)、HIF-1α核酶基因(Rz-HIF-1α),假手术组为对照,免疫组化和免疫印迹(Western blot)方法检测HIF-1α、ERK及P-ERK的蛋白表达.结果:AMI后1天外源性HIF-1α蛋白及p-ERK蛋白表达开始升高,7天达高峰,14、28天逐渐下降,56天时外源性HIF-1α蛋白及p-ERK蛋白均无表达,ERK在各时间点均有表达.在各组中,ERK含量基本无差异,p-ERK的蛋白含量在Ad-Blank组较Sham组升高,较Ad-HIF-1α组降低,Rz-HIF-1α组最低.结论:腺病毒介导的HIF-1α基因在缺血心肌能够有效表达,并能促进ERK的磷酸化,HIF-1α核酶基因能有效阻断缺血心肌HIF-1α的保护作用.     

小干扰RNA沉默MAT1基因治疗胰腺癌的实验研究

目的了解体外转录法合成的小干扰RNA（siRNA）沉默MAT1基因对胰腺癌的体内体外抗癌效应。方法用siPORT-脂质体（1ipid）中性阳离子脂质体转染由体外转录法合成、Cy3荧光标记的双链siRNA人胰腺癌BxPC3细胞,观察对胰腺癌细胞生长和细胞周期曲线的影响,检测MAT1基因被siRNA沉默后mRNA和蛋白质的表达水平。在裸鼠胰腺癌皮下移植瘤瘤体内直接注射siRNA观察抑瘤效应。结果合成的4条MAT1-siRNA序列中有一半可显著抑制BxPC3细胞的生长。体外转染MAT1-siRNA72h后,BxPC3细胞生长抑制率达34．9％（P〈0．01）;83．9％的BxPC3细胞滞留于G。／G,期,而空白对照组仅59．86％（P〈0．01）。体外转染MAT1-siRNA48h后MAT1-mRNA水平下调了80．12％,72h后MAT1蛋白质水平下调了50．12％,与各对照组相比差异均有统计学意义（均P〈0．01）。MAT1-siRNA注射组裸鼠移植瘤重量和体积均明显低于对照组（均P〈0．05）,抑瘤率达42．53％。结论siRNA介导的MAT1基因沉默在体外实验中显著抑制了胰腺癌细胞的生长,在体内实验中对裸鼠胰腺癌皮下移植瘤产生明显的抑瘤效应。